Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تضخيم إشارة التيراميد للتلطيخ المناعي للفسفرة المعتمدة على ZBP1 ل RIPK3 و MLKL بعد عدوى HSV-1 في الخلايا البشرية

Published: October 20, 2022 doi: 10.3791/64332
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Summary

يتيح تضخيم إشارة التيراميد أثناء تلطيخ الفلورسنت المناعي الكشف الحساس عن RIPK3 و MLKL المفسفر أثناء التنخر الناجم عن ZBP1 بعد الإصابة بفيروس HSV-1.

Abstract

يعد كيناز بروتين سيرين / ثريونين المتفاعل مع مستقبلات الكيناز 3 (RIPK3) ومجاله المختلط المختلط (MLKL) من المنظمين المهمين لمرض التنخر ، وهو شكل التهابي من موت الخلايا له وظائف مهمة مضادة للفيروسات. الفسفرة الذاتية ل RIPK3 تحفز الفسفرة وتفعيل بروتين الجلاد المكون للمسام من necroptosis MLKL. يؤدي الاتجار وقلة الغلومير من MLKL المفسفرة في غشاء الخلية إلى تحلل الخلية ، وهو سمة من سمات موت الخلايا النخرية. يتم تنشيط مستشعر الحمض النووي ZBP1 عن طريق الارتباط بالحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل على شكل Z (Z-RNA) بعد الإصابة بفيروسات الحمض النووي الريبي والحمض النووي. يقيد تنشيط ZBP1 الإصابة بالفيروس عن طريق إحداث موت الخلايا المنظم ، بما في ذلك التنخر ، للخلايا المضيفة المصابة. يسمح الفحص المجهري المناعي بتصور خطوات إشارات مختلفة في اتجاه مجرى التنخر بوساطة ZBP1 على أساس كل خلية. ومع ذلك ، فإن حساسية الفحص المجهري الفلوري القياسي ، باستخدام الأجسام المضادة الحالية المتاحة تجاريا ضد RIPK3 و MLKL البشري ، تمنع التصوير القابل للتكرار لهذه العلامات. هنا ، نصف إجراء تلطيخ محسن لسيرين (S) المفسفر RIPK3 (S227) و MLKL (S358) في خلايا HT-29 البشرية المصابة بفيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1). يسمح إدراج خطوة تضخيم إشارة التيراميد (TSA) في بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي بالكشف المحدد عن RIPK3 المفسفر S227. علاوة على ذلك ، يزيد TSA بشكل كبير من حساسية الكشف عن MLKL المفسفر S358. معا ، تتيح هذه الطريقة تصور هذين الحدثين الحرجين للإشارات أثناء تحريض التنخر الناجم عن ZBP1.

Introduction

تفاعل مستقبلات سيرين / ثريونين بروتين كيناز 3 (RIPK3) ومجال كيناز السلالة المختلطة (MLKL) هي منظمات مركزية لموت الخلايا النخرية 1,2. Necroptosis هو شكل من أشكال lytic والتهابات من موت الخلايا المنظم تشارك في المناعة المضادة للفيروسات والتهاب ذاتي. يؤدي تنخر الخلايا المصابة بالفيروس إلى إيقاف تكاثر الفيروس على الفور. يؤدي تحلل الخلايا بعد تحريض التنخر أيضا إلى إطلاق أنماط جزيئية مرتبطة بالضرر ، والتي تحفز المناعة المضادة للفيروسات 3,4. يبدأ Necroptosis من خلال تنشيط RIPK3 بعد تفاعلات تفاعل RIP المتجانسة (RHIM) بوساطة واحد من ثلاثة جزيئات تنشيط المنبع: RIPK1 (عند مشاركة مستقبلات TNF 1 [TNFR1]) ، β الإنترفيرون الذي يحتوي على محول يحتوي على مجال TIR (TRIF ؛ عند اشتباك المستقبلات الشبيهة بالرقم 3 و 4) ، أو مستشعر الحمض النووي المضاد للفيروسات Z-DNA بروتين ملزم 1 (ZBP1) 1,2 . تستمر إشارات Necroptosis من خلال سلسلة من أحداث الفسفرة بدءا من الفسفرة الذاتية ل RIPK3. تعد الفسفرة الذاتية ل RIPK3 البشري في سيرين (S) 227 داخل مجال كيناز الخاص بها شرطا أساسيا للنخر من خلال تمكين التفاعل مع MLKL وتستخدم بشكل شائع كعلامة كيميائية حيوية لتنشيط RIPK3 البشري وموت الخلايا النخرية 1,5. بمجرد تنشيطه ، يقوم RIPK3 بفسفرة حلقة تنشيط MLKL عند ثريونين (T) 357 و S3581. يؤدي هذا إلى تغيير في تشكيل MLKL ، مما يؤدي إلى تعرض مجال حزمة الحلزون الأربعة N-terminal. ثم يقوم MLKL بقليل القلة والاتجار إلى غشاء الخلية حيث يشكل مسام من خلال إدخال الحزم الحلزونية الأربعة المكشوفة في طبقة الدهون المزدوجة ، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلية 2,6.

ZBP1 هو مستشعر حمض نووي مضاد للفيروسات يتعرف على الأحماض النووية اليسرى على شكل Z بما في ذلك الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في تشكيل Z (Z-RNA). يحدث ارتباط Z-RNA عبر نطاقين Zα متمركزين في النهاية N ل ZBP1. يعتقد أن Z-RNA المتراكم أثناء الإصابة بفيروس الحمض النووي الريبي والحمض النووي يشرك مباشرة ZBP1 7,8. يقوم ZBP1 المنشط بتجنيد RIPK3 من خلال RHIMs المركزية الخاصة به ويحفز موت الخلايا المنظم ، بما في ذلك التنخر 9,10. اعتمدت الفيروسات العديد من آليات الهروب لمواجهة تنخر الخلية المضيفة11 الناجم عن ZBP1. على سبيل المثال ، تحتوي الوحدة الفرعية 1 لاختزال الريبونوكليوتيد 1 لفيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) ، والمعروفة باسم ICP6 والمشفرة بواسطة UL39 ، على RHIM في نهايتها N التي تتداخل مع تنشيط RIPK3 بوساطة ZBP1 في الخلايا البشرية12،13،14،15. لا يقيد ZBP1 تكاثر الفيروس فحسب ، بل أظهرت دراسات الفئران أن تنشيط ZBP1 يسبب أمراضا التهابية ويحفز مناعة السرطان16،17،18،19،20،21. وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي تكتشف أحداث الإشارات التي تحدث أثناء التنخر الناجم عن ZBP1 في الخلايا البشرية هي قيمة لتقييم دور ZBP1 في هذه العمليات.

تم تطوير تضخيم إشارة التيراميد (TSA) ، الذي يشار إليه أيضا باسم ترسيب المراسل المحفز (CARD) ، لتحسين حد الكشف ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في المقايسات المناعية القائمة على الأجسام المضادة. أثناء TSA ، يمكن استخدام أي جسم مضاد أولي للكشف عن المستضد محل الاهتمام. يحفز بيروكسيديز الفجل (HRP) ، إلى جانب جسم مضاد ثانوي ، التراكم المحلي لجذور التيراميد البيوتينيلات في وجود بيروكسيد الهيدروجين. ثم تتفاعل جذور البيوتين تيراميد المنشطة هذه مع بقايا التيروزين القريبة لتشكيل روابط تساهمية. تشمل ركائز التيراميد-البيوتين المحتملة المستضد نفسه ، والأجسام المضادة الأولية والثانوية ، والبروتينات المجاورة. وبالتالي ، في حين أن TSA يحسن بشكل كبير من حساسية الفحص ، يتم فقد بعض الدقة المكانية. في الخطوة الأخيرة ، يتم الكشف عن جزيئات البيوتين باستخدام الستربتافيدين المسمى بالفلورسنت. يودع تفاعل HRP العديد من جزيئات تيراميد-بيوتين على المستضد محل الاهتمام أو بالقرب منه. هذا يزيد بشكل كبير من عدد مواقع ربط الستربتافيدين فلوروكروم ، وبالتالي تضخيم حساسية الفحص بشكل كبير (الشكل 1). بدلا من ذلك ، يمكن أن يقترن التيراميد مباشرة بالفلوروكروم ، مما يلغي الحاجة إلى الفلوروفورات المقترنة بالستربتافيدين. كانت الكيمياء الهيستولوجية المناعية للبروتين والتهجين في الموقع DNA / RNA من بين الطرق الأولى التي تم من خلالها استخدام TSA لتحسين شدة الإشارة22,23. في الآونة الأخيرة ، تم دمج TSA مع قياس التدفق الخلوي داخل الخلايا24 وقياس الطيف الكتلي25.

هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن سيرين 227 RIPK3 البشري المفسفر (p-RIPK3 [S227]) و MLKL البشري المفسفر (p-MLKL [S358]) عند تنشيط ZBP1 بواسطة عدوى HSV-1 باستخدام الفحص المجهري المناعي. نحن نستخدم خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري HT-29 الحساس للنخر والذي تم تحويله للتعبير بثبات عن ZBP1 البشري. أصيبت هذه الخلايا بسلالة HSV-1 تعبر عن بروتين ICP6 الطافر (HSV-1 ICP6mutRHIM) حيث تم استبدال أربعة أحماض أمينية أساسية داخل RHIM الفيروسي (VQCG) بألانين (AAAA) ، مما يجعل ICP6 غير قادر على منع التنخر بوساطة ZBP113،14،15. للتغلب على مشكلة انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء للأجسام المضادة المتاحة تجاريا حاليا والموجهة ضد p-RIPK3 و p-MLKL في التلوين المناعي26 ، نقوم بإجراء خطوة تضخيم إشارة التيراميد (TSA) (الشكل 1) ، مما يؤدي إلى الكشف القوي عن p-RIPK3 البشري (S227) ويحسن حساسية الكشف عن p-MLKL البشري (S358) بترتيب من حيث الحجم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد تيراميد البيوتينيل

  1. تحضير تيراميد البيوتينيل بدءا من البيوتين تيراميد. لعمل محلول مخزون 10 مللي متر ، قم بإذابة 3.6 مجم من البيوتين تيراميد في 1 مل من DMSO. قم بتخزين المنتج المذاب في حصص عند -20 درجة مئوية للحفاظ على الجودة.

2. الحفاظ على خلايا HT-29 في الثقافة

ملاحظة: تم إنشاء HT-29 المعرب عن ZBP1 عن طريق النقل باستخدام متجه27 بترميز ZBP1 البشري.

  1. احتفظ بخلايا HT-29 المعبرة عن ZBP1 في وسط 5A من McCoy مع L-glutamine و sodium-pyruvate و 10٪ مصل بقري جنيني (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم الوسط الكامل) واحتفظ به في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. من الناحية المثالية ، استخدم خلايا ذات رقم مرور منخفض (أقل من 10). اترك الخلايا تتعافى لمدة 5 أيام على الأقل بعد دورة الذوبان قبل بدء التجربة.
  2. لفصل الخلايا عن قارورة المزرعة ، قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا ب 5 مل من PBS (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية). بعد ذلك ، أضف الكمية المناسبة من التربسين / EDTA (0.05٪ تربسين و 0.032٪ EDTA ، على التوالي ، مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) إلى الخلايا (2 مل لدورق T75 ، 3 مل لدورق T175).
  3. احتضان الخلايا باستخدام التربسين / EDTA لمدة تصل إلى 10 دقائق في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، انقر فوق القارورة وتحقق بصريا مما إذا كانت الخلايا منفصلة عن القارورة باستخدام مجهر مع تكبير موضوعي 4x-20x.
  4. إذا لم يتم فصل الخلايا بالكامل ، قم بحضينها لمدة 5 دقائق أخرى عند 37 درجة مئوية. عند فصل الخلايا، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 6 مل من الوسط الكامل إلى القارورة.
  5. اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 15 مل. عد الخلايا باستخدام صبغة زرقاء تريبان لتقييم الجدوى ؛ يوصى بتخفيف 1: 5. تابع التجربة فقط إذا تجاوزت صلاحية الخلايا 90٪.

3. بدء التجربة والبذر وتحفيز الخلايا

  1. قم بزرع 90000 خلية معبرة عن ZBP1 HT-29 في وسط كامل في لوحة بئر بمساحة سطح 1 سم² تسمح بإجراء فحص مجهري متطور. استخدم حجما نهائيا يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر.
  2. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ضع في اعتبارك أن بعض الآبار الإضافية تحتاج إلى بذر لضوابط التلوين ، والتي يتم شرحها بمزيد من التفصيل في الخطوة 5.6.
  3. عندما تصل الخلايا إلى 70٪ -80٪ التقاء ، أضف حافزا محفزا للنخر إلى الخلايا. هنا ، أصيبت الخلايا ب HSV-1 ICP6mutRHIM (تعدد العدوى [MOI] من 5 ، والتي تعرف بأنها وحدات تشكيل البلاك (pfu) مقسومة على عدد الخلايا ؛ تم تحديد كمية pfu باستخدام مقايسة البلاك على خلايا Vero) لمدة 6 ساعات أو 8 ساعات أو 10 ساعات.
  4. كعنصر تحكم إيجابي في تحريض التنخر ، قم بتحفيز الخلايا لمدة 4 ساعات باستخدام كوكتيل يحفز التنخر يحتوي على 30 نانوغرام / مل TNF ، و 20 ميكرومتر من مثبط عموم الكاسباز zVAD-fmk ، و 5 ميكرومتر من SMAC محاكاة BV6.
  5. كعنصر تحكم سلبي في تلطيخ p-RIPK3 (S227) ، قم بتضمين GSK'840 (1 ميكرومتر) لمنع نشاط كيناز RIPK3 ومنع الفسفرة الذاتية ل S227. من الناحية المثالية ، أضف المانع في حالة غير معالجة وبعد تحفيز التنخر. يمكن إضافة المانع في وقت واحد مع العدوى الفيروسية.
  6. تحضير المحفزات في وسط كامل ، مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. استخدم حجما نهائيا يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر لجميع المحفزات.

4. إصلاح الخلايا

  1. قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من 1x PBS. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولتر من 4٪ PFA (متوازن بالفعل في درجة حرارة الغرفة) إلى الخلايا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم خلايا تنفصل بسهولة ، فيمكن تحسين تثبيت الخلايا على النحو التالي. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط من البئر ، لذلك يبقى حجم 100 ميكرولتر على اللوحة. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ PFA إلى الخلايا. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط / المثبت من الآبار واستبدله ب 150 ميكرولتر من 4٪ PFA. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة لضمان التثبيت الكامل للخلايا.
  2. بعد التثبيت ، قم بإزالة 4٪ PFA واغسل الخلايا 3x مع 200 ميكرولتر من 1x PBS. يمكن تخزين العينات في فائض (>200 ميكرولتر) من 1x PBS عند 4 درجات مئوية طوال الليل حتى مزيد من المعالجة.

5. النفاذية والتلوين الأولي

  1. قم بإزالة PBS وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية (0.5٪ Triton X-100 في PBS). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية ، وبعد ذلك ، اغسل الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان غرفة التصوير مع مخزن مؤقت للغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل (20-30 حركة هزازة في الدقيقة).
  3. لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الأولية ، أضف 100 ميكرولتر من وسط الحجب واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. بدلا من ذلك ، يمكن استبدال خطوة الحظر هذه بالحظر بنسبة 3٪ BSA ، 0.1٪ Triton-X-100 في PBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. اغسل الآبار 3x مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
  5. بعد إزالة المخزن المؤقت للغسيل ، أضف الأجسام المضادة الأولية إلى غرفة التصوير واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استخدم حجما نهائيا يبلغ 100 ميكرولتر لتغطية البئر. أثناء الحضانة الليلية عند 4 درجات مئوية ، لا تضع غرفة التصوير على شاكر مختبر مائل.
    ملاحظة: يشترك Anti-p-MLKL (S358 ؛ التخفيف: 1: 200) ومضاد p-RIPK3 (S227 ؛ التخفيف: 1: 200) في الأرانب كنوع مضيف ، وبالتالي ، لا ينبغي دمجهما في بئر واحد. لمراقبة العدوى الفيروسية، اجمع جسما مضادا أوليا ضد بروتين فيروسي من اختيارك مع p-MLKL (S358) أو p-RIPK3 (S227). هنا ، أصيبت الخلايا بعدوى HSV-1 متبوعة بتلطيخ ICP0 (التخفيف: 1:50 ، الأنواع المضيفة: الفأر).
  6. ضع في اعتبارك ضوابط التلوين اللازمة في هذه المرحلة. قم دائما بتضمين حالة عدم وجود جسم مضاد أساسي لتصور الخلفية المحتملة لخطوة تضخيم TSA لتعيين عتبة التقنيع (انظر الخطوة 9).
    ملاحظة: في حالة وجود بروتوكول تلطيخ مشترك (على سبيل المثال ، الجمع بين p-MLKL [S358] أو p-RIPK3 [S227] مع جسم مضاد ضد بروتين فيروسي) ، استخدم البقع المفردة أيضا. يعد استخدام البقع المفردة أمرا مهما لتصحيح إشارة النزيف المحتملة في قنوات التصوير الأخرى.

6. تضخيم إشارة تيراميد (TSA)

  1. قم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الأساسي واغسل الآبار 3x مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
  2. قم بإزالة مخزن الغسيل المؤقت وأضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المسمى HRP للتعرف على أنواع الأجسام المضادة الأولية التي تحتاج إلى تضخيم. لتضخيم إشارة p-RIPK3 (S227) أو p-MLKL (S358) ، أضف 100 ميكرولتر من مضاد الأرنب HRP واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
    ملاحظة: سيتم تضخيم p-MLKL (S358) أو p-RIPK3 (S227) فقط. سيتم تصور تلطيخ البروتين الفيروسي باستخدام طريقة تلطيخ غير مباشرة قياسية.
  3. بعد ذلك ، اغسل الآبار 3x ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
  4. في الخطوات التالية ، أضف التيراميد البيوتينيل إلى اللوحة المجهرية. باستخدام مجموعة HRP المقترنة بالأجسام المضادة الثانوية ، سيؤدي التفاعل الأنزيمي إلى تكوين جذور تيراميد على مقربة من الهدف الأساسي (هنا ، p-MLKL [S358] أو p-RIPK3 [S227]).
  5. لتنشيط النشاط الأنزيمي ل HRP ، أضف ركيزة مؤكسدة مع التيراميد البيوتينيل. لتحقيق ذلك ، استكمل المخزن المؤقت TSA (0.1 M حمض البوريك [درجة الحموضة 8.5]) مع 0.03 M H 2 O2؛ على وجه التحديد ، خذ 5 مل من المخزن المؤقت TSA وأضف 5 ميكرولتر من 30٪ H 2O2.
  6. الآن ، قم بتخفيف البيوتين تيراميد في المخزن المؤقت TSA المكمل H 2 O2الذي يتراوح من 1: 1,000 إلى 1: 20,000.
    ملاحظة: يجب تحسين عامل التخفيف للبيوتين-تيراميد لكل دفعة.
  7. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل من الآبار وأضف البيوتين تيراميد المخفف إلى الآبار إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على شاكر مختبر مائل.
  8. بعد ذلك ، اغسل الآبار 3x مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.

7. الفلوروفورات

ملاحظة: نظرا لأن إشارة الجسم المضاد الأساسي يتم تحويلها إلى مجموعة البيوتين ، يتم تصور p-MLKL (S358) و p-RIPK3 (S227) باستخدام الستربتافيدين المقترن بالفلوروفور (الفلوروفور 568 ، التخفيف: 1: 500). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تلطيخ النوى ب DAPI (5 ميكروغرام / مل). إذا تم تضمين بروتين فيروسي في بروتوكول التلطيخ ، فقم بتضمين جسم مضاد ثانوي مناسب يحمل علامة فلورسنت ضد الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي. في النتائج التمثيلية ، تم استخدام الماوس المضاد لبرنامج ICP0. كجسم مضاد ثانوي للماعز مضاد للفأر مقترن بالفلوروفور 633 (التخفيف: 1: 1,000).

  1. اصنع مزيج التلوين في محلول الغسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS) يحتوي على الأجسام المضادة والبقع المذكورة أعلاه. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل ، وأضف 100 ميكرولتر من مزيج التلوين ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر مختبر مائل. حافظ على غرفة التصوير محمية من الضوء من هذه الخطوة فصاعدا.
  2. بعد ذلك ، اغسل الآبار 2x باستخدام محلول غسيل (0.1٪ Triton X-100 في PBS). احتضان خطوات الغسيل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.
  3. أخيرا ، اشطف الآبار 2x باستخدام 1x PBS. تخزين العينات في فائض (> 200 ميكرولتر) من 1x PBS حتى التصوير. بدلا من ذلك ، اغمر العينات في وسط التركيب للحفاظ على التلطيخ. غرفة التصوير جاهزة الآن للتصور على مجهر متحد البؤر.

8. التصوير باستخدام مجهر متحد البؤر

  1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر والليزر قبل 10 دقائق على الأقل من التصوير.
  2. استخدم هدف الانغماس للحساسية. يفضل استخدام التكبير الموضوعي 40x أو 63x. قبل التصوير ، قم بتنظيف أهداف الغمر باستخدام منظف العدسات باستخدام كرات قطنية مناسبة. يمكن أن تؤدي الأهداف المتسخة (على سبيل المثال ، بسبب الغبار) إلى صور أقل جودة.
  3. ضع كمية زائدة من الزيت في قاع غرفة التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، أضف قطرة من الزيت على الهدف من الاختيار.
  4. ضع غرفة التصوير على المجهر. ابحث عن مجال التركيز البؤري باستخدام تلطيخ DAPI أو باستخدام التصوير الساطع. إذا لزم الأمر ، تحرك في جميع أنحاء غرفة التصوير لضمان الانتشار المناسب لزيت الغمر.
  5. قم بإعداد مسارات التصوير اللازمة على المجهر. اعتمادا على المجهر ، قد تختلف الخطوات التالية (الجدول 1).
    ملاحظة: عند إعداد مسارات التصوير ، قم ببرمجة المسارات بحيث يتم قياس التلوين النووي أخيرا. قد يساهم الليزر 405 نانومتر في التبييض الضوئي ، وبالتالي فقدان إشارة محددة في جميع القنوات.
  6. لتحليل خلية كاملة لوجود p-RIPK3 (S227) أو p-MLKL (S358) ، قم بقياس مكدسات z التي تمتد على ارتفاع الخلية. هنا ، تم تصنيع مداخن z من 40 شريحة كل 0.16 ميكرومتر ، مما أدى إلى نطاق 6.22 ميكرومتر.

المسار ليزر شعاع الخائن راووق
pRIPK3 (S227) / pMLKL (S358) 561 ميغا بايت -405 + BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
الجين الفيروسي: ICP0 633 ميغا بايت -405 + BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
النواة: DAPI 405 ميغا بايت -405 + BP 420-480 + BP 495-550
إم بي إس 488/561/633

الجدول 1: مسارات التصوير لتصور الخلية.

9. تحليل البيانات والقياس الكمي

  1. قم بتحميل الصور المجهرية إلى البرنامج. استخدم التركيز الموسع لتصور جميع معلومات z-stack في صورة 2D.
  2. بعد ذلك ، قم ببرمجة بروتوكول التحليل لاستخراج المعلومات التالية: عدد الخلايا لكل صورة ، ومجموع voxels التي تظهر p-RIPK3 (S227) + أو p-MLKL (S358) + تلطيخ. يمثل voxel حجما ثلاثي الأبعاد ، يعرف بأنه المكافئ ثلاثي الأبعاد للبكسل.
  3. لتحديد عدد الخلايا لكل صورة ، قم بتقسيم النواة. لتقليل الضوضاء في نتائج التجزئة ، أضف حدا على الحجم إلى التجزئة (>100 ميكرومتر مكعب). يمثل عدد النوى المجزأة عدد الخلايا في الصورة.
  4. لتحديد مقدار p-RIPK3 (S227) + أو p-MLKL (S358) + voxels، قم ببرمجة تجزئة قائمة على العتبة. اضبط العتبة بحيث لا يتم التقاط أي إشارة في صور عدم وجود جسم مضاد أساسي (NP).
  5. قم بتكييف العتبة باستخدام الصور من الحالة الوهمية غير المعالجة. لضمان الكشف الحساس عن زيادة الإشارة بسبب تحفيز التنخر ، قلل من التقاط فوكسل p-RIPK3 (S227) + أو p-MLKL (S358) + في ظروف وهمية عن طريق تعيين عتبة أعلى. تحقق دائما من بروتوكول التحليل المبرمج في عدة صور من الحالة الوهمية والعدوى الفيروسية المسببة للنخب.
  6. قم بتشغيل التحليل على جميع مجموعات الصور. قم بتصدير القياس الكمي للفوكسل وتجزئة النواة في ملف .txt لمزيد من المعالجة في برنامج جداول البيانات.
  7. قم بعمل جدول محوري للبيانات يوضح اسم الصورة ، والقياس الكمي للنواة ، ومجموع الفوكسل المكتشف.
  8. بعد ذلك ، قسم مجموع voxels الموجبة على عدد الخلايا في الصورة. ينتج عن هذا قيمة نسبية للفوكسل الموجب لكل خلية. لتصور زيادة الطي ، قسم القيمة النسبية ل p-RIPK3 (S227) + أو p-MLKL (S358) + voxels لكل خلية على متوسط الحالة غير المعالجة (وهمية).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إن الكشف المناعي عن فسفرة MLKL وخاصة فسفرة RIPK3 في الخلايا البشرية يمثل تحديا تقنيا26. نقدم هنا بروتوكول تلطيخ محسن ل p-RIPK3 البشري (S227) و p-MLKL (S358) عند تنشيط ZBP1. يتضمن البروتوكول خطوة TSA لتحسين حد الكشف وحساسية إشارات الفلورسنت. للتحقق من صحة الطريقة ، تم إجراء مقارنة جنبا إلى جنب بين التألق المناعي بوساطة TSA مع تلطيخ الفلورسنت القياسي غير المباشر لكل من p-RIPK3 (S227) و p-MLKL (S358).

أصيبت خلايا HT-29 التي تعبر عن ZBP1 البشري لمدة 9 ساعات بسلالة HSV-1 الطافرة ICP6 RHIM (HSV-1 ICP6mutRHIM) للحث على التنخر بوساطة ZBP1 وفسفرة RIPK3. تحمل سلالة HSV-1 ICP6mutRHIM طفرة VQCG إلى AAAA داخل ICP6 RHIM وهي غير قادرة على منع إشارة التنخر في اتجاه مجرى ZBP114,15. كما ورد سابقا26 ، لم يكن التألق المناعي غير المباشر القياسي حساسا بما يكفي لتصور فسفرة RIPK3 S227 مع الجسم المضاد الحالي المتاح تجاريا ، حتى عندما زادت قوة الليزر للمجهر متحد البؤر إلى 30٪ (الشكل 2 أ). في المقابل ، مكن إدراج خطوة TSA من الكشف القوي عن p-RIPK3 (S227) في السيتوسول للخلايا المصابة ب HSV-1 ICP6mutRHIM. وصلت إشارة p-RIPK3 (S227) إلى التشبع عندما تم ضبط طاقة الليزر على 2٪ (الشكل 2A). أظهر القياس الكمي لصور z-stack ثلاثية الأبعاد (انظر الخطوة 9) زيادة تقريبية بمقدار 20 ضعفا في عدد الفوكسل التي كانت إيجابية ل p-RIPK3 (S227) في HSV-1 ICP6mutRHIM المصابة على الخلايا المعالجة الوهمية (الشكل 2 ب). لم ينتج عن حذف الجسم المضاد الأساسي المضاد ل p-RIPK3 (S227) من بروتوكول التلوين بوساطة TSA باعتباره عنصر تحكم أولي (NP) إشارة يمكن اكتشافها. لتصور الخلايا المصابة بفيروس HSV-1 ICP6mutRHIM ، تم تلطيخ العينات بجسم مضاد أولي موجه ضد البروتين الفيروسي المبكر المباشر ICP0 (الشكل 2 أ). كانت إشارة p-RIPK3 (S227) منخفضة ولكن يمكن اكتشافها في الخلايا المعالجة الوهمية ، والتي قد تمثل الفسفرة الذاتية التأسيسية ل RIPK3 البشري في هذا الموقع5 (انظر المناقشة). تماشيا مع تقرير سابق28 ، فإن RHIM الخاص ب ICP6 غير قادر على منع فسفرة RIPK3 S227 بشكل كامل ، حيث اكتشفنا زيادة تلطيخ p-RIPK3 (S227) للخلايا المصابة بالنوع البري HSV-1 (HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1 WT ؛ HSV-1WT ؛ الشكل 2 أ ، ب). لمزيد من التحقق من خصوصية إشارة p-RIPK3 (S227) ، تمت معالجة الخلايا بمثبط كيناز RIPK3 GSK'840 قبل الإصابة. يرتبط GSK'840 بمجال كيناز RIPK3 ، مما يمنع نشاطه وبالتالي يثبط الفسفرة الذاتية29. منع GSK'840 فسفرة RIPK3 عند S227 عند تنشيط ZBP1 (الشكل 2A ، B) ، مما يؤكد خصوصية طريقة الكشف p-RIPK3 (S227) بوساطة TSA.

لمتابعة فسفرة MLKL ، وهي علامة في المرحلة النهائية للنخر ، أصيبت خلايا HT-29 المعبرة عن ZBP1 ب HSV-1 ICP6mutRHIM لمدة 8 ساعات و 10 ساعات. تم تلطيخ الخلايا بجسم مضاد ضد MLKL المفسفر S358 (p-MLKL [S358]) باستخدام TSA. أظهرت الخلايا المعالجة الوهمية تلطيخا خلويا منخفضا ومنقطا إلى حد ما ل p-MLKL (S358) ، بينما تم اكتشاف تلطيخ p-MLKL قوي في نواة العصارة الخلوية. وفي غشاء البلازما في الخلايا المصابة ب HSV-1 ICP6mutRHIM (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، لوحظت إشارة p-MLKL (S358) في مجموعات. وهذا يتماشى مع وظائف تشكيل المسام لأوليغومرات MLKL المفسفرة المنشطة في غشاء الخلية ونقلها النووي المبلغ عنه مؤخرا عند الإصابة بالأنفلونزا A1،2،6،30. كعنصر تحكم إيجابي في تلطيخ p-MLKL (S358) ، قمنا بتحفيز خلايا HT-29 المعبرة عن ZBP1 بمزيج من TNF و SMAC محاكاة BV6 ومثبط عموم caspase zVAD-fmk للحث على التنخر بوساطة TNFR1 (الشكل 3 أ). إن حذف الجسم المضاد الأساسي المضاد ل p-MLKL (S358) من بروتوكول التلوين بوساطة TSA باعتباره لا يوجد عنصر تحكم أساسي لم يسفر عن إشارة يمكن اكتشافها.

بعد ذلك ، أجرينا مقارنة جنبا إلى جنب مع تلطيخ p-MLKL (S358) المناعي مع وبدون TSA. أصيبت خلايا HT-29 المعبرة عن ZBP1 لمدة 9 ساعات بفيروس HSV-1 ICP6mutRHIM. في حين كانت هناك حاجة إلى طاقة ليزر بنسبة 40٪ للكشف عن إشارة p-MLKL (S358) محددة في الخلايا المصابة باستخدام التألق المناعي غير المباشر القياسي ، وصلت العينات المعالجة ب TSA بالفعل إلى إشارات مشبعة بقوة ليزر تبلغ 6٪ دون زيادة تلطيخ الخلفية في العينات المعالجة (الشكل 3 ب). علاوة على ذلك ، أظهر القياس الكمي لصور z-stack ثلاثية الأبعاد زيادة تزيد عن 10 أضعاف في عدد voxels التي كانت إيجابية ل p-MLKL (S358) عند استخدام TSA مقارنة بالتألق المناعي غير المباشر القياسي. وهذا يدل على أن TSA يحسن كلا من عتبة الكشف والحساسية ل p-MLKL (S358; الشكل 3 ج).

أخيرا ، للتحقق من صحة بروتوكول التألق المناعي بوساطة TSA للمحفزات الفيروسية الأخرى المعتمدة على ZBP1 ، قمنا بإصابة خلايا HT-29 المعبرة عن ZBP1 بسلالة PR8 من فيروس الأنفلونزا A (IAV) لمدة 9 ساعات. IAV يحفز كلا من موت الخلايا المبرمج بوساطة ZBP1 والتنخر في الخلايا البشرية30. في الواقع ، سمح TSA بالكشف القوي عن p-RIPK3 (S227) و p-MLKL (S358) ، مما يدل على أن هذه الخلايا تخضع للنخر (الشكل 4A-D).

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لبروتوكول TSA. يتم زرع الخلايا وتحفيزها في صفيحة جيدة ، متوافقة مع الفحص المجهري المتطور. بعد ذلك ، يتم تثبيت العينات في 4٪ PFA ، ويتم اختراقها وحظرها لمنع الارتباط المحدد للأجسام المضادة الأولية. من أجل تصور RIPK3 المفسفر (p-RIPK3 [S227]) و MLKL (p-MLKL [S358]) ، يتم تحضين أجسام مضادة محددة تتعرف على مواقع الفسفرة الرئيسية هذه طوال الليل في غرفة التصوير. بعد ذلك ، يضاف جسم مضاد ثانوي ، مقترن ببيروكسيديز فجل الحصان (HRP). تتيح مجموعة HRP هذه تنشيط تيراميد البيوتينيل في وجود H 2 O2. بعد ذلك ، يقترن البيوتين تيراميد النشط تساهميا ببقايا التيروزين على مقربة من الجسم المضاد الثانوي المسمى HRP. وتشمل هذه التيروزينات على البروتينات ذات الأهمية - في هذه الحالة p-RIPK3 أو p-MLKL ، كما هو موضح في الشكل - وتلك الخاصة بالبروتينات المجاورة وعلى الأجسام المضادة الأولية والثانوية نفسها (غير معروضة). تزيد خطوة تضخيم إشارة التيراميد هذه بشكل كبير من حساسية بروتوكول التلوين. في الخطوة الأخيرة ، يضاف الستربتافيدين المقترن بمجموعة الفلورسنت لتصور جزيئات البيوتينيلات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: HSV-1 ICP6mutRHIM يحفز الفسفرة المعتمدة على ZBP1 ل RIPK3 البشري في S227. (أ) صور تمثيلية متحدة البؤر لخلايا HT-29 البشرية المعبرة عن ZBP1 ، مقارنة تلطيخ TSA ببروتوكول تلطيخ التألق المناعي القياسي غير المباشر (بدون TSA) ل p-RIPK3 (S227). تم تحضين العينات الوهمية والمصابة بالفيروسات (HSV-1WT أو HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) لمدة 9 ساعات. كعنصر تحكم سلبي ، تم تضمين مثبط كيناز RIPK3 GSK'840 (1 ميكرومتر). يتم تضمين عنصر تحكم في تلطيخ الخلايا المصابة ب HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) لمدة 9 ساعات حيث تم حذف كل من الأجسام المضادة الأولية المضادة p-RIPK3 (S227) و ICP0. يشار إلى طاقة الليزر اللازمة لاكتشاف إشارة p-RIPK3 (S227) المحددة على الصور. تم استخدام ICP0 لتلطيخ الخلايا المصابة بالفيروس ، وتم استخدام DAPI لتلطيخ النواة. قضبان المقياس هي 10 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي النسبي ل p-RIPK3 (S227) + voxels باستخدام بروتوكول تلطيخ TSA. تمثل كل نقطة صورة ، ويمثل الشريط الأحمر الوسيط. يتم تقديم قيم عدد Voxel بالنسبة إلى متوسط عدد voxel للصور في الحالة الوهمية. تم إجراء الإحصائيات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة باستخدام تصحيح Tukey. p > 0.05 (n.s.) ، p≤ 0.05 (*) ، p≤ 0.01 (**). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: HSV-1 ICP6mutRHIM يحفز الفسفرة المعتمدة على ZBP1 ل MLKL البشري في S358. (أ) صور تمثيلية متحدة البؤر لخلايا ZBP1 البشرية المعبرة عن HT-29. تم علاج الخلايا إما بشكل وهمي أو مصابة بفيروس HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) لمدة 8 ساعات و 10 ساعات. تم استخدام TSA للكشف عن p-MLKL (S358). تم استخدام ICP0 لتلطيخ الخلايا المصابة بالفيروس ، وتم استخدام DAPI لتلطيخ النواة. يظهر عنصر تحكم في تلطيخ الخلايا المصابة لمدة 10 ساعات ب HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) حيث تم حذف مضاد p-MLKL الأساسي (S358). كعنصر تحكم إيجابي ، تم تحفيز الخلايا لمدة 4 ساعات باستخدام 30 نانوغرام / مل TNF و 5 ميكرومتر BV6 و 20 ميكرومتر ZVAD-fmk ، مما يؤدي إلى التنخر عبر TNFR1. قضبان المقياس هي 10 ميكرومتر. (ب) صور متحدة البؤر تمثيلية لخلايا HT-29 البشرية التي تعبر عن ZBP1 ، مقارنة تلطيخ TSA ببروتوكول تلطيخ مناعي قياسي غير مباشر (بدون TSA) ل p-MLKL (S358). تم علاج الخلايا إما بشكل وهمي أو مصابة ب HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) لمدة 9 ساعات. يتم تضمين عنصر تحكم تلطيخ NP للخلايا المصابة ب HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) لمدة 9 ساعات حيث تم حذف الأجسام المضادة الأولية المضادة ل p-MLKL (S358) و ICP0. يشار إلى طاقة الليزر اللازمة لاكتشاف إشارة p-MLKL (S358) المحددة على الصور. (ج) القياس الكمي النسبي ل p-MLKL (S358) + voxels باستخدام المعيار (بدون TSA) وبروتوكول تلطيخ TSA. تمثل كل نقطة صورة ، ويمثل الشريط الأحمر الوسيط. يتم تقديم قيم عدد voxel بالنسبة إلى متوسط عدد voxel للصور في الحالة الوهمية. تم إجراء الإحصائيات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة باستخدام تصحيح Tukey. p > 0.05 (n.s.) ، p ≤ 0.0001 (****). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: يحفز فيروس الأنفلونزا A الفسفرة المعتمدة على ZBP1 ل RIPK3 و MLKL البشريين. (A ، C) صور متحدة البؤر تمثيلية لخلايا HT-29 البشرية التي تعبر عن ZBP1. كانت الخلايا إما معالجة وهمية أو مصابة بفيروس الأنفلونزا A (IAV) ، سلالة PR8 (MOI = 4) لمدة 9 ساعات وملطخة ب p-RIPK3 (S227; A) أو p-MLKL (S358; ج) باستخدام بروتوكول TSA. قضبان المقياس هي 10 ميكرومتر. (B,D) القياس الكمي النسبي ل p-RIPK3 (S227) + (B) أو p-MLKL (S358; د) فوكسلز. تمثل كل نقطة في (B,D) صورة، ويمثل الشريط الأحمر الوسيط. يتم تقديم قيم عدد voxel بالنسبة إلى متوسط عدد voxel للصور في الحالة الوهمية. تم إجراء الإحصائيات باستخدام اختبار مان ويتني. ع≤ 0.05 (*)، ص ≤ 0.01 (**). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف بروتوكول التلوين المناعي هذا استخدام تضخيم إشارة التيراميد (TSA) لزيادة الحساسية لأحداث الإشارات لمسار الإشارات النخرية البشرية التي يصعب اكتشافها ، بما في ذلك فسفرة RIPK3 و MLKL26. يؤدي تضمين خطوة TSA إلى تحسين عتبة الكشف بشكل كبير من p-RIPK3 (S227) و p-MLKL (S358) ويزيد من حساسية إجهاد p-MLKL (S358). كشفت TSA عن إشارة p-RIPK3 (S227) موجودة بالفعل في العينات المعالجة الوهمية. في الخلايا البشرية ، تعد الفسفرة الذاتية ل RIPK3 في S227 شرطا أساسيا لتنشيط التنخر من خلال تمكين تفاعل مستقر مع MLKL. تحدث هذه العملية بالفعل على المستويات القاعدية وتؤدي إلى تكوين ثنائي ثنائي p-RIPK3 (S227) / MLKL غير نشط مستقر قبل تحريض التنخر2،5،31. وبالمثل ، فإن الجسم المضاد ل p-RIPK3 المستخدم في هذه الدراسة يكتشف أيضا p-RIPK3 (S227) في الخلايا غير المعالجة عن طريق النشاف الغربي26.

تؤدي فسفرة MLKL بواسطة RIPK3 داخل حلقة التنشيط ، في T357 و S358 ، إلى تفكك مركب p-RIPK3 (S227) / MLKL غير النشط ويؤدي إلى تغيير توافقي حيث يكشف MLKL عن مجال حزمة اللولب الأربعة N-terminal. ثم يقوم p-MLKL المنشط بقليل القلة وينتقل إلى غشاء الخلية حيث يقوم بإدخال حزمه الحلزونية الأربعة في طبقة الدهون المزدوجة ، مما يؤدي إلى تحلل الخلية1،2،6. باستخدام بروتوكول TSA المناعي هذا ، اكتشفنا زيادة قوية في فسفرة S358 MLKL أثناء التنخر الناجم عن ZBP1. يتجمع p-MLKL (S358) داخل السيتوسول وفي غشاء البلازما ويوجد أيضا داخل النواة عند تنشيط ZBP1. في الواقع ، تم الإبلاغ عن ZBP1 لتحفيز الاضطراب بوساطة MLKL للغشاء النووي في سياق عدوى IAV 8,30. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن TSA لا يودع فقط البيوتين تيراميد على المستضد محل الاهتمام والأجسام المضادة الأولية / الثانوية ولكن أيضا على البروتينات المجاورة. لذلك ، فإن TSA ليست مناسبة بشكل مثالي لاستنتاج معلومات حول التوطين الدقيق تحت الخلوي للبروتينات المكتشفة ، ولا نوصي باستخدام TSA لدراسات التوطين المشترك.

تؤثر دورات التجميد والذوبان المتكررة على استقرار التيراميد البيوتينيل. لمنع انخفاض حساسية الإشارة ، نوصي بتقسيم التيراميد واستخدام حصة جديدة لكل تجربة. يجب توخي الحذر مع الاختلافات من دفعة إلى أخرى في مخزونات البيوتين والتيراميد. إذا كان التركيز النهائي للبيوتين تيراميد مرتفعا جدا ، فإن الخلفية غير المحددة لتضخيم TSA ستخفي الإشارة المحددة. للتحكم في ذلك ، نوصي بمعايرة كل دفعة جديدة من البيوتين والتيراميد وتضمين عنصر تحكم بدون تلطيخ أولي يتم فيه حذف الجسم المضاد الأساسي.

في البروتوكول المقدم ، اقتصر TSA على هدف واحد. لم يتم الجمع بين الكشف عن RIPK3 و MLKL المفسفر في نفس التلوين ، حيث تم رفع كلا الجسمين المضادين الأساسيين في نفس النوع. يمكن تكييف البروتوكول للكشف عن إشارات تضخيم TSA متعددة (على سبيل المثال ، p-RIPK3 [S227] و p-MLKL [S358]) داخل نفس العينة باستخدام TSAالمناعي المتعدد 32,33. أخيرا ، يمكن استخدام التضخيم بوساطة TSA للفحص المجهري المناعي للتعرف على المؤشرات الحيوية لمسارات الإشارات الأخرى ذات نسب الإشارة إلى الضوضاء الضعيفة المبلغ عنها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر VIB Bioimaging Core على التدريب والدعم والوصول إلى حديقة الأدوات. يتم دعم JN من خلال زمالة الدكتوراه من مؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO). تم دعم البحث في مجموعة JM من خلال منحة Odysseus II (G0H8618N) ، و EOS INFLADIS (40007512) ، ومنحة بحثية مبتدئة (G031022N) من مؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO) ، ومنحة إثبات المفهوم من CRIG للباحثين الشباب ، ومن جامعة غنت. تم دعم البحث في مجموعة P.V. من قبل EOS MODEL-IDI (30826052) و EOS INFLADIS (40007512) ومنح أبحاث FWO العليا (G.0C76.18N و G.0B71.18N و G.0B96.20N و G.0A9322N) و Methusalem (BOF16 / MET_V/007) و iBOF20 / IBF / 039 ATLANTIS و Foundation Against Cancer (F / 2016/865 و F / 2020/1505) واتحادات CRIG و GIGG و VIB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP Agilent Technologies Belgium K4002 Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633 Thermofisher 35513 Secundary antibody
HSV-1 ICP0 Santa Cruz sc-53070 Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum In house production xx Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL Abcam ab187091 Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3 Abcam ab209384 Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI Thermofisher D21490 To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 Thermofisher S11226 To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2 Sigma H1009 Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA SANBIO AR1068 To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide R&D Systems 6241 To amplify signal, HRP substrate
BV-6 Selleckchem S7597 BV6 IAP Inhibitor
         For cell culture: to detach the cells
         8.0 g/L NaCl
         0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04% In house formulation 1.1 g/L Na2HPO4
         0.2 g/L NaH2PO4
         0.2 g/L KCl
         0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum TICO FBS EU XXX For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840 Aobious AOB0917 RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513 For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock Active Motif 15252 Blocking solution
PBS Gibco 10444402
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α In house production - Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML To permeabilise the cells
Trypan blue Merck 11732 For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine Sigma-Aldrich T4424 For cell culture: to detach the cells
zVAD Bachem BACE4026865.0005 Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom iBidi 80807 To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium Electron Microscopy Sciences 71001-10 To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C ZEISS 444970-9000-000 To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner ZEISS 000000-0105-200 To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope To visualise the sample
Software
Excel Office xx To process the data
Prism 9 Graphpad xx To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3 Volocity xx To perform quantifications
Zen black ZEISS xx To aquire and process images
Zen blue ZEISS xx To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain produced by  Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain Produced by Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8 in house stock in house replication IAV as a trigger for necroptosis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 188 ،
تضخيم إشارة التيراميد للتلطيخ المناعي للفسفرة المعتمدة على ZBP1 ل RIPK3 و MLKL بعد عدوى HSV-1 في الخلايا البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nemegeer, J., Lemeire, K.,… More

Nemegeer, J., Lemeire, K., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells. J. Vis. Exp. (188), e64332, doi:10.3791/64332 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter