Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

Biology

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Summary

Primäre dissoziiert Mittelhirn Dopamin Zellkulturen erlauben die Untersuchung der präsynaptischen Eigenschaften des Dopamin-Neuronen. Sie können verwendet werden, um Echtzeit-Freisetzung von Dopamin Kinetik und Protein / mRNA-Spiegel von Regulatoren der Dopamin-Exozytose zu überwachen. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie diese Kulturen von Nagetier Neugeborenen zu generieren.

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Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).

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Abstract

Die Fähigkeit zur primären Zellkulturen von Dopamin-Neuronen erstellen können für die Untersuchung der präsynaptischen Eigenschaften des Dopamin-Neuronen isoliert von systemischen Eingabe von anderswo im Gehirn. In unserem Labor verwenden wir diese Neuronen zu Dopamin Freisetzungskinetik mit Kohlefaser Amperometrie sowie Expression von Dopamin-Genen und Proteinen mittels quantitativer PCR und Immunzytochemie beurteilen. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie wir diesen Kulturen zu generieren von Nagetier Neugeborenen.

Der Prozess umfasst mehrere Schritte, einschließlich der Beschichtung von kortikalen Gliazellen Astrozyten, die Konditionierung der neuronalen Zellkultur-Medien von den Gliazellen Substrat, das Sezieren des Mittelhirns bei Neugeborenen, die Aufschluss, Extraktion und Abscheidung von Dopamin-Neuronen und die Zugabe von neurotrophen Faktoren zu sicherzustellen, das Überleben der Zelle.

Die Anwendungen für ein solches Präparat enthalten Elektrophysiologie, Immunzytochemie, quantitative PCR, Video-Mikroskopie (dh in Echtzeit vesikulären Fusion mit der Plasmamembran), die Lebensfähigkeit der Zellen Assays und andere toxikologische Bildschirme.

Protocol

Vorbereitung Vor der Kultur

Hinweis: ** Gliazellen muss weit im Voraus beschichtet werden, so dass sie Zeit sich zu vermehren und decken den Boden der Küche haben. Bei Mäusen, die mit atypischen oder experimentelle genetische Hintergrund, stellen Sie sicher, Glia-und Nervenzellen Kulturen in Form von Genotyp entsprechen.

Hinweis: ** 1-7 Tage vor der Dissektion, bereiten Sie frisches neuronalen Medium und ersetzen Sie die Gliazellen Medium in den Schalen mit 2ml.

Hinweis: ** Am Tag vor der Dissektion, müssen die folgenden Elemente, um unter UV-Licht über Nacht verlassen werden:

  • 4 Dissektion Platten
  • 2 Dissoziation Fläschchen mit einem Mikro-Rührfisch
  • 2 Verschlusskappen (mit 2 kleinen Löchern stocherte in der Spitze)
  • Verteilt Gleitringe (und Mantel in 70% EtOH) - lassen Sie das Feld auch offen
  • Mindestens 2 volle Kisten mit gelben (10-200 ul) Pipettenspitzen
  • 1 Karton mit blau (100-1000μl) Pipettenspitzen

Day of Culture

Hinweis: * Achten Sie darauf, alles, was aus FÜR UV wurde über Nacht LINKS TOUCH!

Die Aufrechterhaltung einer sterilen Umgebung unter der Haube ist sehr wichtig.

1) Set Up:

Hinweis: ** beiseite Stellen Sie alle gefrorenen Zutaten zu Papain-Lösung zu machen.

  1. Saubere Zange mit 70% EtOH. Cover jede Spitze mit einem sterilen gelben Pipettenspitze. Verwenden Sie zum sterilen Gleitringe in ihre Box zu platzieren.
  2. Herdplatte:
    1. Legen Sie eine mini-magnetic/hot Platte unter der Haube mit einem 1000ml Becherglas gefüllt, um 500-600ml dH 2 O und einem großen Rührfisch.
    2. Legen Sie eine Styropor-Platte in das Becherglas nur oberhalb des Wasserspiegels.
    3. Schieben Sie das Thermometer in ein kleines Loch in das Styropor Platte. Hitze Einwahl braucht etwas mehr als 2 sein (für ein temporäres von 34 ° C) und die Aufsehen Einwahl sollte ~ 5-6 werden.
  3. PBS:
    1. Bereiten Sie sterile PBS und füllen 15 sterile 15ml Röhrchen mit 4-6 ml (achten Sie darauf, halten sterile
      Technik).
    2. Legen Sie die Rohre und die Vorratsflasche auf Eis neben der Motorhaube.
  4. Carbogen:
    1. Break a 5ml Stripette in der Mitte und schieben Sie sie durch einen Gummistopfen, so dass die Spitze des Stripette herausragt das breite Ende des Anschlags.
    2. Setzen Sie den Stopfen in einer 500ml Flasche mit 400-500ml dH 2 O (gebrochene Ende Stripette sollte in der dH 2 O werden).
    3. Schließen Sie einen Schlauch an der seitlichen Öffnung des Kolbens.
    4. Schneiden Sie die Spitze aus einer gelben Pipettenspitze und verbinden Sie diese bis zum Ende des Rohres (mit der Schnittfläche Seite nach außen).

      Schließen Sie das Carbogen Tank an der Spitze des 5ml Stripette.

  5. Bereiten Papain sol'n:
    1. * Verwenden Sie vorsichtig sterile Technik.
    2. Mix in einem sterilen 50ml Tube.
  6. Filter Papain sol'n in die Dissoziation Durchstechflasche:
    1. Verwenden Sie einen Steriflip Filtrationseinheit und Transfer zum Dissoziation Fläschchen über 25ml Stripette (oder dem Ort eine neue 0,2 um Spritzenfilter auf die Spitze eines 20ml Kolbenspritze,
      Entfernen Sie den Kolben und verwenden Sie ein Stripette (25ml), um alle Papain sol'n in die Spritze zu übertragen.
    2. Filter in die Dissoziation Durchstechflasche).
    3. Verschließe das Röhrchen, legen Sie eine sterile Spritze durch das Loch in der Kappe und fügen Sie eine sterile Spritze 0,2 um Filter auf der Basis der Spritze.
    4. Schließen Sie das Carbogen, um den Filter und Parafilm dieser Stelle. Legen Sie die Flasche in den Styropor-Platte / Halterung.

      * Die Mikro-Rührfisch müssen sich bewegen.
      * Das Gas muss damit in die Durchstechflasche.
      * Die Temperatur muss bei 34 ° C zu stabilisieren

  7. Dissection prep:
    1. Bringen Sie die Dissektionsmikroskop unter der Haube.
    2. Legen Sie alle Dissektionsinstrumente auf Aluminiumfolie, Spray mit 70% EtOH, abgießen Exzess und verlassen unter der Haube, um zu trocknen.
  8. Bereiten neuronalen Medium:
    1. Lassen Sie 30ml frischer neuronaler Medium in den Inkubator.
  9. Lay out 1 großes Quadrat aus Aluminiumfolie und 12 kleinere Quadrate. Verlassen Sie die Enthauptung einer Schere mit der Alufolie. Füllen Sie eine kleine Styropor-Box mit Eiswasser und lassen Sie alle außerhalb der Haube.
  10. Prep der Narkose (Ketamin und 0.075ml 0.075ml xzylazine).
  11. Holen Sie sich mindestens 12 Welpen (P0-P2) für 100 Platten. Bei Mäusen, stellen Sie sicher, gibt es eine Genotyp Spiel für die ganze Wurf. Wenn Genotyp unbekannt ist, Platte Zellen aus jeder Welpe auf einem separaten Teller, genaue Aufzeichnungen der Maus Zahlen und passen sie mit Zellkulturschalen und sicherstellen, dass der genetische Hintergrund der Glia-Substrat gleichmäßig über Zellkulturen.

2) Dissection

  1. Anesthetize das erste Tier mit einer intraperitonealen Injektion. Als Tier Sedierung zeigt und sich nicht auf Schwanzschlagetest reagieren; steckte es in Eis für 30 Sekunden (bis Hypothermie). Spülen Sie eine kleine Alu-Folie Quadrat, decapitation Schere, und der Kopf mit 70% EtOH.
  2. Enthaupten, damit Kopf bis auf Aluminiumfolie Platz fallen und bewegen sich unter der Haube. Entfernen Sie vorsichtig Gehirn in ein 15ml Röhrchen mit eiskaltem PBS. Das Röhrchen wieder auf Eis beim Entfernen der nächsten Gehirn.
  3. Wiederholen Sie diese ersten Schritte, bis es 3 Köpfe auf dem Eis. Füllen Sie alle 3 Köpfe und PBS auf die erste Sektion Gericht unter dem Mikroskop. Entfernen entsprechenden Abschnitt des Gehirns (VTA) und mit einem Transfer-Pipette auf die Segmente in Papain sol'n setzen. Starten einer Zeit, als die ersten Segmente hineingehen
  4. Wiederholen Sie die letzten 3 Schritte, bis alle Gehirne in Papain verdaut werden. Die durchschnittliche Zeit für die Verdauung sollte 2 Stunden betragen. Die ersten Segmente werden in ca. 1 Stunde bis zum Zeitpunkt der letzten, die hineingehen worden

    Versuchen Sie, den Unterschied aufgeteilt.

  5. * Während der Verdauung:
    1. Sicherstellen, dass die Temperatur im Bad ist 34 ° C.
    2. Segmente kann der Rührstab auf den ersten Stock, sollte aber ausbreiten wie die Zeit vergeht. Wenn sie das nicht tun, tippen Sie auf den Boden des Fläschchens.

3) Trituration:

  1. Mit einem Transfer Pipette das Gehirn Segmente in ein steriles 15 ml Tube (versuchen Sie, um überschüssige Papain sol'n zu vermeiden) und waschen Sie sie 3-mal mit 2 ml erwärmt Gliazellen Medium aus dem Inkubator. Nachdem er die Gliazellen Medien in die Röhre, damit Segmenten, sich niederzulassen und dann vorsichtig so viel sol'n wie möglich zu entfernen, ohne die Segmente. Ändern Pipetten, um Kontaminationen zu vermeiden!

    ** Nicht halten die sol'n, der entfernt wird.

  2. Mit einem frischen Transferpipette beginnen Verreibungen in 2ml Gliazellen Medien. Man reibt 25-mal (vermeiden, dass in Luftblasen) und lassen Sie den Schlauch für 3 Minuten sitzen, bis undissoziierten Segmente zu begleichen. Verwenden Sie einen Transferpipette zu entfernen und zu halten, wie viel sol'n wie möglich, ohne störende Segmente an der Unterseite. Halten Sie den Überstand in ein neues (steril) 15m Schlauch.
  3. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit einem 1000μl Pipette und 200 ul Pipette bis vollständig dissoziiert.
  4. Man reibt 10 mal mit einer Transferpipette, oder bis die Zellen vollständig in sol'n resuspendiert.

4) Plating Cells

  1. Mit einem sterilen gelben Pipettenspitze für jedes Spitze der Zange vorsichtig Tropfen ein Gleitring als das Glas so gut wie möglich in jedem Gericht zentriert.
  2. Setzen Sie 10 &mgr; l der Zelle Lösung auf dem Hämazytometer und zählen. (Exclude Junk-Massen).
  3. Multiplizieren Sie die Anzahl der Zellen um 10. Dies ist die Anzahl der Zellen / ul. Teilen Sie 1,000,000-1,500,000 (oder gewünschte Dichte) von dieser Nummer. Dies ist die Anzahl der ul pro Teller hinzuzufügen.
  4. Verwenden Sie die Pipettenspitze Ringe über die Mitte-und von jedem Gericht schieben, wie Sie geeignete ul / Schale hinzuzufügen. Platte sie sanft und schalten Sie Tipps für jedes Gericht.
  5. Add 100 &mgr; (verdünnte) GDNF sol'n innerhalb der Gleitring von jedem Gericht.
  6. An diesem Ort, Zeit die Fächer in den Inkubator und bringen die neuronale Medium in den Kühlraum.
  7. Lassen Zellen über Nacht absetzen.
  8. Am nächsten Tag: Sie Ringe (mit neuen sterilen Pipettenspitzen für die Zange Tipps für jedes Gericht)

5) Mitotische Inhibition: THE NEXT DAY

  1. Verdünnen FDU Aliquots 1000X Lager 1:10, indem 200 ul FDU Lager zu 1,8 ml sterile MEM.
  2. Add 20 &mgr; l verdünnt FDU sol'n den äußeren Ring von jedem Gericht. Ändern Pipettenspitzen oft. Cover und zurück in den Inkubator.

    * Stören die Gerichte so wenig wie möglich für die nächsten 7-10 Tage. Prüfen Sie, ob infizierte Speisen und entfernen Sie alle infizierten Speisen bei den ersten Anzeichen einer Infektion. Kulturen sind bereit für die Prüfung innerhalb von 3 Wochen.

MEDIEN / SOLUTIONS

Neuronale Medium

(Für 200 ml)

** Am besten, wenn auf Glia aus Kolben über Nacht vor dem Einsatz zur Wäschen / Verreibung konditioniert

Zutat Betrag Hinweise
BSA 5% 0,5 g Fraction V
MEM Flüssigkeit 94,0 ml Sigma
DMEM Flüssigkeit 80,0 ml Sigma
F-12 Flüssigkeit 20,0 ml Sigma
Glucose 45% Flüssigkeit 1,50 ml Sigma-Lösung
Glutamin 200 mM 0,5 ml Aliquotiert Sigma-Lösung
Diporzio Conc. 2,0 ml Sigma-Lösung
Flüssige Catalase 0,1 ml
Kynurensäure 0,5 M 200 ul In 1N NaOH
HCL 5N 50 pl

  1. Alle Zutaten (BSA geht Vorherige) in einem 250ml Kunststoff-Flasche.
  2. Filter, label, und in den Kühlschrank.

Kynurensäure
(FW = 189,2)
0,5 M = 94.6mg/ml
Machen 8ml Lager: 756.8mgKA/8ml 1N NaOH und Pipette in sterile Aliquots 200 ul



DiPorzio Medien

A) DiPorzio Conc. Stocks:

NEED Kombinieren Alliquot
Zusatz Lösungsmittel Tube Betrag ml ml / Rohr Conc. Betrag # Aliq.
Insulin 20 mM HCl (1) Kunststoff 250mg-Flasche 10 1 25mg/ml 25mg 10
Transferrin Hank 500mg-Flasche 5 1 100mg/ml 100mg 5
SOD Hank 70mg-Flasche 14 1 5mg/ml 5mg 14
Putrescin Hank 50mg 3 0,12 20mg/ml 2,4 mg 21
Na 2 SeO 3 Hank 0.104mg 10 0,5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10 mM NaOH 2mg 10 0,1 0.20mg/ml 0mg 100
Progesteron 100% EtOH Glas 12.5mg 10 0,05 1.25mg/ml Verwenden Sie pipet
Cortisol 100% EtOH Glas 20mg 10 0,02 2.00MG / ml Verwenden Sie pipet

  1. 20 mM HCl = 41.5μl konz. HCl/25ml.
  2. Machen 1mg/ml Lager und stell 104μl bis 10ml.



B) DiPorzio Medien Stock:

Zusatz Menge (ml) Menge (ml) X2 Finale Conc. pg / ml Finale Conc. Molarität
Progesteron 0,05 0,1 0,06 200 nM
Cortisol 0,02 0,04 0,04 125nM
Hanks BSS 6,21 12,42
Insulin 1 2 25
Na 2 SeO 3 0,5 1 0,01 30Nm
T3 0,1 0,2 0,02 30Nm
SOD 1 2 5
Putrescin 0,12 0,24 2,4 15nm
Transferrin 1 2 100

  1. Verwenden Sie ein 15ml Polypropylen sterilen Röhrchen an den Progesteron und Cortisol hinzuzufügen. Verwenden Sie einen Aspirator Pipette und Vakuum-Verdampfung von EtOH Geschwindigkeit: (verwenden Sie einen 5ml Stripette in der Hälfte und Ort auf halbem Weg nach unten in die Röhre sehr vorsichtig, nicht EtOH Flüssigkeitsaufnahme gebrochen Halten pipet sicher an seinem Platz mit Kimwipes und dann bringen die Spitze. bis in die 500μl Markierung auf der Seite der Röhre befindet.
  2. Fügen Sie die nachfolgenden Aliquots in der Reihenfolge ihres Auftretens auf der Tabelle oben.
  3. Nach der Zugabe von Insulin, das den sol'n bewölkt macht, fügen Sie 20 &mgr; l 1 N NaOH auf den pH-Wert zu neutralisieren. Sol'n sollte von gelb bis pink und sofort klar gehen. Auch nach der Zugabe von Transferrin, sofort hinzufügen 20 &mgr; l 1 N NaOH, um den pH-Wert zu neutralisieren und verhindern die Bildung von Niederschlägen.
  4. Zeichnen Sie bis 10ml in eine serologische Pipette und teilen sich in 5 Aliquots (eine Charge).
  5. Shop @ -20 ° C.
  6. 2. Mai Chargen auf einmal zu machen.

Dissoziation Medien

A. Papain (für 1 Flasche):

** Bereiten Tag der Beschichtung Recht vor ihrer Zerlegung.

Zutat Betrag </ Strong> (Notes) Final Conc.
Cystein Wasser 7.8mL 1mM Cystein
Papain Variiert (* 190μl für die Flasche
44.0mg/ml)
20 Einheiten / ml (400 Einheiten insgesamt
für 20ml im Wert von sol'n)
H & B konz. 2 ml
Carbogen 95% O2 + 5% CO2
HCl 5N 10 &mgr; l
0,5% Phenolrot 20 &mgr; l 0,001%
Kynurenate 0,5 M 10 &mgr; l (In 1N NaOH) 0,5 mM

  1. Add Papain auf die Cystein Wasser FIRST.
  2. Fügen Sie die H & B konz., Kynurenate, HCl, und Phenolrot.
  3. Filter in Dissoziation Fläschchen (wie in der Set-up Richtungen beschrieben) und die Verbindung zum Carbogen.


B. H & B-Konzentrat (100 ml 5-fach):

Zutaten MW Powder/50ml H 2 O Conc. (M) Combine (ml) Finale Conc. (MM)
NaCl 58,44 11,699 g 4 14,5 116
KCl 74,56 3,728 g 1 2,7 5,4
NaHCO 3 84,01 4,2 g 1 13 26
NaH 2 PO 4 · H 2 O 137,99 6,90 g 1 1 2
MgSO 4 120,38 6,019 g 1 0,5 1
EDTA (ED2-SS)
292 Sigma 5% (make
5g/100ml Lager)
0,134 0,3722 0,5
Glucose 180 Sigma 45% 2,5 5 25
TC H 2 O 62,93

  1. Kombinieren Mengen aus Stammlösungen.
  2. Teilen Sie sich in 4ml Aliquots.
  3. Add Aliquot zu Cystein Wasser nach Zugabe von Papain.

C. Cystein Water (157.5ml 1X):

Zutaten MW Komponenten
Powder (mg)
H 2 O (ml) Lager Conc. (MM) Combine (ml) Finale Conc. (MM)
CaCl 2 147,2 736 10 500 0,6 1.9mm
Cystein 121,7 (1.5) 24 20mm (0,02 M) 10 1,27
(0.88)
TC Wasser 146,9

  1. Machen und zu halten einen Bestand von 0,5 M CaCl2 sol'n bei 4 ° C
  2. Machen Sie eine Verwendung sol'n von Cystein und in Kombination mit anderen Inhaltsstoffen
  3. Teilen Sie sich in 10 Aliquots von 15,75 ml und lagern bei 4 ° C


GDNF Vorbereitung

  1. Aliquot prep:
    1. Lösen Sie sterile, lyophilisierte Pellet 5μg GDNF mit 2,4 ml sterilem deionisiertem Wasser. Die Konzentration dieses GDNF sol'n = 2.08μg/mL.
    2. Verteilen Sie die 2.08μg/mL GDNF sol'n in 76.9μl Aliquots in sterile Kryoröhrchen. Diese = 160ng pro Fläschchen.
    3. Lagerung bei -20 ° C.
  2. Zusätzlich zu den Kulturen:
    1. Thaw 1 ALIQUOT für alle 8 Gerichte.
    2. Verdünnen aliquoten indem 723.1μl neuronalen media / Aliquot. Damit wird ein sol'n von 160ng/800μl GDNF.
    3. Add 100 &mgr; dieser sol'n die 2 ml Medium in jedes Gericht für eine endgültige Konzentration von 10ng GDNF pro mL.


FDU Vorbereitung

FDU-sol'n 1000X Lager:

Zutat Betrag (Notes) Final Conc.
Uridin 247 mg 16,5 mg / ml
5-FDU (5-Fluordeoxyuridin) 100 mg (Flasche) 6,7 mg / ml
TC Wasser 15 ml

  1. Machen Sie ein wenig mehr als 15 ml von 16,5 mg / ml Uridin.
  2. 15 ml Uridin sol'n bis 100 mg Flasche FDU auf 6,7 mg / ml sol'n FDU machen.
  3. Teilen Sie sich in 200 ul Aliquots und frieren in -20 ° C.

Verdünnen Sie für den Einsatz:

  1. Hemmen das Wachstum von nicht-neuronalen Zellen. Verdünnen 1000X Lager 1:10, indem 200 ul Lager zu 1,8 ml MEM.
  2. Add 20 &mgr; l verdünnt FDU den äußeren Ring von jedem Gericht. Ändern Pipettenspitzen oft. Cover und zurück in den Inkubator.

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Discussion

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen feine Auflösung von morphologischen und neurochemischen Merkmalen der zentralen Dopamin-Neuronen, die sonst nicht in einen systemischen oder in vivo-Ansatz zur Verfügung.

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Acknowledgements

Die Arbeit wurde von DK065872 (ENP), eine Smith Family Foundation Award of Excellence in Biomedical Research (ENP), F31 DA023760 (BMG, ENP) und P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research) unterstützt.

Materials

Materials are included in the protocol text.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

Comments

29 Comments

  1. Excellent!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2008 - 11:03 AM
  2. I would like to thank Lauren and Emmanuel for such an excellent piece of science. I was thinking of setting up the method in my lab and the video encouraged me to do so. Sure it helps a lot!!! Hope to see more like this video in the future.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2009 - 11:59 AM
  3. Thank you very much for this wonderful protocol. I am very excited to try this out. Could you please let me know what kind of plates you used for plating the glia and where did you buy the slide rings from (catalog number perhaps). Thanks a bunch!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 23, 2009 - 4:38 PM
  4. Thank you for the comment and we are happy to help. The dishes were ordered from World Precision Instruments: FlouroDish FD35PDL-100, tissue culture dish with cover glass bottom, dish:35mm glass:²3mm. Thanks, Lauren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 11:20 AM
  5. And slide rings: Thomas 6705-R1² Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 23, 2009 - 1:57 PM
  6. can you please tell me how to separate astrocyte from neurons using serum coating. please send a protocol if possible. thanks Gaurav jain gauravjain_niper@yahoo.co.in

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 PM
  7. We do not have a protocol to separate astrocytes from neurons, all our cell sorting is done through immunocytochemistry on fixed tissue. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 24, 2009 - 3:21 PM
  8. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:18 AM
  9. Cortical astrocytes are the best option as the midbrain dŒs not provide as high a yield. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2009 - 7:44 AM
  10. I have never worked with midbrain coltures and I really appreciate your video that will help me for sure.
    I have a question, when you first plate astrocytes ² weeks before, you mean astrocytes from midbrain tissue? Or maybe are they from cortex or hyppocampus? Because I know how to prepare cortical astrocytes but I would like to know if it is possible to prepare them also from midbrain.
    Thanks in advance.

    Ilaria

    Reply
    Posted by: Ilaria V.
    November 15, 2009 - 4:28 AM
  11. Hi, the astrocytes we derive from cortical tissue (higher yield than in the midbrain).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:14 PM
  12. Hi there,

    It's great to find this info online, many thanks for submitting it. Can I ask what kind of % DA neuron yields you're getting this way?

    Cheers,

    Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 9:39 AM
  13. The yield is in the range of 40-60% if cells are plated in the presence of GDNF. Otherwise, the yield is in the range of 10-²0%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:17 PM
  14. Hi again,

    Sorry, i had one other thing to ask if I may. We have a lot of experience with hippocampal dissociated cultures and would be interested in seeing whether the midbrain cultures can work with the media we use for these (Neurobasal and variants); in trying this, is there any specific nutritional or medium requirement of DA neurons you've identified that we should be aware of, which isn't likely to be something we are already giving the hippocampal neurons? I see you include things like catalase and kynurenic acid that aren't in our medium......I presume these are to minimise oxidative and excitotoxic stress? Can i ask, do you have an idea of how much these improve the yield by? Many thanks again, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 18, 2010 - 10:36 AM
  15. As mentioned above, the single most critical factor in improving dopamine neuron yield is GDNF.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 1:19 PM
  16. Many thanks indeed for this information, that's really helpful. cheers,
    Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 4:46 PM
  17. Sorry, one final one from me - have you ever tried the Banker method with these? I have heard this dŒsn't work as well as having the cell layers in full contact, is this your experience? Is it very much worse? I am very interested in trying Banker because a neuronal monolayer would work much better with the microscopy set up I want to use! Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Alexander J.
    February 19, 2010 - 4:59 AM
  18. No, we have not tried the Banker protocol on this.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2010 - 12:25 PM
  19. Hello, I wonder if I can ask what you coat your culture dishes with before plating astrocytes? I am finding that mouse glia may be quite sensitive to the usual things like poly-D-lysine etc. Many thanks, Alex

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2010 - 9:01 AM
  20. Poly-D-lysine is fine for rat astrocytes, laminin is better for mouse astrocytes (although poly-D-lysine has also worked for us in mouse cultures).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2010 - 2:56 PM
  21. Hi, thanks for the protocol. Can you explain why you use P0-P² mice? I am looking to study early DA neurons from what would become the VTA and was planning on using embryonic brains, so wondered what the reason was for using neonatal brains here.

    Many thanks,
    Naomi

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 4, 2012 - 10:29 AM
  22. Using embryonic instead of neonatal brains with this procedure would be fine provided that you account for adequate brain development in utero. To be safe and ensure health of the dopamine cell bodies in culture, I would avoid using embryos prior to the third trimester of gestation. We have not used dissociated cultures for precursors to dopamine neurons so I am not really qualified to vouch for the viability of such preparations. Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2012 - 6:55 PM
  23. Ok, thank you!

    Reply
    Posted by: Naomi P.
    October 19, 2012 - 4:20 AM
  24. Hi Naomi, the protocol should work with embryonic brains as well (provided you allow for development of DA neurons) but the dissection is going to be much more challenging. I would suggest you culture neurons from the midbrain (both VTA and nigra) in that case to allow for the difference in size of the brain sites you are targeting. MIcrodissection techniques may also help, but you have to find the way to get your tissue in carbogenated media ASAP.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:44 PM
  25. Thank you for posting such a great informational video. I have a follow-up question to the previous question on this page: would it also be appropriate to use postnatal day 2-5 mice instead of PN 0-2? I ask because I have seen other protocols to culture primary dopamine neurons that use older mice (for example, Smeyne and Smeyne, 2002).

    Thanks,
    Brittany W.

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    July 5, 2013 - 2:18 PM
  26. Hi Brittany, you can try with P2-P5 but it is not optimal. P0-P2 would typically give you the highest yield in live DA cells in culture, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:47 PM
  27. Thanks!

    Reply
    Posted by: Brittany W.
    November 21, 2013 - 2:39 PM
  28. Hi, The protocol is explained and shown very nicely. I want to do only dopaminergic neuron culture. Is it possible to do the culture without glia or seeding it directly on poly d lysine coated plates. In your protocol you have added FDU to kill dividing cells (glia), does it kill all within and outside the ring in the plate, and you get only dopminergic cells at the end. Would you please help and suggest a bit. Thanks. Farah

    Reply
    Posted by: Farah S.
    November 20, 2013 - 10:27 AM
  29. Hi Farah, we have not been able to produce DA cell cultures without plating glia, the latter are needed to condition the media and help sustain the culture for several weeks. If you only think of acute experiments, it might be possible to isolate DA cells for a few hours, but they would have no neurites, they would be difficult to identify as DA neurons and they would die very fast. Best, Emmanuel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 20, 2013 - 12:51 PM

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