الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

دوبامين الدماغ المتوسط ​​الابتدائي الثقافات الخلية فصلها تسمح لدراسة خصائص الخلايا العصبية من قبل المشبكي الدوبامين. يمكن استخدامها لرصد الوقت الحقيقي الحركية الإفراج الدوبامين والبروتين / مرنا مستويات الدوبامين إيماس من المنظمين. هنا ، ونحن تبين لكم كيف تولد هذه الثقافات من الولدان القوارض.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

القدرة على خلق ثقافات الخلية الأولية الدوبامين من الخلايا العصبية يسمح لدراسة خصائص الخلايا العصبية من قبل المشبكي الدوبامين في عزلة عن غيرها من المدخلات المنهجية في الدماغ. في المختبر ، ونحن نستخدم هذه الخلايا العصبية الحركية لتقييم إطلاق الدوبامين باستخدام الكربون amperometry الألياف ، فضلا عن مستويات التعبير عن الجينات والبروتينات ذات الصلة الدوبامين باستخدام PCR الكمي وكيمياء سيتولوجية مناعية. في هذا الفيديو ، ونحن تبين لكم كيف تولد هذه الثقافات من الولدان القوارض.

وتنطوي العملية على عدة خطوات ، بما في ذلك الطلاء من الخلايا النجمية الدبقية القشرية ، وتكييف وسائل الإعلام للثقافة العصبية خلية الركيزة الدبقية ، وتشريح الدماغ المتوسط ​​في حديثي الولادة ، والهضم ، واستخراج والطلاء الدوبامين من الخلايا العصبية وإضافة إلى عوامل عصبية ضمان بقاء الخلية.

التطبيقات المناسبة لإعداد مثل هذه تشمل الكهربية ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، PCR الكمي ، المجهري الفيديو (أي من الانصهار حويصلي في الوقت الحقيقي مع غشاء البلازما) ، وبقاء الخلية المقايسات شاشات السمية الأخرى.

Protocol

إعداد يسبق الثقافة

ملاحظة : يجب أن يكون مطلي ** الخلايا الدبقية في وقت مبكر بحيث يكون لديهم الوقت لتتكاثر وتغطية الجزء السفلي من الأطباق. بالنسبة للفئران مع الخلفية الوراثية شاذة أو التجريبية ، للتأكد من تطابق الثقافات الدبقية والخلايا العصبية من حيث التركيب الوراثي.

ملاحظة : ** 1-7 أيام قبل التشريح ، وإعداد المتوسطة الخلايا العصبية الجديدة واستبدال المتوسطة الدبقية في الأطباق مع 2ml.

ملاحظة : ** وفي اليوم قبل التشريح ، البنود التالية تحتاج إلى اليسار بين عشية وضحاها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية :

  • تشريح لوحات 4
  • 2 قنينة تفارق مع قضيب تحريك مغناطيسي الصغرى
  • قبعات القارورة 2 (مع 2 مطعون ثقوب صغيرة في أعلى الصفحة)
  • انتشرت حلقات الانزلاق (ومعطف في EtOH 70 ٪) -- ترك مربع أيضا فتح
  • على الأقل 2 مربعات كاملة من نصائح ماصة الصفراء (10 200μl)
  • 1 مربع من اللون الأزرق (100 1000μl) ماصة نصائح

يوم الثقافة

ملاحظة : * تأكد من عدم لمس أي شيء استبعد الأشعة فوق البنفسجية ليلة وضحاها!

الحفاظ على بيئة معقمة تحت غطاء محرك السيارة مهم جدا.

1) إعداد :

ملاحظة : ** جانبا جميع المكونات المجمدة لجعل الحل غراء.

  1. نظيف مع ملقط EtOH 70 ٪. تغطية كل طرف مع طرف الماصة الصفراء العقيمة. استخدام لوضع خواتم الشريحة العقيمة في مربع بهم.
  2. صفيحة ساخنة :
    1. وضع لوحة تحت غطاء محرك السيارة mini-magnetic/hot مع ملء كوب 1000ml 500 - 600ml O 2 درهم واسعة شريط مغناطيسي.
    2. مكان قرص الستايروفوم في الدورق فقط فوق مستوى الماء.
    3. الشريحة ميزان الحرارة في حفرة صغيرة في القرص الستايروفوم. طلب الحرارة يجب أن يكون أعلى قليلا من 2 (لدرجة الحرارة درجة مئوية 34) ويحرك الطلب ينبغي ~ 5-6.
  3. برنامج تلفزيوني :
    1. إعداد برنامج تلفزيوني العقيمة وملء أنابيب 15ml 15 العقيمة مع مل 4-6 (تأكد للحفاظ على العقيمة
      تقنية).
    2. وضع أنابيب وزجاجة الأسهم على الجليد بجانب غطاء محرك السيارة.
  4. كربوجين :
    1. كسر في نصف stripette 5ml ودفعها من خلال سدادة مطاطية ، لذلك غيض من stripette هو تخرج في نهاية اسعة من السدادة.
    2. وضع سدادة في دورق مع 500ml 500ml 400 - O 2 درهم (النهاية من كسر stripette يجب أن تكون في O 2 درهم).
    3. توصيل أنبوب بشأن فتح جانب من القارورة.
    4. قطع رأس قبالة الطرف ماصة الأصفر وتوصيل هذا إلى نهاية الأنبوب (مع الجانب قطع يواجه الخروج).

      ربط خزان كربوجين إلى غيض من stripette 5ml.

  5. إعداد غراء sol'n :
    1. * استخدم أسلوب عقيم حذرا.
    2. المزيج في أنبوب 50ml العقيمة.
  6. تصفية غراء sol'n في قارورة تفارق :
    1. استخدام وحدة الترشيح Steriflip ونقل إلى قارورة تفارق عبر stripette 25ml (أو مكان جديد تصفية حقنة 0.2μm على طرف حقنة 20ml المكبس ،
      إزالة المكبس واستخدام stripette (25mL) لنقل كل من sol'n غراء في المحاقن.
    2. تصفية في قارورة تفارق).
    3. غطاء القنينة ، أدخل محقنة معقمة من خلال ثقب في الغطاء وإرفاق تصفية حقنة معقمة 0.2μm إلى قاعدة الحقنة.
    4. توصيل كربوجين إلى تصفية وparafilm في هذا المكان. مكان القنينة في الستايروفوم القرص / حامل.

      * يجب أن بقضيب الدقيقة المغناطيسية سوف تتحرك.
      * يجب أن يكون والغاز مما يجعلها في القارورة.
      * يجب أن يستقر عند درجة حرارة 34 درجة مئوية.

  7. تشريح الإعدادية :
    1. اعادة تشريح المجهر تحت غطاء محرك السيارة.
    2. وضع جميع الصكوك تشريح على رقائق الألومنيوم ، مع رش EtOH 70 ٪ ، من أجل إيقاف الزائدة وترك تحت غطاء محرك السيارة لتجف.
  8. إعداد المتوسطة العصبية :
    1. ترك 30ml المتوسط ​​العصبية الطازجة في الحاضنة.
  9. وضع 1 مربع كبير من رقائق الألومنيوم ، و 12 مربعات صغيرة. مغادرة مقص قطع الرأس مع رقائق الألومنيوم. ملء مربع الستايروفوم صغيرة مع الماء المثلج وترك كل خارج غطاء محرك السيارة.
  10. الإعدادية للتخدير (الكيتامين 0.075ml وxzylazine 0.075ml).
  11. الحصول على ما لا يقل عن 12 الجراء (P0 - P2) لمدة 100 لوحات. بالنسبة للفئران ، تأكد من وجود مباراة في التركيب الوراثي للالقمامة بأكمله. إذا كان النمط الجيني غير معروف ، لوحة من كل الخلايا الجرو على طبق منفصل ، والحفاظ على سجلات دقيقة لأعداد الماوس ومطابقتها مع أطباق خلية ثقافة والتأكد من الخلفية الجينية للالركيزة الدبقية هو موحد عبر الثقافات الخلية.

2) تشريح

  1. تخدير الحيوانات الأول مع حقن داخل الصفاق. عندما يظهر التخدير والحيوان لا يستجيب لاختبار الذيل نفض الغبار ؛ وضعه في الثلج لمدة 30 ثانية (حتى تبريدي). شطف one رقائق الألومنيوم مربع صغير ، decapمقص itation ، والرأس مع EtOH 70 ٪.
  2. قطع رأس ، والسماح لرأس مربع تقع على رقائق الألومنيوم وتتحرك تحت غطاء محرك السيارة. إزالة بلطف الدماغ في أنبوب 15ml من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. وضع أنبوب مرة أخرى على الجليد بينما يزيل المخ المقبل.
  3. كرر هذه الخطوات الأولى وحتى هناك 3 العقول على الجليد. صب جميع العقول (3) وبرنامج تلفزيوني على طبق تشريح الأول تحت المجهر. إزالة الجزء المناسب من الدماغ (VTA) واستخدام الماصة نقل لوضع شرائح في sol'n غراء. بدء الموقت عندما تذهب فيها شرائح first
  4. كرر الخطوات السابقة 3 حتى يتم هضم جميع العقول في غراء. وينبغي أن متوسط ​​الوقت لهضم هو 2 ساعة. وسيكون قد تم شرائح لأول مرة في حوالي 1 ساعة من الوقت الذي يذهب فيه منها مشاركة

    محاولة تقسيم الفرق.

  5. * أثناء عملية الهضم :
    1. تأكد من أن درجة الحرارة في الحمام هي 34 درجة مئوية.
    2. قد شرائح التمسك بقضيب في البداية ، ولكن ينبغي أن تنتشر مع مرور الوقت. اذا لم يفعلوا ذلك ، اضغط على الجزء السفلي من القارورة.

3) سحن :

  1. باستخدام ماصة نقل ، ونقل شرائح الدماغ لأنبوب 15ml العقيمة (في محاولة لتجنب زيادة sol'n غراء) وغسلها 3 مرات مع 2ml المتوسطة الدبقية تحسنت من الحاضنة. بعد وضع وسائل الإعلام الدبقية في الأنبوب ، والسماح لتسوية شرائح ثم إزالة بعناية كما sol'n أكبر قدر ممكن من دون إزعاج القطع. تغيير ماصات لتجنب التلوث!

    ** لا تبقي على sol'n التي يتم إزالتها.

  2. باستخدام ماصة نقل جديدة تبدأ في triturations 2ml من وسائل الإعلام الدبقية. متمزج 25 مرة (تجنب ترك في فقاعات الهواء) والسماح للأنبوب الجلوس لمدة 3 دقائق حتى شرائح undissociated تسوية. استخدام ماصة لإزالة ونقل KEEP sol'n أكبر قدر ممكن من دون إزعاج شرائح في القاع. إبقاء طاف في أنبوب (العقيمة) 15M جديدة.
  3. كرر الخطوة السابقة باستخدام ماصة 1000μl وماصة 200μl حتى ينفصل تماما.
  4. متمزج 10 مرات مع ماصة نقل ، أو حتى يتم معلق تماما الخلايا في sol'n.

خلايا التصفيحات 4)

  1. باستخدام ماصة معقمة غيض الصفراء التي تغطي كل غيض من ملقط ، أنزل بعناية حلقة الشريحة كما تركز على الزجاج وكذلك ممكن داخل كل طبق.
  2. وضع 10μl من الحل الخلية على عدادة الكريات والعد. (استبعاد الجماهير غير المرغوب فيه).
  3. مضاعفة عدد الخلايا بنسبة 10. هذا هو عدد الخلايا / ميكرولتر. 1،000،000-1،500،000 الفجوة (أو الكثافة المطلوب) من هذا العدد. هذا هو عدد ميكرولتر إضافة لكل طبق.
  4. استخدام غيض ماصة لحلقات الانزلاق على البئر في وسط كل طبق وقمت بإضافة ميكرولتر المناسبة / الطبق. لوحة التبديل منهم بلطف ونصائح عن كل طبق.
  5. إضافة 100μl (من المخفف) GDNF sol'n داخل حلقة الانزلاق في كل طبق.
  6. في هذا الوقت ، وضع الصواني في الحاضنة وتقديم المتوسطة العصبية في غرفة باردة.
  7. يسمح للخلايا لتسوية بين عشية وضحاها.
  8. في اليوم التالي : حلقات إزالة (باستخدام ماصة معقمة جديدة نصائح تغطي نصائح ملقط لكل طبق)

5) تثبيط الإنقسامية : في اليوم التالي

  1. تمييع aliquots FDU 1:10 من الأسهم 1000X بإضافة 200μl FDU الأسهم إلى 1.8 مل MEM العقيمة.
  2. إضافة 20μl المخفف FDU sol'n الى الحلبة خارج كل طبق. تغيير ماصة نصائح كثير من الأحيان. تغطية والعودة إلى الحاضنة.

    * الإزعاج الأطباق أقل قدر ممكن خلال الايام القادمة 70-10. تحقق من وجود الأطباق المصابين وإزالة أي أطباق المصابة في البوادر الأولى للعدوى. ثقافات مستعدون للاختبار في غضون 3 أسابيع.

MEDIA / SOLUTIONS

العصبية متوسطة

(ل200mL)

** أفضل إذا كان مشروطا من قوارير الدبقية بين عشية وضحاها قبل استخدامها ليغسل / سحن

عنصر مبلغ تلاحظ
BSA 5 ٪ 0.5 غرام جزء الخامس
MEM السائل 94.0 مل سيغما
DMEM السائل 80.0 مل سيغما
F - 12 السائل 20.0 مل سيغما
السائل الجلوكوز 45 ٪ 1.50 مل سيغما الحل
الجلوتامين 200MM 0.5 مل Aliquotted سيغما الحل
Diporzio اضرب. 2.0 مل سيغما الحل
السائل كتالاز 0.1 مل
Kynurenic حمض 0.5M 200μl في 1N هيدروكسيد الصوديوم
HCL 5N 50 ميكرولتر

  1. الجمع بين المكونات (BSA يذهب السابق) في 250mلتر زجاجة بلاستيكية.
  2. التصفية ، والتسمية ، والثلاجة.

Kynurenic حمض
(FW = 189.2)
0.5M = 94.6mg/ml
جعل الأسهم 8ml : 756.8mgKA/8ml 1N هيدروكسيد الصوديوم وماصة في aliquots العقيمة 200μl



DiPorzio الإعلام

أ) DiPorzio اضرب. الأسهم :

NEED ضم Alliquot
المضافة مذيب أنبوب مبلغ مل مل / أنبوب اضرب. مبلغ # عليق.
الأنسولين 20mM HCL (1) البلاستيك 250mg زجاجة 10 1 25mg/ml 25mg 10
ترانسفيرين وهانك 500mg زجاجة 5 1 100mg/ml 100mg 5
SOD وهانك 70mg زجاجة 14 1 5mg/ml 5mg 14
بوتريسين وهانك 50mg 3 0.12 20mg/ml 2.4mg 21
غ 2 3 سيو وهانك 0.104mg 10 0.5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10MM هيدروكسيد الصوديوم 2mg 10 0.1 0.20mg/ml 0mg 100
البروجسترون 100 ٪ EtOH زجاج 12.5mg 10 0.05 1.25mg/ml استخدام الماصة
الكورتيزول 100 ٪ EtOH زجاج 20mg 10 0.02 2.00mg / مل استخدام الماصة

  1. 20mM حمض الهيدروكلوريك = 41.5μl اضرب. HCl/25ml.
  2. جعل الأسهم 1mg/ml وإضافة إلى 104μl 10ML.



B) DiPorzio الإعلام المتوفرة :

المضافة المبلغ (مل) المبلغ (مل) X2 اضرب النهائي. ميكروغرام / مل اضرب النهائي. Molarity
البروجسترون 0.05 0.1 0.06 200nM
الكورتيزول 0.02 0.04 0.04 125nM
هانك وBSS 6.21 12.42
الأنسولين 1 2 25
غ 2 3 سيو 0.5 1 0.01 30nM
T3 0.1 0.2 0.02 30nM
SOD 1 2 5
بوتريسين 0.12 0.24 2.4 15nM
ترانسفيرين 1 2 100

  1. استخدام أنبوب polyproylene 15ml العقيمة لإضافة هرمون البروجسترون ، والكورتيزول. استخدام الماصة الشافطة والفراغ إلى سرعة تبخر EtOH : (استخدام stripette 5ml كسر في مكان ونصف في منتصف الطريق إلى أسفل داخل أنبوب يجري حريصا جدا على ألا نضح EtOH السائل امسك الماصة في مكان آمن مع Kimwipes ثم جعل الحافة. وصولا الى علامة 500μl يقع على جانب الأنبوب.
  2. إضافة aliquots اللاحقة في ترتيب ظهورها على الرسم البياني أعلاه.
  3. بعد إضافة الأنسولين ، الأمر الذي يجعل غائم sol'n ، إضافة 20μl من هيدروكسيد الصوديوم 1N لتحييد الحموضة. وينبغي أن تذهب Sol'n من الأصفر إلى الوردي واضحة على الفور. أيضا ، بعد إضافة ترانسفيرين ، إضافة 20μl فورا من هيدروكسيد الصوديوم 1N ، لتحييد الحموضة ومنع تكوين الرواسب.
  4. وضع 10ML الى الماصة المصلية وتقسيمها إلى 5 aliquots (دفعة واحدة).
  5. @ تخزين -20 درجة مئوية.
  6. 2 قد تجعل دفعات في وقت واحد.

تفارق وسائل الإعلام

ألف غراء (ل1 فيال) :

** تحضير يوم طلي الحق قبل تشريح.

عنصر المبلغ </ قوي> (الملاحظات) اضرب النهائي.
السيستين المياه 7.8mL 1MM السيستين
غراء يختلف (* 190μl للزجاجة
44.0mg/ml)
20 وحدة / مل (400 وحدة إجمالي
لتبلغ قيمتها 20ml من sol'n)
H & B اضرب. 2mL
كربوجين 95 ٪ + O2 CO2 5 ٪
حمض الهيدروكلوريك 5N 10μl
أحمر الفينول 0.5 ٪ 20μl 0.001 ٪
Kynurenate 0.5M 10μl (في 1N هيدروكسيد الصوديوم) 0.5mM

  1. غراء إضافة إلى الماء السيستين الأولى.
  2. إضافة اضرب H & B. ، kynurenate ، حمض الهيدروكلوريك ، وأحمر الفينول.
  3. تصفية في قارورة تفارق (كما هو موضح في الاتجاهات المحددة متابعة) والاتصال كربوجين.


B. H & B مركزة (100ML من 5X) :

المكونات ميغاواط Powder/50ml H 2 O اضرب. (M) الجمع بين (مل) اضرب النهائي. (ملم)
كلوريد الصوديوم 58.44 11.699 ز 4 14.5 116
بوكل 74.56 3،728 ز 1 2.7 5.4
NaHCO 3 84.01 4.2 غرام 1 13 26
ناه 2 ص 4 * H 2 O 137.99 6.90 ز 1 1 2
MgSO 4 120.38 6،019 ز 1 0.5 1
EDTA (ED2 - SS)
292 سيغما 5 ٪ (جعل
5g/100ml الأسهم)
0،134 0.3722 0.5
جلوكوز 180 سيغما 45 ٪ 2.5 5 25
TC H 2 O 62.93

  1. تجمع كميات المخزون من الحلول.
  2. الفجوة في aliquots 4ml.
  3. إضافة إلى المياه قسامة السيستين بعد إضافة غراء.

جيم المياه سيستين (157.5ml من 1X) :

المكونات ميغاواط مكونات
مسحوق (ملغ)
H 2 O (مل) اضرب الأسهم (ملم) الجمع بين (مل) اضرب النهائي. (ملم)
CaCl 2 147.2 736 10 500 0.6 1.9mM
السيستين 121.7 (1.5) 24 20mM (0.02M) 10 1.27mM
(0.88)
TC المياه 146.9

  1. جعل والحفاظ على المخزون من sol'n CaCl2 0.5M عند 4 درجة مئوية
  2. جعل sol'n استخدام واحدة من السيستين وتتحد مع غيرها من المكونات
  3. تقسيمها إلى 10 aliquots من 15.75 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية


إعداد GDNF

  1. قسامة الإعدادية :
    1. حل عقيم ، مجفف بالتجميد من بيليه GDNF 5μg مع 2.4mL من الماء منزوع الأيونات معقمة. تركيز هذا 2.08μg/mL GDNF = sol'n.
    2. توزيع GDNF 2.08μg/mL sol'n في 76.9μl aliquots في cryovials العقيمة. هذا 160ng = في القارورة.
    3. المحل في -20 درجة مئوية.
  2. بالإضافة إلى الثقافات :
    1. أذاب 1 قسامة لكل أطباق 8.
    2. تمييع قسامة بإضافة 723.1μl العصبية وسائل الاعلام / قسامة. وهذا جعل من sol'n GDNF 160ng/800μl.
    3. إضافة 100μl هذا sol'n إلى 2mL المتوسطة في كل طبق لتركيز النهائي من GDNF 10ng لكل مليلتر.


إعداد FDU

FDU - 1000X sol'n ألبوم :

عنصر مبلغ (الملاحظات) اضرب النهائي.
يوريدين 247 ملغ 16.5 ملغ / مل
5 - FDU (5 - fluorodeoxyuridine) 100 ملغ (زجاجة) 6.7 ملغ / مل
TC المياه 15 مل

  1. جعل ما يزيد قليلا على 15 مل من يوريدين ملغ / مل 16.5.
  2. إضافة 15 مل يوريدين sol'n إلى 100 ملغ من زجاجة FDU جعل 6،7 ملغ / مل FDU sol'n.
  3. الفجوة في aliquots 200μl وتجميد -20 درجة مئوية.

تمييع للاستخدام :

  1. تمنع نمو الخلايا العصبية غير الخلايا. 01:10 تمييع الأسهم 1000X بإضافة الأسهم 200μl إلى MEM مل 1.8.
  2. إضافة 20μl FDU المخفف الى الحلبة خارج كل طبق. تغيير نصائح الماصة في كثير من الأحيان. تغطية والعودة إلى الحاضنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفت وسائل تسمح للقرار هنا غرامة من الميزات المورفولوجية والكيميائية العصبية الدوبامين من الخلايا العصبية المركزية التي هي على خلاف ذلك غير متوفرة في نهج النظامية أو في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

وكان يؤيد العمل DK065872 (ENP) ، ومؤسسة عائلة سميث جائزة التميز في البحوث الطبية الحيوية (ENP) ، F31 DA023760 (BMG ، ENP) وP30 NS047243 (تافتس مركز أبحاث العلوم العصبية).

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics