Imágenes de las células efectoras T de memoria en el oído después de la inducción de DTH adoptivos

Biology

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Summary

Aquí se demuestra un método para inducir y registrar el progreso de un retraso de tipo de hipersensibilidad (DTH) la reacción en el oído de la rata. Esto es seguido por una demostración de la elaboración de tejidos de ratas oído para la imagen de dos fotones de la respuesta del efector / memoria de células T.

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Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

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Abstract

Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inmune en el cual los principales actores son CCR7 - efectoras / memoria los linfocitos T. En este caso, se demuestra un método para inducir y registrar el progreso de una reacción de DTH en el oído de la rata. Esto es seguido por una demostración de la elaboración de tejidos de ratas oído para la imagen de dos fotones de la CCR7 - respuesta efectoras / memoria de células T.

Un DTH adoptivos es inducida por la inyección intraperitoneal de las buenas prácticas agrarias con etiqueta específica OVA-CCR7 - línea efectoras / memoria de células T (Beeton, J. C experimentos visualizados, número 8). Células se dejaron equilibrar en la rata durante 48 horas antes de la exposición mediante la inyección de una oreja con una solución salina (control del oído) y el otro con una mezcla de 1:1 de conjugado OVA y OVA de Texas-Red (Ova-TR) para permitir la visualización residente de células presentadoras de antígeno.

Se describe un método de preparación de tejidos útiles para obtener imágenes de la motilidad de las células en la capa de la dermis profunda durante una respuesta inmune, en combinación con la visualización de las fibras de colágeno por la generación del segundo armónico. Tejido del oído se corta en cuadrados de 5 mm x 5 (ligeramente más grande es mejor) y montado sobre cubreobjetos de plástico con Vetbond ™, que luego se fija con grasa de silicona en una cámara de imágenes y superfused por burbujas de oxígeno medio de cultivo de tejidos a 37 ° C .

Protocol

La inducción de DTH adoptivos

Por favor, consulte el artículo Jove: Inducción y Seguimiento de la Adopción de hipersensibilidad retardada en ratas
Christine Beeton, George K. Chandy
Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California, Irvine
J. visualizados experimentos, Número 8

Aquí, hemos modificado este protocolo mediante el antígeno (ovoalbúmina) conjugado en Texas-Red en una proporción 1:1 con antígeno sin marcar para permitir la visualización de la fagocitosis de las células presentadoras de antígeno.

Cosecha del tejido del oído

  1. La eutanasia a la rata en el tiempo deseado de puntos por los procedimientos descritos en el protocolo de animales aprobada. Aquí, nosotros usamos una sobredosis de anestésico, el isoflurano. Esto se hace en un recipiente cerrado ubicado dentro de una campana bien ventilada. Asegúrese de que el animal está muerto, ya sea mediante la apertura de la decapitación de la cavidad torácica y cortar el corazón.

  2. Con la tijera grande quitar la oreja con un solo corte, tan cerca del cuerpo del animal como sea posible (Figura 1).

    Figure_1.jpg
    Figura 1. La eliminación de la oreja de rata

  3. Colocar el oído en un tubo cónico de 15 ml contiene aproximadamente 10 ml de helado de 1x PBS o RPMI 1640. Mantenga las muestras de tejido en el hielo hasta que esté listo para preparar el tejido para obtener imágenes.

  4. La imagen del tejido, tan pronto como sea posible, nos encontramos, sin embargo, que 1 a 2 horas sobre el hielo no tiene ningún efecto discernible sobre la motilidad celular en el tejido en comparación con los tejidos cosechados y la imagen de inmediato.

Preparación para el tejido de imágenes

I. La eliminación de la capa epidérmica y dérmica

* Nota: La capa dérmica profunda debe mantenerse intacto. Si se hace correctamente los grandes vasos sanguíneos se mantendrá intacto y el cartílago de la oreja no serán expuestos. Esta es una técnica difícil, especialmente cuando no hay inflamación (las condiciones de control) y es útil usar un microscopio de disección.

  1. Lugar tanto en el tejido y los medios de comunicación desde el tubo cónico en una placa de cultivo de 10 cm de tejido.

  2. Con las manos enguantadas mantener el oído rata suavemente en la punta de la oreja (distal) con la cara dorsal de la oreja hacia arriba (Figura 2).

    Figure_2.jpg
    Figura 2. Recorte de piel de la oreja

  3. Con el pulgar en la parte superior de la oreja, constante, mientras que el tejido con la punta de cierre Dumont # 5 tijeras para separar la dermis de la dermis profunda. Alternativamente, si el borde de la oreja tiene un saliente de la piel / dermis profunda, esto puede ser captado con unas pinzas y se saca suavemente para separar el tejido por debajo de la (Figura 3).

    Figure_3.jpg
    Figura 3. La eliminación de la dermis superior

  4. Una vez que una pequeña área de piel ha sido separada del tejido subyacente, repita los pasos de separación, alternativamente, utilizando tijeras para cortar entre las capas de la dermis y pinzas para quitar con cuidado y retire la piel desalojados.

  5. Exponer un 5 x 5 mm o mayor área de tejido del oído que es por lo menos 3 mm desde el sitio inicial de la inyección de antígeno (Figura 4).

    Figure_4.jpg
    Figura 4. Tejido expuesto de imágenes

II. Asegurar el tejido en el escenario de imágenes

  1. Cortar una hoja de cubierta de plástico de un tamaño ligeramente mayor que el tejido preparado.

  2. Extender una fina capa de 3M ™ Vetbond tejido de seguridad de cola a través de la diapositiva.

  3. Sujete la esquina del tejido preparado (en la que no es probable que la imagen), retirar de los medios de comunicación, y quite la parte inferior del tejido en el papel lente o Kym borrar para eliminar el exceso de material.

  4. Tocar el borde del tejido a la diapositiva cola cubierta (el cura Vetbond inmediatamente en el tejido húmedo). Estira suavemente el tejido plano, con el extremo opuesto está el último en tocar la diapositiva (Figura 5)

    Figure_5.jpg
    Figura 5. Monte tejido para cubrir deslizamiento

  5. Curar la ™ Vetbond invirtiendo la muestra de tejido / diapositivas y la introduce en un depósito de los medios de comunicación de tal manera que el tejido y se deslizan hacia abajo y son más o menos en un ángulo de 45 grados. Sosteniendo el tejido al revés en un ángulo ayuda a prevenir el exceso de pegamento de secado en la superficie de los tejidos expuestos. Pegamento en la superficie del tejido se bloqueará el láser (Figura 6).

    Figure_6.jpg
    Figura 6. Cure vetbond tejido glue por inmersión en los medios de comunicación

    Nota: los pasos 2-5 puede tomar un poco de práctica para dominar. Trate de practicar con trozos de tejido desechado o más antes de intentar por primera vez.

  6. Aplique una pequeña cantidad de grasa de silicona en la parte inferior de la diapositiva.

  7. Colocar la placa en la cámara de perfusión. Asegúrese de que los medios de comunicación de perfusión está fluyendo, 37 ° C y oxigenada antes de añadir tejido. Presione suavemente los bordes de la diapositiva haciendo un sello con la grasa de silicona entre la parte inferior de la cámara de perfusión y la hoja de la cubierta de plástico.

III. De dos fotones de imágenes

  1. El uso de campo brillante luz transmitida, se centran en la parte superior del tejido. Apague todas las luces.

  2. Encienda el láser, PMT según lo requiera el sistema de microscopía multi-fotón.

  3. Generación de segundo armónico (SHG) en las proteínas fibrosas altamente ordenadas (colágeno y miosina) produce una señal en la mitad de la longitud de onda del láser de excitación. Nosotros usamos la excitación a 900 nm, que lleva a los grupos de autoayuda a 450 nm, que pueden ser visualizados a través del "azul", el canal del microscopio. SHG generación es un no-lineales (de dos fotones) de procesos, y por lo tanto ofrece una óptica de "corte" efecto similar al de la excitación de dos fotones de fluorescencia. La máxima eficiencia de los grupos de autoayuda se produce cuando las fibras son perpendiculares a la láser, mientras que las fibrillas que se ejecutan en paralelo no se visualiza 1.

  4. Localizar un área de imagen buena con un montón de células, establece el área de adquisición de tal manera que la mayoría de las células están en el centro y comenzar a imágenes. Nota: En las reacciones de DTH, las células T y se infiltra en otras células se encuentran a menudo se concentran en conjunto, mientras que otras áreas están desprovistas de la infiltración de células 2. Por lo tanto, puede tomar algún tiempo buscando el tejido para encontrar la mejor zona de la imagen.

  5. Compruebe que la viabilidad celular mediante la evaluación de la velocidad y la polaridad celular durante la exploración. Usa el poder más de láser que proporciona una calidad de imagen aceptable para asegurar un mínimo de foto-daño.

  6. Swap en una preparación de tejido nuevo necesario.

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References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

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