Imagerie Les cellules T effectrices de mémoire dans l'oreille après induction de SRD adoptifs

Biology

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Summary

Ici nous démontrons une méthode pour induire et d'enregistrer les progrès d'un retard de type hypersensibilité (SRD) réaction de l'oreille chez le rat. Elle est suivie par une démonstration de la préparation du tissu de l'oreille chez le rat pour l'imagerie à deux photons de la réponse cellulaire effecteur / T mémoire.

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Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

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Abstract

Type de l'hypersensibilité retardée (DTH) est une réaction immunitaire dans laquelle les principaux acteurs sont CCR7 - effecteur / lymphocytes T mémoire. Ici, nous démontrons une méthode pour induire et d'enregistrer les progrès d'une réaction d'hypersensibilité retardée dans l'oreille de rat. Elle est suivie par une démonstration de la préparation du tissu de l'oreille chez le rat pour l'imagerie à deux photons de l'CCR7 - la réponse des cellules effectrices / T mémoire.

Un SRD adoptifs est induite par l'injection intrapéritonéale de GFP-étiquetée spécifiques de l'OVA CCR7 - ligne de cellules effectrices / T mémoire (Beeton, C J. expériences visualisées, numéro 8). Les cellules sont ensuite autorisés à s'équilibrer dans le rat pendant 48 heures avant l'épreuve par l'injection d'une oreille avec une solution saline (contrôle oreille) et l'autre avec un mélange 1:1 de conjugués d'ovules et d'ovules au Texas-Red (Ova-TR) pour permettre la visualisation des résidents cellules présentatrices d'antigène.

Nous décrivons une méthode de préparation des tissus utiles pour l'imagerie de la motilité des cellules dans la couche profonde cutanée durant une réponse immunitaire, en conjonction avec la visualisation des fibres de collagène par la génération de second harmonique. Tissu de l'oreille est coupé en carrés de 5 mm x 5 (légèrement plus grand, c'est mieux) et monté sur des lamelles en plastique à l'aide Vetbond ™, qui sont ensuite fixés avec de la graisse de silicone dans une chambre d'imagerie et perfusées par l'oxygène-bulles moyennes de culture de tissus à 37 ° C .

Protocol

L'induction de SRD adoptifs

S'il vous plaît voir l'article de jove: induction et la surveillance des parents adoptifs hypersensibilité de type retardé chez les rats
Christine Beeton, George K. Chandy
Département de physiologie et de biophysique, Université de Californie, Irvine
Expériences J. visualisés, Numéro 8

Ici, nous avons modifié ce protocole en utilisant un antigène (ovalbumine), conjugué au Texas-Red dans un rapport 1:1 avec l'antigène non marqué pour permettre la visualisation des phagocytes cellules présentatrices d'antigène.

Récolte tissu de l'oreille

  1. Euthanasier les rats à la fois du point souhaité par les procédures décrites dans le protocole d'animaux approuvés. Ici, nous utilisons une surdose de l'anesthésique, l'isoflurane. Ceci est fait dans un récipient fermé situé à l'intérieur d'une hotte bien ventilée. Assurez-vous que l'animal est mort soit par décapitation de l'ouverture de la cavité thoracique et la coupe du coeur.

  2. Avec des ciseaux grande retirer l'oreille avec une seule coupe, au plus près du corps de l'animal que possible (figure 1).

    Figure_1.jpg
    Figure 1. Suppression de l'oreille chez le rat

  3. Placez l'oreille dans un tube de 15 ml conique contenant 10 ml de ~ glacée 1x PBS ou RPMI-1640. Conserver les échantillons de tissu sur la glace jusqu'à ce que vous êtes prêt à préparer les tissus pour l'imagerie.

  4. Image le tissu le plus tôt possible; nous trouvons, cependant, que 1 à 2 heures sur la glace n'a pas d'effet discernable sur la motilité cellulaire dans les tissus par rapport aux tissus récoltés et imagé immédiatement.

Préparation des tissus pour l'imagerie

Retrait I. couche épidermique et dermique

* Note: La couche de derme profond doit être gardée intacte. Si fait correctement les gros vaisseaux sanguins restera intact et le cartilage de l'oreille ne sera pas exposée. C'est une technique difficile, surtout quand il n'ya pas d'inflammation (les conditions de contrôle) et il est utile d'utiliser un microscope à dissection.

  1. Placez les deux le tissu et les médias du tube conique dans un plat de 10 cm de culture de tissu.

  2. Avec les mains gantées maintenir l'oreille du rat doucement à la pointe de l'oreille (distale) avec la face dorsale de l'oreille vers le haut (figure 2).

    Figure_2.jpg
    Figure 2. La fourrure Coupez l'oreille

  3. Avec votre pouce sur le dessus de l'oreille, soutenue le tissu tout en utilisant la pointe d'fermés Dumont # 5 ciseaux pour séparer le derme du derme profond. Alternativement, si le bord de l'oreille a un surplomb de la peau / derme profond, ce qui peut être saisie avec une pince et tire doucement pour séparer ce à partir des tissus en dessous (figure 3).

    Figure_3.jpg
    Figure 3. Suppression de la partie supérieure du derme

  4. Une fois une petite zone de peau a été séparée du tissu sous-jacent, répétez les étapes de séparation utilisant alternativement des ciseaux pour couper entre les couches dermiques et une pince pour enlever délicatement et retirez la peau délogé.

  5. Exposer un 5 x 5 mm ou plus grande surface de tissu de l'oreille qui est au moins 3 mm sur le site initial de l'injection d'antigène (figure 4).

    Figure_4.jpg
    Figure 4. Tissu exposé pour l'imagerie

II. Sécurisation du tissu à l'étape d'imagerie

  1. Couper une lamelle en plastique d'une taille légèrement plus grande que les tissus préparés.

  2. Étendre une mince couche de 3M ™ Vetbond tissus sûre de la colle sur la diapositive.

  3. Saisir le coin du tissu préparé (où vous ne sont pas susceptibles d'image), retirer du média, et tamponnez la partie inférieure du tissu sur du papier lentille ou Kym essuyer pour enlever l'excès des médias.

  4. Toucher le bord du tissu à la diapositive de la colle couverts (les guérisons Vetbond immédiatement sur tissu humide). Étirez le tissu à plat, avec l'extrémité opposée étant le dernier à toucher la lame (figure 5)

    Figure_5.jpg
    Figure 5. Mont mouchoir pour vous couvrir de glissement

  5. Cure ™, Vetbond en inversant le tissu échantillon / glisser et en le plongeant dans un réservoir de médias tels que les tissus et les diapositives sont face vers le bas et à peu près à un angle de 45 degrés. Tenir le tissu à l'envers à un angle permet d'éviter l'excès de colle de durcir à la surface des tissus exposés. Colle sur la surface du tissu va bloquer le laser (figure 6).

    Figure_6.jpg
    Figure 6. Cure tissus Vetbond glue par trempage dans les médias

    Remarque: étapes 2-5 peuvent prendre un peu de pratique pour maîtriser. Essayez de pratiquer avec des morceaux de tissus jetés ou extra avant de tenter pour la première fois.

  6. Tamponnez une petite quantité de graisse silicone sur le bas de la diapositive.

  7. Placer la lame dans la chambre de perfusion. Assurez-vous que les médias perfusion coule, 37 ° C et oxygéné avant d'ajouter des tissus. Appuyez doucement sur les bords de la lame faisant un joint avec la graisse silicone entre le fond de la chambre de perfusion et de la lamelle en plastique.

III. Deux-Photon Imaging

  1. Utiliser champ lumineux lumière transmise, se concentrer sur le haut du tissu. Eteignez toutes les lumières.

  2. Allumez le laser, PMT tel que requis par votre système de microscope multi-photons.

  3. Deuxième génération d'harmoniques (SHG) dans les protéines fibreuses hautement ordonné (collagène et myosine) produit un signal à la moitié de la longueur d'onde du laser d'excitation. Nous utilisons une excitation à 900 nm, conduisant à SHG à 450 nm, qui peuvent être visualisées en utilisant les "bleus" canal du microscope. SHG génération est un non-linéaires (à deux photons) processus, et fournit ainsi une optique "sectionner" effet similaire à celui de l'excitation à deux photons de fluorescence. Le rendement de pointe de SHG se produit lorsque les fibrilles sont perpendiculaires au laser, tandis que les fibrilles qui s'exécutent en parallèle ne sont pas visualisées. 1

  4. Repérez une zone d'imagerie bonne avec beaucoup de cellules, définissez votre zone d'acquisition de telle sorte que la majorité des cellules sont au centre d'imagerie et de commencer. Remarque: Dans les réactions DTH, les cellules T et des infiltrats de cellules d'autres se trouvent souvent à se concentrer ensemble tandis que d'autres zones sont dépourvues d'infiltrer les cellules 2. Par conséquent, il peut prendre un certain temps à chercher le tissu pour trouver la meilleure zone de l'image.

  5. Vérifier la viabilité des cellules en évaluant la vitesse et de la polarité cellulaire lors de l'imagerie. Utilisez la puissance plus bas au laser qui fournit une qualité d'image acceptable pour assurer un minimum de photo-dommages.

  6. Swap dans une préparation de nouveaux tissus, au besoin.

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References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

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