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Immunology and Infection

Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas

Published: October 20, 2022 doi: 10.3791/64332
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Summary

A amplificação do sinal de tiramida durante a coloração imunofluorescente permite a detecção sensível de RIPK3 fosforilado e MLKL durante necroptose induzida por ZBP1 após infecção por HSV-1.

Abstract

A proteína quinase 3 (RIPK3) e sua linhagem mista quinase quinase (MLKL) são reguladores críticos da necroptose, uma forma inflamatória de morte celular com importantes funções antivirais. A autofosforilação do RIPK3 induz a fosforilação e a ativação da proteína executora formadora de poros da necroptose MLKL. O tráfico e a oligomerização da MLKL fosforilada na membrana celular resultam em lise celular, característica da morte celular necroptótica. O sensor de ácido nucleico ZBP1 é ativado ligando-se ao RNA DE FITA DUPLA (Z-RNA) da forma Z canhoto após a infecção por vírus de RNA e DNA. A ativação do ZBP1 restringe a infecção pelo vírus, induzindo a morte celular regulada, incluindo necroptose, de células hospedeiras infectadas. A microscopia de imunofluorescência permite a visualização de diferentes etapas de sinalização a jusante da necroptose mediada por ZBP1 por célula. No entanto, a sensibilidade da microscopia de fluorescência padrão, usando anticorpos fosfo-específicos atualmente disponíveis comercialmente contra RIPK3 e MLKL humanos, impede a imagem reprodutível desses marcadores. Aqui, descrevemos um procedimento de coloração otimizado para serina (S) fosforilada RIPK3 (S227) e MLKL (S358) em células HT-29 humanas infectadas com o vírus herpes simplex 1 (HSV-1). A inclusão de uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) no protocolo de coloração imunofluorescente permite a detecção específica de RIPK3 fosforilado S227. Além disso, a TSA aumenta muito a sensibilidade da detecção de MLKL fosforilado S358. Juntos, esse método permite a visualização desses dois eventos críticos de sinalização durante a indução da necroptose induzida por ZBP1.

Introduction

A serina/treonina proteína quinase 3 (RIPK3) e a quinase de linhagem mista (MLKL) são reguladores centrais da morte celular necroptótica 1,2. A necroptose é uma forma lítica e inflamatória de morte celular regulada envolvida na imunidade antiviral e na autoinflamação. A necroptose de células infectadas por vírus interrompe imediatamente a replicação do vírus. A lise celular após a indução da necroptose também libera padrões moleculares associados a danos, que estimulam a imunidade antiviral 3,4. A necroptose é iniciada pela ativação da RIPK3 após interações mediadas por motivo de interação homotípica RIP (RHIM) com uma das três moléculas ativadoras a montante: RIPK1 (no engajamento do receptor de TNF 1 [TNFR1]), β de interferon indutor de adaptador contendo domínio TIR (TRIF; no engajamento do receptor Toll-like 3 e 4), ou o sensor de ácido nucleico antiviral Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)1,2 . A sinalização da necroptose prossegue através de uma série de eventos de fosforilação começando com a autofosforilação do RIPK3. A autofosforilação da RIPK3 humana na serina (S)227 dentro de seu domínio da quinase é um pré-requisito para a necroptose, permitindo a interação com a MLKL e é comumente usada como marcador bioquímico para ativação da RIPK3 humana e morte celular necroptótica 1,5. Uma vez ativado, o RIPK3 fosforila o loop de ativação do MLKL na treonina (T)357 e S3581. Isso causa uma mudança na conformação do MLKL, resultando na exposição do domínio do feixe de quatro hélices N-terminal. O MLKL então oligomeriza e trafega para a membrana celular, onde forma um poro através da inserção dos quatro feixes de hélices expostos na bicamada lipídica, levando eventualmente à morte celular 2,6.

ZBP1 é um sensor de ácido nucleico antiviral que reconhece ácidos nucleicos canhotos da forma Z, incluindo RNA de fita dupla na conformação Z (Z-RNA). A ligação do Z-RNA ocorre através de dois domínios Zα posicionados no terminal N do ZBP1. Acredita-se que o Z-RNA que se acumula durante a infecção por vírus de RNA e DNA envolva diretamente o ZBP1 7,8. O ZBP1 ativado recruta RIPK3 através de seus RHIMs centrais e induz a morte celular regulada, incluindo necroptose 9,10. Os vírus adotaram inúmeros mecanismos de escape para neutralizar a necroptose de células hospedeiras induzida porZBP11 11. Por exemplo, a subunidade 1 da ribonucleotídeo redutase do vírus herpes simplex 1 (HSV-1), conhecida como ICP6 e codificada pelo UL39, abriga o RHIM em seu N-terminal que interfere na ativação do RIPK3 mediado por ZBP1 em células humanas12,13,14,15. O ZBP1 não apenas restringe a replicação viral, mas estudos em camundongos mostraram que a ativação do ZBP1 causa doenças inflamatórias e estimula a imunidade ao câncer 16,17,18,19,20,21. Protocolos que detectam eventos de sinalização que ocorrem durante a necroptose induzida por ZBP1 em células humanas são, portanto, valiosos para avaliar o papel do ZBP1 nesses processos.

A amplificação de sinal de tiramida (TSA), também conhecida como deposição catalisada de repórter (CARD), foi desenvolvida para melhorar o limite de detecção e a relação sinal-ruído em imunoensaios baseados em anticorpos. Durante a TSA, qualquer anticorpo primário pode ser usado para detectar o antígeno de interesse. A peroxidase de rábano (HRP), acoplada a um anticorpo secundário, catalisa o acúmulo local de radicais de tiramida biotinilados na presença de peróxido de hidrogênio. Esses radicais de biotina-tiramida ativados então reagem com resíduos proximais de tirosina para formar ligações covalentes. Potenciais substratos de tiramida-biotina incluem o próprio antígeno, os anticorpos primários e secundários e proteínas vizinhas. Assim, enquanto a TSA melhora significativamente a sensibilidade do ensaio, parte de sua resolução espacial é perdida. Em uma etapa final, as moléculas de biotina são detectadas usando treptavidina marcada fluorescentemente. A reação HRP deposita muitas moléculas de tiramida-biotina sobre ou perto do antígeno de interesse. Isso aumenta muito o número de sítios de ligação treptavidina-fluorocromo, ampliando consideravelmente a sensibilidade do ensaio (Figura 1). Alternativamente, a tiraamida pode ser diretamente acoplada a um fluorocromo, eliminando a necessidade de fluoróforos acoplados à estreptavidina. A imuno-histoquímica proteica e a hibridização in situ DNA/RNA estavam entre os primeiros métodos pelos quais a ATS foi empregada para melhorar as intensidades de sinal22,23. Mais recentemente, a AST tem sido combinada com citometria de fluxo intracelular24 e espectrometria de massas25.

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar serina 227 RIPK3 humana fosforilada (p-RIPK3 [S227]) e MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) após a ativação de ZBP1 por infecção por HSV-1 usando microscopia de imunofluorescência. Usamos uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano HT-29 sensível à necroptose que foi transduzida para expressar de forma estável a ZBP1 humana. Essas células foram infectadas com uma cepa de HSV-1 expressando uma proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) na qual quatro aminoácidos centrais dentro da IHMI viral (VQCG) foram substituídos por alaninas (AAAA), tornando a ICP6 incapaz de bloquear a necroptose mediada porZBP1 13,14,15. Para superar o problema da baixa relação sinal-ruído dos anticorpos atualmente disponíveis comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 e p-MLKL na imunocoloração26, realizamos uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta na detecção robusta de p-RIPK3 humano (S227) e melhora a sensibilidade de detecção de p-MLKL humano (S358) em uma ordem de magnitude.

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Protocol

1. Preparação de tiramida biotinilada

  1. Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para fazer uma solução-mãe de 10 mM, dissolver 3,6 mg de biotina-tiramida em 1 mL de DMSO. Conservar o produto dissolvido em alíquotas a -20 °C para preservar a qualidade.

2. Manutenção das células HT-29 em cultura

NOTA: Os HT-29 que expressam ZBP1 foram gerados por transdução com um lentivetor27 que codifica ZBP1 humano.

  1. Manter as células HT-29 que expressam ZBP1 no meio 5A de McCoy suplementadas com L-glutamina, sódio-piruvato e 10% de soro fetal bovino (a partir de agora referido como meio completo) e manter em uma incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Idealmente, use células de um número de passagem baixo (menos de 10). Deixe as células se recuperarem por pelo menos 5 dias após o ciclo de descongelamento antes do início do experimento.
  2. Para separar as células do balão de cultura, retirar o meio e lavar as células com 5 ml de PBS (pré-aquecido a 37 °C). Em seguida, adicionar a quantidade adequada de tripsina/EDTA (tripsina a 0,05% e EDTA a 0,032%, respetivamente, pré-aquecida a 37 °C) às células (2 ml para um balão T75, 3 ml para um balão T175).
  3. Incubar as células com tripsina/EDTA até 10 min numa incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Seguidamente, toque no balão e verifique visualmente se as células se desprenderam do balão utilizando um microscópio com uma ampliação objetiva de 4x-20x.
  4. Se as células não estiverem totalmente separadas, incubar durante mais 5 minutos a 37 °C. Quando as células estiverem descoladas, interromper a reacção enzimática adicionando 6 ml de meio completo ao balão.
  5. Reúna a suspensão celular em um tubo de 15 mL. Conte as células usando uma mancha azul de tripano para avaliar a viabilidade; recomenda-se uma diluição de 1:5. Só prossiga com o experimento se a viabilidade das células exceder 90%.

3. Iniciando o experimento, semeadura e estimulação das células

  1. Semear 90.000 células HT-29 que expressam ZBP1 em meio completo em uma placa de poço de área de superfície de 1 cm² que permite microscopia de alta qualidade. Use um volume final de 200 μL por poço.
  2. Incubar as células durante a noite a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Leve em consideração que alguns poços extras precisam ser semeados para controles de coloração, o que é explicado com mais detalhes na etapa 5.6.
  3. Quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, adicione um estímulo indutor de necroptose às células. Aqui, as células foram infectadas com HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicidade de infecção [MOI] de 5, definida como unidades formadoras de placas (pfu) divididas pelo número de células; o pfu foi quantificado usando um ensaio de placa em células Vero) por 6 h, 8 h ou 10 h.
  4. Como controle positivo para indução de necroptose, estimular as células por 4 h com um coquetel indutor de necroptose contendo 30 ng/mL de TNF, 20 μM do inibidor da pan-caspase zVAD-fmk e 5 μM do mimético SMAC BV6.
  5. Como controle negativo para a coloração p-RIPK3 (S227), inclua GSK'840 (1 μM) para inibir a atividade da quinase RIPK3 e prevenir a autofosforilação da S227. Idealmente, adicione o inibidor em uma condição não tratada e após a estimulação da necroptose. O inibidor pode ser adicionado simultaneamente com a infecção viral.
  6. Preparar as injeções em meio completo, pré-aquecidas a 37 °C. Use um volume final de 200 μL por poço para todas as estimulações.

4. Fixação das células

  1. Retire o meio e lave as células com 200 μL de 1x PBS. Em seguida, adicione 150 μL de PFA a 4% (já equilibrado à temperatura ambiente) às células e incube à temperatura ambiente por 30 min.
    Observação : se você estiver usando células que se desprendem facilmente, a fixação das células pode ser otimizada da seguinte maneira. Remova 100 μL de meio do poço, de modo que um volume de 100 μL permaneça na placa. Adicione 100 μL de 4% de PFA às células. Incubar as células durante 5 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, retire o meio/fixador dos poços e substitua por 150 μL de PFA a 4%. Incubar as células por mais 20 minutos à temperatura ambiente para garantir a fixação completa das células.
  2. Após a fixação, retire o PFA a 4% e lave as células 3x com 200 μL de PBS 1x. As amostras podem ser armazenadas em excesso (>200 μL) de 1x PBS a 4 °C durante a noite até processamento posterior.

5. Permeabilização e coloração primária

  1. Remova o PBS e adicione 100 μL de tampão de permeabilização (0,5% Triton X-100 em PBS). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Retirar o tampão de permeabilização e, posteriormente, lavar os poços com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar a câmara de imagem com tampão de lavagem por 5 min à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado (20-30 movimentos de balanço por minuto).
  3. Para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos primários, adicionar 100 μL de meio bloqueador e incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Alternativamente, esta etapa de bloqueio pode ser substituída por bloqueio com 3% de BSA, 0,1% de Triton-X-100 em PBS por 1 h à temperatura ambiente.
  4. Lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
  5. Depois de remover o tampão de lavagem, adicionar os anticorpos primários à câmara de imagem e incubar durante a noite a 4 °C. Use um volume final de 100 μL para cobrir o poço. Durante a incubação durante a noite a 4 °C, não coloque a câmara de imagem num agitador de laboratório inclinado.
    NOTA: Anti p-MLKL (S358; diluição: 1:200) e anti-p-RIPK3 (S227; diluição: 1:200) compartilham coelho como espécie hospedeira e, portanto, não devem ser combinados em um poço. Para monitorar a infecção viral, combine um anticorpo primário contra uma proteína viral de escolha com p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227). Aqui, as células foram infectadas com infecção por HSV-1 seguida de coloração ICP0 (diluição: 1:50, espécie hospedeira: camundongo).
  6. Leve em consideração os controles de coloração necessários neste momento. Sempre inclua uma condição sem anticorpos primários para visualizar o contexto potencial da etapa de amplificação da TSA para definir o limiar de mascaramento (consulte a etapa 9).
    NOTA: No caso de um protocolo de cocoloração (por exemplo, combinando p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227] com um anticorpo contra uma proteína viral), use também coloração única. O uso de manchas únicas é importante para corrigir possíveis sinais de sangramento em outros canais de imagem.

6. Amplificação de sinal de tiramida (TSA)

  1. Remova a mistura de anticorpos primários e lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
  2. Remova o tampão de lavagem e adicione 100 μL de anticorpo secundário marcado com HRP, reconhecendo as espécies de anticorpos primários que precisam ser amplificadas. Para amplificar o sinal p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), adicione 100 μL de anti-coelho-HRP e incube por 30 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
    NOTA: Somente p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227) serão amplificados. A coloração de uma proteína viral será visualizada usando um método padrão de coloração indireta.
  3. Posteriormente, lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
  4. Nas próximas etapas, adicione a tiramida biotinilada à placa microscópica. Usando o grupo HRP acoplado aos anticorpos secundários, a reação enzimática desencadeará a formação de radicais tiramida nas proximidades do alvo primário (aqui, p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227]).
  5. Para ativar a atividade enzimática da HRP, adicione um substrato oxidante juntamente com a tiramida biotinilada. Para conseguir isso, complemente o tampão TSA (0,1 M de ácido bórico [pH 8,5]) com 0,03 M H 2 O2; especificamente, tome 5 mL de tampão TSA e adicione 5 μL de 30% H 2 O2.
  6. Agora, dilua a biotina-tiramida em tampão TSA suplementadocom H 2O2, variando de 1:1.000 a 1:20.000.
    NOTA: O fator de diluição da biotina-tiramida precisa ser otimizado por lote.
  7. Remova o tampão de lavagem dos poços e adicione biotina-tiramida diluída aos poços a um volume final de 100 μL. Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos em um agitador de laboratório inclinado.
  8. Em seguida, lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.

7. Fluoróforos

NOTA: Como o sinal do anticorpo primário é convertido em um grupo biotina, p-MLKL (S358) e p-RIPK3 (S227) são visualizados usando estreptavidina acoplada a um fluoróforo (fluoróforo 568, diluição: 1:500). Além disso, os núcleos são corados com DAPI (5 μg/mL). Se uma proteína viral estiver incluída no protocolo de coloração, inclua um anticorpo secundário adequado marcado fluorescentemente contra a espécie hospedeira do seu anticorpo primário. Nos resultados representativos, foi utilizado um rato anti-ICP0. Como anticorpo secundário foi incluído um anticorpo caprino acoplado ao fluoróforo 633 (diluição: 1:1.000).

  1. Faça a mistura de coloração em tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS) contendo os anticorpos e manchas mencionados acima. Retire o tampão de lavagem, adicione 100 μL de mistura de coloração e incube à temperatura ambiente por 1 h em um agitador de laboratório inclinado. Mantenha a câmara de imagem protegida da luz a partir deste passo.
  2. Em seguida, lave os poços 2x com tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.
  3. Finalmente, lave os poços 2x com 1x PBS. Armazenar as amostras em excesso (> 200 μL) de 1x PBS até a obtenção de imagem. Alternativamente, submerja as amostras no meio de montagem para preservar a coloração. A câmara de imagem está agora pronta para ser visualizada em um microscópio confocal.

8. Imagem usando um microscópio confocal

  1. Ligue o microscópio confocal e os lasers pelo menos 10 minutos antes da imagem.
  2. Use um objetivo de imersão para sensibilidade. De preferência, use a ampliação objetiva de 40x ou 63x. Antes da imagem, limpe as objetivas de imersão com o limpador de lentes usando bolas de algodão apropriadas. Objetivos sujos (por exemplo, devido à poeira) podem resultar em imagens de menor qualidade.
  3. Coloque uma quantidade excessiva de óleo no fundo da câmara de imagem. Além disso, adicione uma gota de óleo no objetivo de escolha.
  4. Coloque a câmara de imagem no microscópio. Encontre o campo de foco usando a coloração DAPI ou usando imagens de campo brilhante. Se necessário, mova-se ao redor da câmara de imagem para garantir a disseminação adequada do óleo de imersão.
  5. Configure as trilhas de imagem necessárias no microscópio. Dependendo do microscópio, os passos a seguir podem variar (Tabela 1).
    NOTA: Ao configurar as trilhas de imagem, programe as trilhas para que a coloração nuclear seja medida por último. O laser de 405 nm pode contribuir para o fotobranqueamento e, assim, a perda de sinal específico em todos os canais.
  6. Para analisar uma célula completa quanto à presença de p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), meça pilhas z que abrangem a altura da célula. Aqui, as pilhas z foram feitas de 40 fatias a cada 0,16 μm, resultando em um intervalo de 6,22 μm.

Pista Laser Divisor de feixe Filtro
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) 561 MBS -405 + BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
Gene Viral: ICP0 633 MBS -405 + BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Núcleo: DAPI 405 MBS -405 + BP 420-480 + BP 495-550
MBS 488/561/633

Tabela 1: Faixas de imagem para visualização celular.

9. Análise e quantificação dos dados

  1. Carregue as imagens microscópicas para o software. Use o foco estendido para visualizar todas as informações da pilha z em uma imagem 2D.
  2. Em seguida, programe o protocolo de análise para extrair as seguintes informações: o número de células por imagem, a soma dos voxels mostrando a coloração p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+. Um voxel representa um volume tridimensional, definido como o equivalente tridimensional de um pixel.
  3. Para quantificar o número de células por imagem, segmente o núcleo. Para reduzir o ruído nos resultados da segmentação, adicione uma limitação de tamanho à segmentação (>100 μm³). O número de núcleos segmentados representa o número de células na imagem.
  4. Para quantificar a quantidade de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+, programe uma segmentação baseada em limiar. Defina o limite para que nenhum sinal seja captado nas imagens sem anticorpos primários (NP).
  5. Adapte ainda mais o limiar usando as imagens da condição simulada não tratada. Para garantir a detecção sensível do aumento do sinal devido à estimulação da necroptose, limite a captação de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ em condições simuladas, definindo um limiar mais alto. Sempre verifique o protocolo de análise programada em várias imagens da condição simulada e da infecção viral indutora de necroptose.
  6. Execute a análise em todos os conjuntos de imagens. Exporte a quantificação de voxel e a segmentação de núcleo em um arquivo de .txt para processamento adicional em software de planilha.
  7. Faça uma tabela dinâmica dos dados mostrando o nome da imagem, a quantificação do núcleo e a soma dos voxels detectados.
  8. Em seguida, divida a soma dos voxels positivos pela contagem de células na imagem. Isso resulta em um valor relativo de voxels positivos por célula. Para visualizar o aumento da dobra, divida o valor relativo de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ por célula pela mediana da condição não tratada (mock).

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Representative Results

A detecção imunofluorescente da fosforilação MLKL e, especialmente, da fosforilação RIPK3 em células humanas é tecnicamente desafiadora26. Apresentamos aqui um protocolo de coloração melhorado para p-RIPK3 humano (S227) e p-MLKL (S358) após a ativação do ZBP1. O protocolo inclui uma etapa da TSA para melhorar o limite de detecção e a sensibilidade dos sinais fluorescentes. Para validar o método, foi realizada uma comparação lado a lado da imunofluorescência mediada pela TSA com coloração fluorescente indireta padrão de p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358).

As células HT-29 que expressam ZBP1 humano foram infectadas por 9 h com uma cepa HSV-1 mutante do IHM6 da ICP6 (HSV-1 ICP6mutRHIM) para induzir necroptose mediada por ZBP1 e fosforilação de RIPK3. A cepamutRHIM ICP6 do HSV-1 carrega uma mutação VQCG para AAAA dentro do IHMI ICP6 e é incapaz de bloquear a sinalização de necroptose a jusante do ZBP114,15. Como relatado anteriormente26, a imunofluorescência indireta padrão não foi sensível o suficiente para visualizar a fosforilação do RIPK3 S227 com o atual anticorpo comercialmente disponível, mesmo quando a potência do laser do microscópio confocal foi aumentada para 30% (Figura 2A). Em contraste, a inclusão de uma etapa TSA permitiu a detecção robusta de p-RIPK3 (S227) no citosol de células infectadas com HSV-1 ICP6mutRHIM. O sinal p-RIPK3 (S227) atingiu a saturação quando a potência do laser foi ajustada em 2% (Figura 2A). A quantificação das imagens tridimensionais z-stack (ver etapa 9) mostrou um aumento aproximado de 20 vezes no número de voxels que foram positivos para p-RIPK3 (S227) em HSV-1 ICP6mutRHIM-infectados sobre células tratadas simuladas (Figura 2B). A omissão do anticorpo primário anti-p-RIPK3 (S227) do protocolo de coloração mediado pela TSA como um controle não primário (NP) não produziu um sinal detectável. Para visualizar as células infectadas pelo HSV-1 ICP6mutRHIM, as amostras foram cocoradas com um anticorpo primário direcionado contra a proteína viral precoce imediata ICP0 (Figura 2A). Um sinal de p-RIPK3 (S227) baixo, mas detectável, estava presente nas células tratadas simuladas, o que pode representar a autofosforilação constitutiva da RIPK3 humana neste local5 (ver discussão). De acordo com um relatório anterior28, o IHMI da ICP6 é incapaz de bloquear totalmente a fosforilação do RIPK3 S227, pois detectamos um aumento da coloração p-RIPK3 (S227) de células infectadas com HSV-1 do tipo selvagem (HSV-1WT; Figura 2A,B). Para validar ainda mais a especificidade do sinal p-RIPK3 (S227), as células foram tratadas com o inibidor de quinase RIPK3 GSK'840 antes da infecção. A GSK'840 liga-se ao domínio quinase da RIPK3, impedindo a sua atividade e, assim, inibindo a sua autofosforilação29. O GSK'840 impediu a fosforilação do RIPK3 em S227 após a ativação do ZBP1 (Figura 2A,B), confirmando a especificidade do método de detecção p-RIPK3 (S227) mediado pela TSA.

Para acompanhar a fosforilação da MLKL, um marcador de estágio final para necroptose, as células HT-29 expressas de ZBP1 foram infectadas com omutRHIM da ICP6 HSV-1 por 8 h e 10 h. As células foram coradas com um anticorpo contra S358 fosforilado MLKL (p-MLKL [S358]) usando TSA. As células tratadas simuladas mostraram coloração citosólica baixa e um tanto puntiforme de p-MLKL (S358), enquanto forte coloração p-MLKL foi detectada no núcleo do citosol. e na membrana plasmática das células infectadas com HSV-1 ICP6mutRHIM (Figura 3A). Além disso, o sinal p-MLKL (S358) foi observado em clusters. Isso está de acordo com as funções formadoras de poros de oligômeros MLKL fosforilados ativados na membrana celular e sua translocação nuclear recentemente relatada na infecção por influenza A 1,2,6,30. Como controle positivo da coloração p-MLKL (S358), estimulamos células HT-29 expressivas de ZBP1 com uma combinação de TNF, o mimético SMAC BV6 e o inibidor de pan-caspase zVAD-fmk para induzir necroptose mediada por TNFR1 (Figura 3A). A omissão do anticorpo primário anti-p-MLKL (S358) do protocolo de coloração mediada pela TSA como um controle não primário não produziu um sinal detectável.

Em seguida, foi realizada uma comparação lado a lado da coloração imunofluorescente p-MLKL (S358) com e sem TSA. As células HT-29 que expressam ZBP1 foram infectadas por 9 h com HSV-1 ICP6mutRHIM. Enquanto uma potência de laser de 40% foi necessária para detectar um sinal específico de p-MLKL (S358) nas células infectadas usando imunofluorescência indireta padrão, as amostras tratadas com TSA já atingiram sinais de saturação a uma potência de laser de 6% sem aumentar a coloração de fundo nas amostras tratadas simuladas (Figura 3B). Além disso, a quantificação das imagens tridimensionais z-stack mostrou um aumento de mais de 10 vezes no número de voxels que foram positivos para p-MLKL (S358) ao usar TSA em comparação com a imunofluorescência indireta padrão. Isso mostra que a TSA melhora tanto o limiar de detecção quanto a sensibilidade para p-MLKL (S358; Figura 3C).

Finalmente, para validar o protocolo de imunofluorescência mediada pela TSA para outros estímulos virais de necroptose dependentes de ZBP1, infectamos células HT-29 que expressam ZBP1 com cepa PR8 do vírus influenza A (IAV) por 9 h. IAV induz apoptose mediada por ZBP1 e necroptose em células humanas30. De fato, a TSA permitiu a detecção robusta de p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358), indicativo de que essas células estão submetidas a necroptose (Figura 4A-D).

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do protocolo TSA. As células são semeadas e estimuladas em uma placa de poço, compatível com microscopia de ponta. Posteriormente, as amostras são fixadas em 4% de PFA, permeabilizadas e bloqueadas para evitar uma ligação específica de anticorpos primários. Para visualizar RIPK3 fosforilado (p-RIPK3 [S227]) e MLKL (p-MLKL [S358]), anticorpos específicos que reconhecem esses principais locais de fosforilação são incubados durante a noite na câmara de imagem. Em seguida, um anticorpo secundário, acoplado a uma peroxidase de rabanete de cavalo (HRP), é adicionado. Este grupo HRP permite a ativação da tiramida biotinilada na presença de H 2 O2. Posteriormente, a biotina-tiramida ativa se acopla covalentemente a resíduos de tirosina nas proximidades do anticorpo secundário marcado com HRP. Estes incluem tirosinas nas proteínas de interesse - neste caso, p-RIPK3 ou p-MLKL, como indicado na figura - e as de proteínas vizinhas e nos próprios anticorpos primários e secundários (não mostrados). Esta etapa de amplificação do sinal de tiraamida aumenta muito a sensibilidade do protocolo de coloração. Em uma etapa final, a estreptavidina acoplada a um grupo fluorescente é adicionada para visualizar as moléculas biotiniladas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: HSV-1 ICP6mutRHIM induz fosforilação dependente de ZBP1 de RIPK3 humano em S227. (A) Imagens confocais representativas de células HT-29 humanas expressando ZBP1, comparando a coloração TSA com um protocolo padrão de coloração de imunofluorescência indireta (sem TSA) para p-RIPK3 (S227). As amostras simuladas e infectadas por vírus (HSV-1WT ou HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) foram incubadas por 9 h. Como controle negativo, o inibidor da quinase RIPK3 GSK'840 (1 μM) foi incluído. Um controle de coloração não primário (NP) de células infectadas com HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) por 9 h no qual os anticorpos primários anti-p-RIPK3 (S227) e ICP0 foram omitidos é incluído. A potência do laser necessária para detectar o sinal específico p-RIPK3 (S227) é indicada nas imagens. A ICP0 foi usada para corar as células infectadas pelo vírus, e a DAPI foi usada para manchar o núcleo. As barras de escala são de 10 μm. (B) Quantificação relativa de voxels p-RIPK3 (S227)+ usando o protocolo de coloração TSA. Cada ponto representa uma imagem e a barra vermelha representa a mediana. Os valores de contagem de Voxel são apresentados em relação à mediana da contagem de voxel das imagens na condição simulada. As estatísticas foram feitas usando uma ANOVA one-way com comparações múltiplas usando correção de Tukey. p > 0,05 (n.s.), p≤ 0,05 (*), p≤ 0,01 (**). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: HSV-1 ICP6mutRHIM induz fosforilação dependente de ZBP1 de MLKL humana em S358. (A) Imagens confocais representativas de células HT-29 humanas que expressam ZBP1. As células foram tratadas simuladamente ou infectadas com HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) por 8 h e 10 h. A TSA foi usada para detectar p-MLKL (S358). A ICP0 foi usada para corar as células infectadas pelo vírus, e a DAPI foi usada para manchar o núcleo. Um controle de coloração não primário (NP) de células que foram infectadas por 10 h com HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) no qual o anti-p-MLKL primário (S358) foi omitido é mostrado. Como controle positivo, as células foram estimuladas por 4 h com 30 ng/mL de TNF, 5 μM BV6 e 20 μM ZVAD-fmk, o que induz necroptose via TNFR1. As barras da escala são de 10 μm. (B) Imagens confocais representativas de células HT-29 humanas expressando ZBP1, comparando a coloração TSA com um protocolo padrão de coloração por imunofluorescência indireta (sem TSA) para p-MLKL (S358). As células foram tratadas simuladamente ou infectadas com HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) por 9 h. Um controle de coloração NP de células infectadas com HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) por 9 h no qual os anticorpos primários anti-p-MLKL (S358) e ICP0 foram omitidos é incluído. A potência do laser necessária para detectar o sinal específico p-MLKL (S358) é indicada nas imagens. (C) Quantificação relativa de voxels p-MLKL (S358)+ usando o padrão (sem TSA) e o protocolo de coloração TSA. Cada ponto representa uma imagem e a barra vermelha representa a mediana. Os valores de contagem de voxel são apresentados em relação à mediana da contagem de voxel das imagens na condição simulada. As estatísticas foram feitas usando uma ANOVA one-way com comparações múltiplas usando correção de Tukey. p > 0,05 (n.s.), p ≤ 0,0001 (****). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: O vírus influenza A induz fosforilação dependente de ZBP1 de RIPK3 humano e MLKL. (A,C) Imagens confocais representativas de células HT-29 que expressam ZBP1 humanos. As células foram tratadas simuladamente ou infectadas com o vírus influenza A (IAV), cepa PR8 (MOI = 4) por 9 h e coradas para p-RIPK3 (S227; A) ou p-MLKL (S358; C) utilizando o protocolo TSA. As barras de escala são de 10 μm. (B,D) Quantificação relativa de p-RIPK3 (S227)+ (B) ou p-MLKL (S358; D) voxels. Cada ponto em (B,D) representa uma imagem, e a barra vermelha representa a mediana. Os valores de contagem de voxel são apresentados em relação à mediana da contagem de voxel das imagens na condição simulada. As estatísticas foram feitas por meio do teste de Mann-Whitney. p≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo de coloração imunofluorescente descreve o uso de amplificação de sinal de tiramida (TSA) para aumentar a sensibilidade para eventos de sinalização da via de sinalização necroptótica humana que são difíceis de detectar, incluindo a fosforilação de RIPK3 e MLKL26. A inclusão de uma etapa TSA melhora significativamente o limiar de detecção de p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta a sensibilidade do esforço p-MLKL (S358). A TSA revelou um sinal p-RIPK3 (S227) já presente nas amostras tratadas simuladas. Em células humanas, a autofosforilação de RIPK3 em S227 é um pré-requisito para a ativação da necroptose, permitindo uma interação estável com MLKL. Esse processo já ocorre em níveis basais e resulta na formação de um dímero p-RIPK3 (S227)/MLKL inativo estável antes da indução da necroptose 2,5,31. Da mesma forma, o anticorpo anti-p-RIPK3 usado neste estudo também detecta p-RIPK3 (S227) em células não tratadas por western blotting26.

A fosforilação de MLKL por RIPK3 dentro do loop de ativação, em T357 e S358, resulta na dissociação do complexo inativo p-RIPK3 (S227)/MLKL e induz uma mudança conformacional pela qual o MLKL expõe seu domínio de feixe de quatro hélices N-terminal. A p-MLKL ativada então oligomeriza e trafega para a membrana celular, onde insere seus quatro feixes de hélices na bicamada lipídica, resultando em lise celular 1,2,6. Usando este protocolo de imunofluorescência da TSA, detectamos um forte aumento na fosforilação de S358 MLKL durante a necroptose induzida por ZBP1. p-MLKL (S358) agrupou-se dentro do citosol e na membrana plasmática e também foi encontrado dentro do núcleo após a ativação do ZBP1. De fato, foi relatado que a ZBP1 estimula a perturbação mediada por MLKL da membrana nuclear no contexto da infecção por IAV 8,30. Deve-se notar, no entanto, que a TSA não apenas deposita biotina-tiramida no antígeno de interesse e nos anticorpos primários / secundários, mas também nas proteínas vizinhas. A TSA não é, portanto, ideal para deduzir informações sobre a localização subcelular precisa das proteínas detectadas, e não recomendamos a TSA para estudos de co-localização.

Ciclos repetidos de congelamento-descongelamento afetam a estabilidade da tiramida biotinilada. Para evitar uma diminuição na sensibilidade do sinal, recomendamos alíquota da tiraamida e usar uma alíquota fresca para cada experimento. Deve-se ter cautela com as diferenças de lote para lote nos estoques de biotina-tiramida. Se a concentração final de biotina-tiramida for muito alta, o fundo não específico da amplificação da TSA mascarará o sinal específico. Para controlar isso, recomendamos a titulação de cada novo lote de biotina-tiramida e incluir um controle de coloração não primário no qual o anticorpo primário é omitido.

No protocolo apresentado, a TSA foi limitada a um alvo. A detecção de RIPK3 fosforilado e MLKL não foi combinada na mesma coloração, pois ambos os anticorpos primários foram criados na mesma espécie. O protocolo poderia ser adaptado para detectar múltiplos sinais amplificados pela TSA (por exemplo, p-RIPK3 [S227] e p-MLKL [S358]) dentro da mesma amostra usando a TSA imunofluorescente multiplex32,33. Finalmente, a amplificação mediada pela TSA para microscopia de imunofluorescência pode ser usada para o reconhecimento de biomarcadores de outras vias de sinalização com baixas relações sinal-ruído relatadas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer ao VIB Bioimaging Core pelo treinamento, suporte e acesso ao parque de instrumentos. J.N. é apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação de Investigação Flandres (FWO). A investigação no grupo J.M. foi apoiada por uma bolsa Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), uma bolsa de investigação júnior (G031022N) da Fundação de Investigação da Flandres (FWO), uma bolsa de prova de conceito para jovens investigadores do CRIG e pela Universidade de Ghent. A investigação no grupo P.V. foi apoiada por EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), consórcios CRIG e GIGG e VIB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP Agilent Technologies Belgium K4002 Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633 Thermofisher 35513 Secundary antibody
HSV-1 ICP0 Santa Cruz sc-53070 Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum In house production xx Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL Abcam ab187091 Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3 Abcam ab209384 Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI Thermofisher D21490 To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 Thermofisher S11226 To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2 Sigma H1009 Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA SANBIO AR1068 To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide R&D Systems 6241 To amplify signal, HRP substrate
BV-6 Selleckchem S7597 BV6 IAP Inhibitor
         For cell culture: to detach the cells
         8.0 g/L NaCl
         0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04% In house formulation 1.1 g/L Na2HPO4
         0.2 g/L NaH2PO4
         0.2 g/L KCl
         0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum TICO FBS EU XXX For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840 Aobious AOB0917 RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513 For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock Active Motif 15252 Blocking solution
PBS Gibco 10444402
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α In house production - Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML To permeabilise the cells
Trypan blue Merck 11732 For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine Sigma-Aldrich T4424 For cell culture: to detach the cells
zVAD Bachem BACE4026865.0005 Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom iBidi 80807 To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium Electron Microscopy Sciences 71001-10 To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C ZEISS 444970-9000-000 To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner ZEISS 000000-0105-200 To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope To visualise the sample
Software
Excel Office xx To process the data
Prism 9 Graphpad xx To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3 Volocity xx To perform quantifications
Zen black ZEISS xx To aquire and process images
Zen blue ZEISS xx To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain produced by  Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain Produced by Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8 in house stock in house replication IAV as a trigger for necroptosis

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References

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Imunologia e Infecção Edição 188
Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas
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Nemegeer, J., Lemeire, K.,… More

Nemegeer, J., Lemeire, K., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells. J. Vis. Exp. (188), e64332, doi:10.3791/64332 (2022).

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