Imaging Effector geheugen T-cellen in het oor na inductie van Adoptieve DTH

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier laten we zien een methode voor het induceren en het opnemen van de voortgang van een vertraagde type-overgevoeligheid (DTH) reactie in de rat oor. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van de voorbereiding van de rat oor weefsel voor twee-foton beeldvorming van de effector / geheugen T-cel-respons.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vertraagde type overgevoeligheid (DTH) is een immuunreactie waarbij de belangrijkste spelers zijn CCR7 - effector / geheugen T-lymfocyten. Hier tonen we een methode voor het induceren en het opnemen van de voortgang van een DTH-reactie in de rat oor. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van de voorbereiding van de rat oor weefsel voor twee-foton beeldvorming van de CCR7 - effector / memory T-cel-respons.

Een adoptie DTH wordt geïnduceerd door de intraperitoneale injectie van GFP-gelabelde Ova-specifieke CCR7 - effector / memory T-cellijn (Beeton, C J. Gevisualiseerde Experimenten, Issue 8). Cellen worden dan toegestaan ​​om in de rat equilibreren gedurende 48 uur vóór de uitdaging door het injecteren van een oor met een zoutoplossing (controle oor) en de andere met een 1:1 mix van eicellen en Ova geconjugeerd met Texas-Rood (Ova-TR) naar visualisatie toe van de ingezeten antigeen-presenterende cellen.

We beschrijven een methode van het weefsel voorbereiding nuttig zijn voor beeldvorming van de beweeglijkheid van de cellen in de diepe dermale laag tijdens een immuunrespons, in combinatie met visualisatie van collageen vezels door tweede harmonische generatie. Oor weefsel wordt gesneden in 5 x 5 mm vierkantjes (iets groter is beter) en gemonteerd op kunststof dekglaasjes met behulp van Vetbond ™, die vervolgens worden beveiligd met siliconenvet in een imaging kamer en superfused door zuurstof-borrelen weefselkweek medium bij 37 ° C .

Protocol

Inductie van Adoptieve DTH

Zie Jove artikel: Inductie en Monitoring van Adoptieve vertraagd-type overgevoeligheid bij ratten
Christine Beeton, George K. Chandy
Afdeling Fysiologie en Biofysica, University of California, Irvine
J. Gevisualiseerde Experimenten, Issue 8

Hier hebben we gewijzigd dit protocol door gebruik te maken antigeen (ovalbumine) geconjugeerd aan Texas-Rood in een 1:1 verhouding met niet-gelabelde antigeen te zorgen voor visualisatie van fagocytaire antigeen-presenterende cellen.

Oor Tissue Oogst

  1. Euthanaseren de rat op de gewenste tijd-punt door de procedures beschreven in het goedgekeurde dier protocol. Hier gebruiken we een overdosis van het verdovingsmiddel, isofluraan. Dit gebeurt in een gesloten container bevindt zich in een goed geventileerde kap. Zorg ervoor dat het dier dood is door een onthoofding van door het openen van de borstholte en snijden het hart.

  2. Met grote schaar te verwijderen het oor met een enkele cut, zo dicht mogelijk bij het lichaam van het dier mogelijk te maken (figuur 1).

    Figure_1.jpg
    Figuur 1. Verwijdering van de rat oor

  3. Plaats het oor in een 15 ml conische buis met ~ 10 ml ijskoud 1x PBS of RPMI-1640. Houd de weefselmonsters op ijs totdat u klaar bent om het weefsel te bereiden voor de beeldvorming.

  4. Het imago van de weefsel zo snel mogelijk, we vinden wel dat 1 tot 2 uur op het ijs geen merkbaar effect op de celbeweeglijkheid heeft in het weefsel ten opzichte van weefsel geoogst en direct afgebeeld.

Tissue Voorbereiding voor Imaging

I. Verwijdering van epidermale en dermale laag

* Opmerking: De diepe dermale laag moeten worden gehouden intact. Als dit juist gebeurt grote bloedvaten blijven intact en het kraakbeen van het oor niet worden blootgesteld. Dit is een moeilijke techniek, vooral als er geen ontsteking (controle condities) en het is nuttig het gebruik van een microscoop ontleden.

  1. Plaats zowel het weefsel en de media uit de conische buis in een 10 cm weefselkweek schotel.

  2. Met handschoenen aan te houden van de rat oor zachtjes op het puntje van het oor (distale) met de dorsale zijde van het oor naar boven gericht (figuur 2).

    Figure_2.jpg
    Figuur 2. Trim vacht uit het oor

  3. Met uw duim op de top van het oor, gestage het weefsel tijdens het gebruik van de punt van de gesloten Dumont # 5 schaar om de dermis te scheiden van de diepe dermis. Als alternatief, wanneer de rand van het oor heeft een overstek van huid / diepe dermis, kan dit worden begrepen met een pincet en voorzichtig getrokken om dit te scheiden van het weefsel onder (figuur 3).

    Figure_3.jpg
    Figuur 3. Het verwijderen van de bovenste dermis

  4. Zodra een klein deel van de huid is gescheiden van het onderliggende weefsel, herhaalt u de scheiding stappen als alternatief met een schaar te snijden tussen de dermale lagen en een tang om voorzichtig te verwijderen en trek het losgekomen huid.

  5. Expose een 5 x 5 mm of groter gebied van het oor weefsel dat ten minste 3 mm van de eerste plaats van antigeen injectie (figuur 4).

    Figure_4.jpg
    Figuur 4. Weefsel bloot voor beeldvorming

II. Het beveiligen van Tissue aan de Imaging Stage

  1. Knip een plastic hoesje slip tot een formaat iets groter is dan bereid weefsel.

  2. Verdeel een dunne laag van 3M Vetbond ™ weefsel-safe lijm over de hele dia.

  3. Pak de hoek van de voorbereide weefsel (waar je waarschijnlijk niet om de afbeelding), te verwijderen uit de media, en dep de onderkant van het weefsel op de lens van papier of Kym veeg om overtollige media te verwijderen.

  4. Raak de rand van het weefsel om de lijm overdekte glijbaan (de Vetbond hardt direct op nat weefsel). Voorzichtig vlak stuk het weefsel, met de andere kant als laatste aan de Slide Touch (figuur 5)

    Figure_5.jpg
    Figuur 5. Mount weefsel hoes

  5. Cure de Vetbond ™ door het omkeren van het weefselmonster / dia en dompelen in een reservoir van media zodanig dat het weefsel en schuif zijn gezicht naar beneden en ongeveer op een hoek van 45 graden. Houdt het weefsel op zijn kop in een hoek helpt om overtollige lijm te voorkomen dat genezen op de blootgestelde weefsel oppervlak. Lijm op het oppervlak van het weefsel zal blokkeren van de laser (Figuur 6).

    Figure_6.jpg
    Figuur 6. Cure vetbond weefsel glue door dompelen in de media

    Opmerking: Stappen 2-5 mei een beetje oefening nemen de knie te krijgen. Probeer het oefenen met weggegooid of extra weefsel stukken voordat voor de eerste keer.

  6. Dep een kleine hoeveelheid siliconenvet op de bodem van de dia.

  7. Plaats de dia in de perfusie kamer. Zorg ervoor dat de perfusie media stroomt, 37 ° C en zuurstof voor het toevoegen van weefsel. Druk licht op de randen van de glijbaan het maken van een afdichting met het silicium vet tussen de onderkant van de perfusie kamer en de plastic cover slip.

III. Two-Photon Imaging

  1. Met behulp van bright-field doorgelaten licht, richten zich op de bovenkant van het weefsel. Schakel alle lichten.

  2. Schakel de laser, PMT's zoals vereist door de multi-foton microscoop systeem.

  3. Tweede harmonische generatie (SHG) in zeer besteld vezelachtige eiwitten (collageen en myosine) geeft een signaal op de helft van de golflengte van de laser excitatie. We maken gebruik van excitatie bij 900 nm, wat leidt tot SHG bij 450 nm kan worden gevisualiseerd met behulp van de "blauwe" kanaal van de microscoop. SHG generatie is een niet-lineair (twee-foton) proces, en dus zorgt voor een optische "snijden"-effect vergelijkbaar met dat van twee-foton excitatie van de fluorescentie. De maximale efficiëntie van de SHG treedt op wanneer de fibrillen loodrecht op de laser, terwijl de fibrillen die parallel lopen zullen niet worden gevisualiseerd. 1

  4. Zoek een goede beeldvorming gebied met veel cellen, stelt u uw acquisitie omgeving zodanig dat de meerderheid van de cellen in het centrum en start beeldvorming. Opmerking: In DTH reacties, T-cellen en andere cellen infiltreert zijn vaak te vinden om samen te worden geconcentreerd terwijl tegelijkertijd andere gebieden zijn verstoken van infiltrerende cellen 2. Daarom kan het enige tijd aan het zoeken het weefsel om de beste omgeving om de afbeelding te vinden.

  5. Controleer op levensvatbaarheid van de cellen door het beoordelen van cel-snelheid en de polariteit tijdens de beeldvorming. Gebruik de laagste laser kracht die acceptabele beeldkwaliteit biedt om ervoor te zorgen minimale foto-schade.

  6. Swap in een nieuw weefsel preparaat als dat nodig is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics