Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

Biology

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Summary

Primaire dissocié des cultures de cellules dopaminergiques du mésencéphale permettre l'étude des caractéristiques des neurones à dopamine présynaptique. Ils peuvent être utilisés pour surveiller en temps réel des cinétiques de libération de dopamine et de la protéine / ARNm niveaux de régulation de l'exocytose de dopamine. Ici, nous vous montrons comment générer ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs.

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Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

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Abstract

La capacité à créer des cultures de cellules primaires de neurones à dopamine permet l'étude des caractéristiques présynaptique des neurones dopaminergiques dans l'isolement de l'entrée systémique d'ailleurs dans le cerveau. Dans notre laboratoire, nous utilisons ces neurones pour évaluer la cinétique de libération de dopamine en utilisant l'ampérométrie en fibre de carbone, ainsi que les niveaux d'expression des gènes liés dopamine et de protéines en utilisant la PCR quantitative et immunocytochimie. Dans cette vidéo, nous vous montrons comment nous générons ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs.

Le processus comporte plusieurs étapes, y compris le placage de corticale astrocytes gliales, le conditionnement des milieux de culture cellulaire neuronale par le substrat gliales, la dissection du mésencéphale chez les nouveaux nés, la digestion, l'extraction et le placage des neurones à dopamine et l'ajout de facteurs neurotrophiques pour d'assurer la survie cellulaire.

Les applications appropriées pour une telle préparation comprennent l'électrophysiologie, l'immunocytochimie, PCR quantitative, la microscopie vidéo (ie, de la fusion vésiculaire en temps réel avec la membrane plasmique), des dosages de la viabilité cellulaire et d'autres tests de dépistage toxicologique.

Protocol

Préparation de la culture précédente

Note: Les cellules gliales ** doit être plaqué à l'avance afin qu'ils aient le temps de proliférer et de couvrir le fond de la vaisselle. Pour les souris avec le fond génétique atypique ou expérimentale, assurez-vous réunir les cultures gliales et neurones en termes de génotype.

Note: ** 1-7 jours avant la dissection, préparer fraîches moyennes neuronales et remplacer le milieu gliales dans les plats avec 2ml.

Note: ** Le jour avant la dissection, les éléments suivants doivent être laissés sous la lumière UV durant la nuit:

  • 4 plaques de dissection
  • 2 flacons de dissociation avec un barreau de micro-magnétiques
  • 2 bouchons des flacons (avec 2 petits trous fourré dans le top)
  • Etalez anneaux diapositives (et manteau dans EtOH à 70%) - laisser la boîte ouverte aussi
  • AU MOINS 2 boîtes pleines de trucs jaunes (10-200 pl) pipettes
  • 1 boîte de bleu (100-1000μl) pipette

Journée de la Culture

Note: * être sûr de ne rien toucher qui restait OUT POUR LA NUIT UV!

Maintenir un environnement stérile sous le capot est très important.

1) Set Up:

Note: ** Mettez de côté tous les ingrédients congelés pour préparer une solution papaïne.

  1. Nettoyez-le avec une pince EtOH à 70%. Couvrir chaque extrémité avec une pointe de pipette jaune stérile. Utilisez pour placer les anneaux glisser stériles dans leur boîte.
  2. Plaque de cuisson:
    1. Placer une plaque mini-magnetic/hot sous le capot avec un gobelet rempli à 1000ml 500-600ml dH 2 O et un barreau magnétique important.
    2. Placer un disque de styromousse dans le bécher juste au-dessus du niveau d'eau.
    3. Faites glisser le thermomètre dans un petit trou dans le disque de styromousse. Composer de chaleur doit être légèrement supérieur à 2 (pour une température de 34 ° C) et mélanger le cadran doit être ~ 5-6.
  3. PBS:
    1. Préparer PBS stérile et de remplir les tubes stériles 15 15ml avec 4-6 ml (veillez à maintenir stériles
      technique).
    2. Placer les tubes et les bouteilles de stock sur la glace à côté du capot.
  4. Carbogen:
    1. Break a Stripette 5ml de moitié et le pousser à travers un bouchon de caoutchouc, de sorte que le bout de la Stripette est collé sur l'extrémité large du bouchon.
    2. Placez le bouchon dans un flacon de 500ml avec 400-500ml O dH 2 (extrémité cassée d'Stripette devrait être dans le O DH 2).
    3. Connectez un tube sur l'ouverture latérale du ballon.
    4. Couper le bout hors d'une pipette jaune et le raccorder à l'extrémité du tube (avec le côté coupé vers l'extérieur).

      Raccorder le réservoir carbogène à la pointe de l'Stripette 5ml.

  5. Préparer la papaïne sol'n:
    1. * Utilisez minutieuse technique stérile.
    2. Mélanger dans un tube 50ml stérile.
  6. Filtre papaïne sol'n dans le flacon de dissociation:
    1. Utiliser une unité de filtration Steriflip et transfert à la dissociation flacon de 25ml par Stripette (ou placer un filtre seringue 0,2 um nouvelles sur la pointe d'un piston de la seringue de 20 ml,
      retirer le piston et d'utiliser un Stripette (25 ml) de transférer toutes les sol'n papaïne dans la seringue.
    2. Filtre dans le flacon de dissociation).
    3. Boucher le flacon, insérer une seringue stérile à travers le trou dans le bouchon et fixez un filtre seringue stérile 0,2 um à la base de la seringue.
    4. Branchez le carbogène au filtre et parafilm cet endroit en. Placer le flacon dans le styromousse disque / support.

      * La barre de mélanger les micro-magnétique doit être en mouvement.
      * Le gaz doit être en faire le flacon.
      * La température doit se stabiliser à 34 ° C.

  7. Dissection de préparation:
    1. Apportez le microscope de dissection sous le capot.
    2. Disposer tous les instruments de dissection sur le papier d'aluminium, de pulvérisation avec de l'EtOH 70%, verser l'excédent et laisser sous le capot pour sécher.
  8. Préparer le milieu neuronale:
    1. Laisser 30ml de milieu neuronal frais dans l'incubateur.
  9. Étalez une grand carré de papier d'aluminium et de 12 petits carrés. Laisser les ciseaux avec la décapitation du papier d'aluminium. Remplir une petite boîte en polystyrène avec de l'eau glacée et laisser tous en dehors de la hotte.
  10. Préparation de l'anesthésie (0.075ml kétamine et 0.075ml xzylazine).
  11. Obtenir au moins 12 chiots (P0-P2) pour 100 plaques. Pour les souris, assurez-vous il ya un match génotype pour toute la portée. Si le génotype est inconnu, cellules de la plaque de chaque chiot sur un plat à part, tenir des registres précis de numéros de souris et les jumeler avec des boîtes de culture cellulaire et s'assurer que le fond génétique du substrat gliales est uniforme à travers les cultures cellulaires.

2) Dissection

  1. Anesthésier les animaux d'abord avec une injection intrapéritonéale. Lorsque des animaux montre la sédation et ne répond pas à tail-flick test; le mettre dans la glace pendant 30 secondes (jusqu'à hypothermie). Rincer une petite feuille d'aluminium carrée, DecapCiseaux itation, et la tête avec de l'EtOH 70%.
  2. Décapiter, permettent à la tête carrée tomber sur du papier d'aluminium et passer sous le capot. Retirer délicatement le cerveau dans un tube de 15ml de PBS glacé. Placer le tube de retour sur la glace tout en retirant le cerveau prochaine.
  3. Répétez ces premières étapes jusqu'à ce qu'il ya 3 cerveaux sur la glace. Verser tous les trois cerveaux et PBS sur le plat de première dissection sous microscope. Retirez la section appropriée du cerveau (VTA) et l'utilisation d'une pipette de transfert de mettre les segments dans la papaïne sol'n. Démarrer une minuterie lorsque les segments d'abord aller po
  4. Répétez les étapes précédentes jusqu'à ce que tous trois cerveaux sont digérés dans la papaïne. Le temps moyen pour la digestion devrait être de 2 heures. Les premiers segments aura été en 1 heure environ au moment où les derniers vont po

    Essayez de diviser la différence.

  5. * Lors de la digestion:
    1. Assurez-vous que la température dans la salle de bain est de 34 ° C.
    2. Segments peut coller à la barre de mélanger au début, mais devrait s'étendre à mesure que le temps passe. S'ils ne le font pas, appuyez sur le fond du flacon.

3) La trituration:

  1. En utilisant une pipette de transfert, le transfert des segments du cerveau dans un tube stérile de 15 ml (essayez d'éviter les excès papaïne sol'n) et les laver 3 fois avec 2ml de milieu gliales réchauffé de l'incubateur. Après avoir mis les médias gliales dans le tube, permettent de régler les segments puis retirez soigneusement que sol'n autant que possible sans déranger les segments. Changer les pipettes pour éviter toute contamination!

    ** Ne gardez pas l'sol'n qui est supprimé.

  2. En utilisant une pipette de transfert frais commencent triturations dans 2ml de médias gliales. Triturer 25 fois (éviter de laisser de bulles d'air) et de laisser le tube reposer pendant 3 minutes jusqu'à ce que les segments non dissocié s'installer. Utiliser une pipette de transfert pour supprimer et de GARDER sol'n autant que possible sans déranger les segments au fond. Gardez le surnageant dans un nouveau (stérile) tube de 15m.
  3. Répétez l'étape précédente à l'aide d'une pipette 1000μl et la pipette 200 pl jusqu'au complètement dissociés.
  4. Triturer 10 fois avec une pipette de transfert, ou jusqu'à ce que les cellules sont complètement remises en suspension dans sol'n.

Cellules placage 4)

  1. En utilisant une pipette stérile, jaune, couvrant chaque extrémité de la pince, soigneusement déposer une bague coulissante comme centré sur le verre aussi bien que possible à l'intérieur de chaque plat.
  2. Mettez 10 ul de la solution de la cellule sur la hématimètre et compter. (Exclure les masses junk).
  3. Multiplier le nombre de cellules par 10. C'est le nombre de cellules / ul. Diviser 1,000,000-1,500,000 (ou la densité désirée) par ce numéro. C'est le nombre de pi à ajouter par plat.
  4. Utilisez la pipette pour glisser les anneaux sur le centre-bien de chaque plat que vous ajoutez ul appropriée / plat. Leur plaque délicatement et passer des conseils pour chaque plat.
  5. Ajouter 100 ul (dilué d') sol'n GDNF l'intérieur de la bague coulissante de chaque plat.
  6. A ce moment, le lieu des plateaux dans l'incubateur et apporter le support neuronal dans la chambre froide.
  7. Laisser les cellules sédimenter pendant la nuit.
  8. Le lendemain: retirer les anneaux (en utilisant de nouveaux embouts de pipette stérile, couvrant les conseils pince pour chaque plat)

Inhibition de la mitose 5): le lendemain

  1. Diluer aliquotes FDU des stocks 1:10 1000X en ajoutant 200 pl stocks FDU à 1,8 ml MEM stérile.
  2. Ajouter 20 pi diluée FDU sol'n à l'anneau extérieur de chaque plat. Changement des embouts de pipette souvent. Couvrir et retourner à l'incubateur.

    * Déranger les plats aussi peu que possible pour les prochains jours 7-10. Vérifiez pour des plats infectés et supprimer tous les plats infectés dès les premiers signes d'infection. Les cultures sont prêts pour les tests dans les 3 semaines.

MÉDIAS / SOLUTIONS

Medium neuronale

(Pour 200 ml)

** Mieux si conditionnée glie des flacons de nuit avant de l'utiliser pour le lavage / la trituration

Ingrédient Montant Remarques
BSA 5% 0,5 g Fraction V
Liquides MEM 94,0 ml Sigma
Liquide DMEM 80,0 ml Sigma
F-12 de liquide 20,0 ml Sigma
Glucose liquide 45% 1,50 ml Sigma solution
La glutamine 200 mM 0,5 ml Aliquotes solution Sigma
Diporzio Conc. 2,0 ml Sigma solution
Liquid catalase 0,1 ml
L'acide Kynurenic 0.5M 200 pl En NaOH 1N
HCL 5N 50 ul

  1. Mélanger les ingrédients (BSA va derniers) dans un 250mbouteille en plastique L.
  2. Filtre, l'étiquette, et réfrigérer.

Acide Kynurenic
(FW = 189,2)
0.5M = 94.6mg/ml
Faire des stocks 8ml: 756.8mgKA/8ml NaOH 1N et une pipette en aliquots de 200 ul STÉRILE



DiPorzio médias

A) DiPorzio Conc. Stocks:

BESOIN Combinent Alliquot
Additifs Solvant Tube Montant ml ml / tube Conc. Montant # Aliq.
Insuline 20mM HCL (1) en plastique Bouteille de 250mg 10 1 25mg/ml 25mg 10
La transferrine Hank Bouteille de 500mg 5 1 100mg/ml 100mg 5
SOD Hank Bouteille de 70mg 14 1 5mg/ml 5mg 14
Putrescine Hank 50mg 3 0,12 20mg/ml 2.4mg 21
Na 2 SeO 3 Hank 0.104mg 10 0.5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10 mM de NaOH 2mg 10 0.1 0.20mg/ml 0mg 100
La progestérone 100% EtOH Verre 12.5mg 10 0,05 1.25mg/ml Utiliser une pipette
Le cortisol 100% EtOH Verre 20mg 10 0,02 2.00MG / ml Utiliser une pipette

  1. 20 mM HCl = 41.5μl conc. HCl/25ml.
  2. Faire des stocks et ajouter 104μl 1mg/ml à 10ml.



B) DiPorzio Média:

Additifs Montant (ml) Montant (ml) X2 Conc final. pg / ml Conc final. Molarité
La progestérone 0,05 0.1 0,06 200nm
Le cortisol 0,02 0,04 0,04 125nM
Hank BSS 6,21 12,42
Insuline 1 2 25
Na 2 SeO 3 0.5 1 0,01 30 nM
T3 0.1 0.2 0,02 30 nM
SOD 1 2 5
Putrescine 0,12 0,24 2.4 15nm
La transferrine 1 2 100

  1. Utiliser un tube de polypropylène de 15 ml stériles pour ajouter la progestérone et le cortisol. Utiliser une pipette d'aspiration et de vide à la vitesse d'évaporation d'EtOH: (utilisez un Stripette 5ml cassée en deux et placez à mi-chemin vers le bas dans le tube étant très attentif à ne pas aspirer le liquide EtOH Tenir la pipette solidement en place avec Kimwipes puis amener la pointe. vers le bas pour la marque 500μl situé sur le côté du tube.
  2. Ajouter les aliquotes ultérieure dans l'ordre où ils apparaissent sur le graphique ci-dessus.
  3. Après l'ajout d'insuline, ce qui rend le trouble sol'n, ajouter 20 pi de NaOH 1N pour neutraliser le pH. Sol'n devrait aller du jaune au rose et immédiatement claire. En outre, après l'ajout de la transferrine, ajouter immédiatement 20 pi de NaOH 1N, pour neutraliser le pH et empêcher la formation de précipités.
  4. Dresser 10ml dans une pipette sérologique et la diviser en cinq parties aliquotes (un lot).
  5. Boutique @ -20 ° C.
  6. Peut faire 2 lots à la fois.

La dissociation des médias

A. La papaïne (pour 1 flacon):

** Préparer jour de placage à droite avant la dissection.

Ingrédient Montant </ Strong> (Notes) Conc final.
Eau cystéine 7.8mL Cystéine 1 mM
La papaïne Variable (* 190μl pour la bouteille de
44.0mg/ml)
20 unités / ml (400 unités au total
pour une valeur de 20 ml de sol'n)
H & B conc. 2mL
Carbogen 95% O2 + 5% de CO2
HCl 5N 10 ul
0,5% de rouge de phénol 20 pi 0,001%
Kynurenate 0.5M 10 ul (En NaOH 1N) 0,5 mM

  1. Ajouter la papaïne à l'eau de la cystéine FIRST.
  2. Ajouter le concentré de H & B., Kynurenate, HCl, et le rouge de phénol.
  3. Filtre dans le flacon de dissociation (comme décrit dans les directives de configuration) et se connecter au carbogène.


B. H & B concentré (100 ml de 5X):

Ingrédients MW Powder/50ml H 2 O Conc. (M) Combinez (ml) Conc final. (MM)
NaCl 58,44 11,699 g 4 14,5 116
KCl 74,56 3,728 g 1 2.7 5.4
NaHCO 3 84,01 4,2 g 1 13 26
NaH 2 PO 4 * H 2 O 137,99 6,90 g 1 1 2
MgSO 4 120,38 6,019 g 1 0.5 1
EDTA (ED2-SS)
292 Sigma 5% (faire
5g/100ml stock)
0,134 0,3722 0.5
Le glucose 180 Sigma 45% 2.5 5 25
TC H 2 O 62,93

  1. Mélanger des quantités de solutions de stock.
  2. Diviser en parties aliquotes 4ml.
  3. Ajouter aliquote à l'eau après l'ajout de cystéine papaïne.

Eau cystéine C (157.5ml de 1X):

Ingrédients MW Composants
Poudre (mg)
H 2 O (ml) Stock Conc. (MM) Combinez (ml) Conc final. (MM)
CaCl 2 147,2 736 10 500 0.6 1.9mm
La cystéine 121,7 (1.5) 24 20mm (0,02 M) 10 1,27
(0.88)
L'eau TC 146,9

  1. Faire et conserver un stock de sol'n CaCl2 0,5 M à 4 ° C
  2. Faites une sol'n une utilisation de la cystéine et de combiner avec d'autres ingrédients
  3. Diviser en 10 aliquotes de 15,75 ml et conserver à 4 ° C


Préparation GDNF

  1. Prep Aliquot:
    1. Dissoudre stérile, lyophilisée pastille de 5 ug GDNF avec 2,4 ml d'eau déminéralisée stérile. La concentration de cette 2.08μg/mL GDNF sol'n =.
    2. Distribuez les 2.08μg/mL GDNF sol'n en 76.9μl aliquotes dans des cryotubes stériles. Cette 160ng = par flacon.
    3. Conserver à -20 ° C.
  2. Ajout aux cultures:
    1. Dégeler une aliquote de tous les 8 plats.
    2. Diluer aliquote en ajoutant 723.1μl médias neuronales / aliquote. Cela fera un sol'n des 160ng/800μl GDNF.
    3. Ajouter 100 ul de cette sol'n à l'2mL de milieu de chaque plat pour une concentration finale de 10 ng par ml de GDNF.


Préparation FDU

FDU-sol'n Stock 1000X:

Ingrédient Montant (Notes) Conc final.
Uridine 247 mg 16,5 mg / ml
5-UPF (5-fluorodésoxyuridine) 100 mg (bouteille) 6,7 mg / ml
Eau TC 15 ml

  1. Faire un peu plus de 15 ml de 16,5 mg / ml d'uridine.
  2. Ajouter 15 ml d'uridine sol'n à 100 mg de bouteille pour faire FDU 6,7 mg / ml sol'n FDU.
  3. Diviser en parties aliquotes et congeler dans 200 pl de -20 ° C.

Diluer d'utilisation:

  1. Inhiber la croissance des cellules non-neuronales. Diluer 1:10 stocks 1000X en ajoutant 200 ul d'actions à 1,8 ml MEM.
  2. Ajouter 20 pi FDU dilué à l'anneau extérieur de chaque plat. Changer embouts de pipettes souvent. Couvrir et retourner à l'incubateur.

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Discussion

Les méthodes décrites ici permettent de résolution fine des caractéristiques morphologiques et neurochimiques des neurones dopaminergiques centrales qui sont par ailleurs pas disponible dans une approche systémique ou dans l'approche in vivo.

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Acknowledgements

Le travail a été soutenu par DK065872 (PEV), un Prix Smith Family Foundation de l'excellence en recherche biomédicale (PEV), F31 DA023760 (BMG, PEV) et P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

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