Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

İlköğretim ayrışmış orta beyin dopamin hücre kültürleri dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için izin verir. Onlar gerçek zamanlı dopamin salınımını kinetik ve dopamin ekzositoz düzenleyicilerin protein / mRNA seviyeleri izlemek için kullanılabilir. Burada, biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin nasıl oluşturmak göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Beyin başka sistemik girişi, izolasyon dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için, dopamin nöronlar primer hücre kültürleri oluşturma yeteneği sağlar. Bizim laboratuvarda, karbon fiber amperometri, kantitatif PCR ve immünhistokimya kullanarak dopamin ilgili genler ve proteinlerin ekspresyon düzeyleri yanı sıra dopamin salınımını kinetiğini değerlendirmek için bu nöronların kullanın. Biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin üretmek nasıl Bu videoda, size gösteriyor.

Bu süreç kortikal glial astrositler kaplama, klima glial substrat nöronal hücre kültür ortamı, yenidoğanlarda Ortabeyin diseksiyonu, sindirim, ekstraksiyon ve dopamin nöronlarının kaplama ve nörotrofik faktörlerin eklenmesi de dahil olmak üzere birkaç adım içerir hücre sağkalım sağlamak.

Böyle bir hazırlık için uygun uygulamalar elektrofizyoloji, immünhistokimya, kantitatif PCR, video mikroskobu (yani, plazma zarı ile gerçek-zamanlı veziküler füzyon), hücre canlılığı deneyleri ve diğer toksikolojik ekranları içerir.

Protocol

Kültür Önceki Hazırlık

Not: ** Glial hücreler çoğalmalı ve yemekleri alt kapağı var, böylece önceden iyi kaplanmış olmalıdır. , Atipik ya da deneysel genetik bir arka plan ile fareler için, genotip açısından glial ve nöronal kültürlerin maç emin olun.

Not: diseksiyonu ** 1-7 gün önce, taze nöronal orta hazırlamak ve 2ml yemekler glial orta yerine.

Not: ** diseksiyon bir gün önce, aşağıdaki öğeleri gecede UV ışık altında sol gerekir:

  • 4 diseksiyonu plakalar
  • Bir mikro-manyetik karıştırıcı ile 2 disosiasyon şişeleri
  • 2 flakon kapaklar (2 küçük delikler üst dürttü)
  • Slayt halkalar (70% EtOH kat) Spread - kutusu da açık bırakın
  • EN AZ 2 tam kutu sarı (10-200μl) pipet uçları
  • 1 kutu (100-1000μl) mavi pipet uçları

Kültür Günü

Not: * GECELİK UV İÇİN dışında kaldı ANYTHING TOUCH İÇİN EMİN OLUN!

Kaputun altında steril bir ortamda bakımı çok önemlidir.

1) Set Up:

Not: ** papain çözüm olmak için tüm dondurulmuş maddeler kenara koyun.

  1. % 70 EtOH Temizlik forseps. Her ucu steril bir sarı pipetlemeyin ucu ile kaplayın. Kendi kutusunda steril slayt yüzük yerleştirmek için kullanın.
  2. Sıcak plaka:
    1. 1000ml beher 500-600ml dH 2 O ve büyük bir manyetik karıştırıcı çubuk dolu bir başlık altında bir mini-magnetic/hot tabak koyun.
    2. Beher, su seviyesinin hemen üzerinde plastik bir disk yerleştirin.
    3. Strafor disk küçük bir delik termometre kaydırın. Isı çevirmeli ihtiyacı biraz 2 'nin üzerinde olması (34 ° C geçici bir) ve heyecan arama ~ 5-6 olmalıdır.
  3. PBS:
    1. Hazırlayın ve steril PBS (4-6 ml steril korumak için emin olun 15 15ml steril tüpler doldurmak.
      tekniği).
    2. Kaputun yanında buz üzerinde tüpler ve stok şişe yerleştirin.
  4. Carbogen:
    1. Break yarısında 5ml stripette ve bir lastik tıpa ile itin stripette ucu stoper geniş ucunu dışarı taşacak.
    2. 400-500ml dH 2 O (stripette kırık ucu IN dH 2 O olmalıdır) 500ml cam şişe içinde stoper yerleştirin.
    3. Balonun yan açılışında bir tüp bağlayın.
    4. Sarı bir pipet ucu kapalı kesin ve tüp sonunda (kesme yüzü dışarı bakacak şekilde) bağlayın.

      Carbogen tankı 5ml stripette ucu bağlayın.

  5. Papain sol'n hazırlayın:
    1. * Dikkatli steril teknik kullanın.
    2. 50ml steril bir tüp içinde karıştırın.
  6. Filtre ayrışma şişenin içine papain sol'n:
    1. 25ml stripette (OR yer 20ml bir piston şırınga ucu yeni bir 0.2μm şırınga filtresi aracılığıyla Steriflip filtrasyon ünitesi ve disosiasyon flakon transfer kullanın.
      piston kaldırmak ve tüm şırıngaya papain sol'n aktarmak için bir stripette (25ml) kullanabilirsiniz.
    2. Filtre ayrışma şişenin içine).
    3. Flakon kapağı, steril bir şırınga eklemek kap delikten ve şırınga tabanına 0.2μm steril bir şırınga filtre takmak.
    4. Filtre ve parafilm bu yer carbogen bağlayın. Strafor disk / tutucu flakon yerleştirin.

      * Mikro-manyetik karıştırıcı hareket edilmelidir.
      * Gaz şişenin içine ZORUNLU.
      * Sıcaklık 34 stabilize ZORUNLU ° C

  7. Diseksiyon hazırlık:
    1. Kaputun altında diseksiyon mikroskobu getirin.
    2. Tüm diseksiyon aletleri, alüminyum folyo Lay% 70 EtOH ile sprey, aşırı kapalı dökün ve kurumaya kaputun altında bırakın.
  8. Nöronal orta hazırlayın:
    1. Inkübatör taze nöronal orta 30ml bırakın.
  9. 1 büyük alüminyum folyo kare ve 12 küçük kareler yerleştirin. Alüminyum folyo ile baş kesme makası bırakın. Küçük bir strafor kutu buzlu su ile doldurun ve kaput tüm dışında bırakın.
  10. Hazırlık anestezi (0.075ml ketamin ve 0.075ml xzylazine).
  11. 100 plaka yavrular için en az 12 (P0-P2) alın. Fareler için, bütün çöp için bir genotip maç olduğundan emin olun. Genotipi bilinmeyen ise, ayrı bir kapta her yavru plaka hücreleri, fare numaraları doğru kayıtları tutmak ve onları maç hücre kültürü yemekleri ve glial substrat genetik arka plan hücre kültürleri tektip olduğundan emin olun.

2) Diseksiyon

  1. Intraperitoneal enjeksiyonu ile ilk hayvan anestezisi. Hayvan sedasyon gösterir ve tail-flick testi yanıt vermiyor; 30 saniye (hipotermik kadar) buz koyun. Küçük bir alüminyum folyo kare, decap durulayınprogram akreditasyonunun makas, ve% 70 EtOH ile baş.
  2. Başını kesmek, kafa alüminyum folyo kare üzerine düşebilir ve kaputun altında taşımak için izin verir. 15ml tüp içine buz gibi soğuk PBS bir beyin yavaşça çıkarın. Sonraki beyin çıkarırken geri buz tüpü yerleştirin.
  3. Buz üzerinde 3 beyinleri vardır kadar bu ilk adımları tekrarlayın. Mikroskop altında ilk diseksiyon tabağa 3 beyin ve PBS dökün. Beynin ilgili bölümüne (MCM) çıkarın ve papain sol'n segmentleri koymak için transfer pipetlemeyin kullanabilirsiniz. Ilk bölümler içeri Sayacı başlat
  4. Tüm beyinleri papain sindirilir kadar önceki 3 adımları tekrarlayın. Sindirim için ortalama süresi 2 saat olmalıdır. Ilk bölümleri son olanları içeri zaman yaklaşık 1 saat olacak

    Fark bölmek deneyin.

  5. * Sindirim sırasında:
    1. Banyo sıcaklığı 34 olduğundan emin olun ° C
    2. Alanlar, ilk bakışta heyecan bar yapışabilir, ama zaman geçtikçe yaymak olmalıdır. Yoksa, flakonun alt dokunun.

3) ezerek toz haline getirme:

  1. Bir transfer pipet kullanarak, steril bir 15ml tüp (aşırı papain sol'n önlemek için deneyin) beynin bölümleri aktarmak ve onları inkübatör ısıtılmış glial orta 2ml 3 kez YIKAMA. Tüp içinde glial medya koyduktan sonra, bölümleri segmentler bozmadan yerleşmek ve sonra dikkatle mümkün olduğu kadar çok sol'n kaldırmak için izin verir. Kontaminasyonu önlemek için pipetler değiştirin!

    ** Kaldırılır sol'n tutmayın.

  2. Taze bir transfer pipet kullanarak glial medya 2ml triturations başlar. Karışım 25 kez (hava kabarcıkları kiralanmasından önlemek) ve undissociated segmentleri yerleşmek kadar tüp 3 dakika oturup bekleyin. Altındaki segmentleri bozmadan mümkün olduğunca sol'n TUTUN ve kaldırmak için bir transfer pipet kullanın. Yeni bir (steril) 15m tüp süpernatant tutun.
  3. 1000μl pipet ve 200μl pipet kullanarak tamamen ayrışmış kadar önceki adımı yineleyin.
  4. Bir transfer pipeti ile 10 kez Karışım veya hücreler tamamen sol'n yeniden süspanse kadar.

4) Kaplama Hücreler

  1. Forseps her ucu kapsayan, steril bir sarı pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde her bir çanak içinde de mümkün olduğunca cam merkezli bir slayt halka bırakın.
  2. Hemasitometre ve sayım hücre çözümü 10μl koyun. (Önemsiz kitleler hariç tut).
  3. Hücre sayısı 10 ile çarpın. Bu hücre / ml. Bu sayı 1,000,000-1,500,000 (veya istenilen yoğunluk) Böl. Bu çanak ortalama eklemek için ul sayısıdır.
  4. Uygun ul / çanak eklemek gibi merkez her yemeğin yüzük slayt pipet kullanın. Hafifçe Plaka ve HER yemek için ipuçları geçiş.
  5. 100μl (seyreltilmiş, GDNF sol'n) her yemeğin slayt halka içine ekleyin.
  6. Şu anda, inkübatör tepsileri ve soğuk oda nöronal orta getirmek.
  7. Hücreleri gecede yerleşmek için izin ver.
  8. Ertesi gün: kaldır halkaları (HER yemek için forseps ipuçları kapsayan yeni steril pipet uçları kullanarak)

5) Mitotik inhibisyonu: BİR SONRAKİ GÜN

  1. 1.8 ml steril MEM 200μl FDU stok ekleyerek 1000X stok 1:10 FDU alikotları sulandırınız.
  2. Her yemeğin dışında halka 20μl seyreltilmiş FDU sol'n ekleyin. Pipet uçları sık sık değiştirin. Kapak ve inkübatör dönmek.

    * Bir sonraki 7-10 gün için mümkün olduğunca az yemekler Rahatsız. Enfekte yemekleri için kontrol edin ve herhangi bir enfeksiyonun ilk belirtileri enfekte yemekleri kaldırmak. Kültürler 3 hafta içinde test etmek için hazırız.

MEDYA / ÇÖZÜMLER

Nöronal Orta

(200ml için)

Yıkar / öğütme için kullanmadan önce bir gecede şişeler glia klimalı ** En iyi

Bileşen Miktar Notlar
BSA% 5 0.5 g Fraksiyon V
MEM sıvı 94.0 ml Sigma
DMEM sıvı 80.0 ml Sigma
F-12 sıvı 20.0 ml Sigma
Glikoz 45% sıvı 1.50 ml Sigma çözümü
Glutamin 200mm 0.5 ml Aliquotted Sigma çözümü
Diporzio Conc. 2.0 ml Sigma çözümü
Sıvı Katalaz 0.1 ml
0.5M Kynurenic asit 200μl 1N NaOH
HCL 5N 50 ul

  1. Bir 250m maddeler (BSA son gider) ile birleştirinl plastik şişe.
  2. Filtre, etiket ve buzdolabına kaldırın.

Kynurenic Asit
(FW = 189.2)
0,5 M = 94.6mg/ml
200μl STERİL alikotları 756.8mgKA/8ml 1N NaOH ve pipet: 8 ml stok olun



DiPorzio Medya

A) DiPorzio Conc. Hisse Senetleri:

İHTİYACINIZ Birleştirmek Alliquot
Katkı Çözücü Tüp Miktar ml ml / tüp Kons. Miktar # Aliq.
İnsülin 20mm HCL (1) plastik 250mg şişe 10 1 25mg/ml 25mg 10
Transferrin Hank 500mg şişe 5 1 100mg/ml 100mg 5
SOD Hank 70mg şişe 14 1 5mg/ml 5mg 14
Putrescine Hank 50mg 3 0,12 20mg/ml 2.4mg 21
Na 2 SeO 3 Hank 0.104mg 10 0,5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10mM NaOH 2mg 10 0,1 0.20mg/ml 0mg 100
Progesteron 100% EtOH Cam 12.5mg 10 0,05 1.25mg/ml Pipetlemeyin kullanın.
Kortizol 100% EtOH Cam 20mg 10 0,02 2.00mg / ml Pipetlemeyin kullanın.

  1. 20mm HCl = 41.5μl kons. HCl/25ml.
  2. 1mg/ml stok yapın ve 10ml için 104μl ekleyin.



B) DiPorzio Medya Stok:

Katkı Miktarı (ml) Miktarı (ml) X2 Final Conc. mg / ml Final Conc. Molarite
Progesteron 0,05 0,1 0,06 200 nm
Kortizol 0,02 0,04 0,04 125nM
Hank BSS 6,21 12,42
İnsülin 1 2 25
Na 2 SeO 3 0,5 1 0,01 30nm
T3 0,1 0,2 0,02 30nm
SOD 1 2 5
Putrescine 0,12 0,24 2,4 15nM
Transferrin 1 2 100

  1. 15ml steril tüp polipropilen, progesteron ve kortizol eklemek için kullanın. (Tüp EtOH sıvı aspire için çok dikkatli olmak, yarım ve yerde yarı yolda bozuldu 5ml stripette pipetlemeyin Kimwipes ile güvenli bir şekilde tutun ve sonra ucu getirmek: EtOH buharlaşma hızı, bir aspiratör pipetlemeyin ve vakum kullanın. tüp tarafında bulunan 500μl işareti.
  2. Yukarıdaki grafikte göründükleri sırayla sonraki alikotları ekleyin.
  3. Sol'n bulutlu yapar insülin, eklenmesinden sonra, pH nötralize etmek için 1N NaOH 20μl ekleyin. Sol'n sarı, pembe ve hemen açık gitmek gerekir. AYRICA, transferin yanı sıra sonra, hemen pH nötralize ve Çökelek oluşumunu önlemek için, 1N NaOH 20μl ekleyin.
  4. 5 alikotları (tek parti) bir serolojik pipetlemeyin ve bölme içine 10ml çizin.
  5. Store @ -20 ° C
  6. 2 toplu bir seferde yapabilir.

Disosiyasyon Medya

A. Papain (1 şişe):

** Sağ diseksiyon önce kaplama güne hazırlayın.

Bileşen Tutar </ Strong> (Notlar) Final Conc.
Sistein Su 7.8mL 1mm sistein
Papain Şişe (* 190μl değişir.
44.0mg/ml)
20 adet / ml (toplam 400 adet
sol'n 20ml değerinde)
H & B kons. 2mL
Carbogen % 95 O2 +% 5 CO2
HCl 5N 10μl
% 0.5 fenol kırmızısı 20μl % 0.001 '
0.5M Kynurenate 10μl (1N NaOH) 0.5mm

  1. İLK sistein su papain ekleyin.
  2. H & B kons. Kynurenate, HCl ve fenol kırmızısı ekleyin.
  3. Disosiasyon flakon içine Filtresi (set-up yönde açıklandığı gibi) ve carbogen bağlanmak.


B. H & B Konsantre (5X 100 ml):

Malzemeler MW Powder/50ml H 2 O Kons. (M) Birleştirin (ml) Final Conc. (MM)
NaCl 58,44 11,699 g 4 14,5 116
KCl 74,56 3,728 g 1 2,7 5,4
NaHCO 3 84,01 4.2 g 1 13 26
NaH 2 PO 4 * H 2 O 137,99 6,90 g 1 1 2
MgSO 4 120,38 6,019 g 1 0,5 1
EDTA (ED2 SS)
292 Sigma% 5 (make
5g/100ml stok)
0,134 0,3722 0,5
Glikoz 180 Sigma 45% 2,5 5 25
TC H 2 O 62,93

  1. Miktarlarda stok çözümleri birleştirin.
  2. 4ml alikotları içine bölün.
  3. Kısım papain ekledikten sonra sistein su ekleyin.

C. Sistein Su (1X bir 157.5ml):

Malzemeler MW Bileşenleri
Toz (mg)
H 2 O (ml) Stok Conc (mM) Birleştirin (ml) Final Conc. (MM)
CaCl 2 147,2 736 10 500 0,6 1.9mM
Sistein 121,7 (1.5) 24 20mm (0.02M) 10 1.27mM
(0.88)
TC su 146,9

  1. Ve 4, 0,5 M CaCl2 stok sol'n tutmak ° C
  2. Sistein bir kullanım sol'n olun ve diğer maddeler ile birleşerek
  3. 4 mağaza 15.75 ml ve 10 alikotları içine Böl ° C


GDNF Hazırlık

  1. Kısım hazırlık:
    1. 2.4mL steril deiyonize su, 5μg GDNF steril, liyofilize pelet çözülür. Bu GDNF sol'n = 2.08μg/mL konsantrasyon.
    2. 2.08μg/mL GDNF sol'n steril cryovials 76.9μl alikotları içine dağıtın. Bu = 160ng vialde.
    3. -20 ° C'de muhafaza
  2. Kültürlere Ek:
    1. Her 8 yemekler için 1 kısım çözülme.
    2. 723.1μl nöronal medya / kısım ekleyerek kısım sulandırınız. Bu 160ng/800μl GDNF bir sol'n yapacaktır.
    3. Bu sol'n ml başına 10ng GDNF son bir konsantrasyon için her çanak orta 2mL 100μl ekleyin.


FDU Hazırlık

FDU-sol'n 1000X Stok:

Bileşen Miktar (Notlar) Final Conc.
Üridin 247 mg 16,5 mg / ml
5-FDU (5 fluorodeoxyuridine) 100 mg (şişe) 6.7 mg / ml
TC Su 15 ml

  1. 15 ml 16,5 mg / ml üridin biraz üzerinde olun.
  2. 6.7 mg / ml sol'n FDU, 15 ml üridin sol'n FDU 100 mg şişe ekleyin.
  3. -20 ° C 200μl alikotları ve donma içine Böl

Kullanım sulandırınız:

  1. Non-nöronal hücrelerin büyümesini engeller. 1.8 ml MEM 200μl stok ekleyerek 1000X stok 01:10 sulandırınız.
  2. 20μl seyreltilmiş FDU her yemeğin dışında halka ekleyin. Sık sık pipetlemeyin ipuçları değiştirin. Kapak ve inkübatör dönmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan yöntemler, aksi bir sistemik veya in vivo yaklaşım mevcut değildir merkezi dopamin nöronlar morfolojik ve nörokimyasal özellikleri ince çözümü için izin .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

DK065872 (AKP), Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Smith Aile Vakfı Ödülü (AKP), F31 DA023760 (BMG, ENP) ve P30 NS047243 Tufts (Neuroscience Araştırma Merkezi) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics