ड्रोसोफिला गतिविधि मॉनिटर (DAM): मक्खियों में लोकोमोटर गतिविधि को मापने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो लोकोमोटर गतिविधि को ट्रैक करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ड्रोसोफिला गतिविधि मॉनिटर (डीएएम) प्रणाली का वर्णन करता है। शोधकर्ताओं ने फल मक्खियों में सर्कैडियन लय का अध्ययन करने के लिए बांध से एकत्र गतिविधि डेटा का उपयोग करें । विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल क्लिप से पता चलता है कि डिवाइस में मक्खियों को कैसे लोड किया जाए और सर्कैडियन प्रयोगों के लिए गतिविधि डेटा रिकॉर्ड किया जाए।

Protocol

यह प्रोटोकॉल चीनू एट अल(2010) मेंसर्कैडियन लय और नींद के मापदंडों का अध्ययन करने के लिए लोकोमोटर गतिविधि का एक अंशहै। 

1. लोडिंग एक्टिविटी ट्यूब और लोकोमोटर एक्टिविटी मॉनिटरिंग सिस्टम में उड़ता है

1. गतिविधि ट्यूबों में मक्खियों को लोड करने से पहले, उन इनक्यूबेटर को चालू करें जिनका उपयोग गतिविधि मॉनिटर घर के लिए किया जाएगा। इनक्यूबेटर नियंत्रण का उपयोग कर तापमान समायोजित करें और वांछित प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार बांध प्रणाली प्रकाश नियंत्रक या इनक्यूबेटर स्वयं प्रकाश नियंत्रण प्रणाली का उपयोग कर प्रकाश/अंधेरे शासन निर्धारित करें । गतिविधि ट्यूबों में मक्खियों को लोड करने के लिए आवश्यक समय तापमान को स्थिर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
2. कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें।
3. एक गतिविधि ट्यूब में एक फ्लाई को धीरे से स्थानांतरित करने के लिए एक ठीक तूलिका का उपयोग करें।
4. धागे के एक टुकड़े के बीच को पकड़ो जो ठीक संदंश के साथ लगभग आधा इंच है और यार्न को खोलने को प्लग करने और प्रयोग के दौरान भागने से रोकने के लिए गतिविधि ट्यूब के गैर-खाद्य अंत में डालें, जबकि एक ही समय में ट्यूब में एयरफ्लो की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, छोटे छेद (ट्राइकिनेटिक्स, इंक) के साथ प्लास्टिक कैप का उपयोग उद्घाटन को बंद करने के लिए किया जा सकता है।
5. सुनिश्चित करें कि ट्यूब ों को उनके किनारों पर तब तक रखा जाता है जब तक कि फ्लाई जागती है, वरना फ्लाई के भोजन में फंसने का खतरा होता है।
6. गतिविधि पर नज़र रखता है में ट्यूब डालें। ट्राइकिनेटिक्स मॉनिटर (ट्राइकिनेटिक्स डैम 2 और DAM2-7) के नए, अधिक कॉम्पैक्ट मॉडल के साथ, यह सुनिश्चित करने के लिए रबर बैंड के साथ ट्यूबों को पकड़ना आवश्यक है कि अवरक्त बीम केंद्र की स्थिति में ट्यूब से गुजरता है।
7. गतिविधि पर नज़र रखता है इनक्यूबेटर में रखो और टेलीफोन तारों के माध्यम से डेटा संग्रह प्रणाली के लिए उन्हें हुक। यह सुनिश्चित करने के लिए बांध प्रणाली संग्रह सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जांच करें कि सभी मॉनिटर ठीक से कांटे की शकल कर रहे हैं और उनमें से प्रत्येक से डेटा एकत्र किया जा रहा है। मॉनिटर प्रत्येक ग्लास गतिविधि ट्यूब के केंद्र में अवरक्त प्रकाश बीम उत्सर्जित करता है। मक्खियों की लोकोमोटर गतिविधि को कच्चे बाइनरी डेटा के रूप में दर्ज किया जाता है जहां हर बार अवरक्त बीम टूट जाने या 'शून्य' दर्ज किया जाता है जिसमें अवरक्त बीम टूटी नहीं होती है।

2. सर्कैडियन आवधिकता और आयाम के निर्धारण के लिए डेटा रिकॉर्ड करने के लिए प्रायोगिक डिजाइन

1. मक्खियों को 2-5 पूरे दिनों के लिए वांछित प्रकाश/अंधेरे (एलडी) और तापमान शासन के लिए उजागर करके सिंक्रोनाइज्ड और प्रशिक्षित किया जाता है। सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली एनट्रेनमेंट स्थिति 25 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे की रोशनी/12 घंटे अंधेरा (12:12 एलडी) का प्रकाश/अंधेरा चक्र है । यह आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं मानक स्थिति अनिवार्य रूप से सोचा है कि ड्रोसोफिला अफ्रीकी भूमध्य रेखीय स्थानों से उत्पन्न पर आधारित है। सर्कैडियन लय का अध्ययन करते समय कुछ शब्दावली होती है जिनसे परिचित होने की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक, जिस समय इन्क्यूबेटर में रोशनी चल जाती है, उसे zeitgeber समय 0 (ZT0) के रूप में परिभाषित किया जाता है और अन्य सभी समय उस मूल्य के सापेक्ष होते हैं (उदाहरण के लिए, 12:12 एलडी चक्र में, ZT12 वह समय है जब रोशनी बंद हो जाती है)। मानक 12:12 एलडी स्थितियों के तहत, जंगली प्रकार ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर आमतौर पर गतिविधि के दो मुकाबलों का प्रदर्शन करते हैं; ZT0 के आसपास केंद्रित एक "सुबह" चोटी और ZT12 के आसपास एक और कहा जाता है "शाम" चोटी(चित्रा 1ए)कहा जाता है । सुबह और शाम के मुकाबलों को अंतर्जात घड़ी द्वारा नियंत्रित किया जाता है लेकिन प्रकाश/अंधेरे संक्रमण के जवाब में गतिविधि के क्षणिक फटने वाली प्रतिक्रियाएं भी "चौंक" होती हैं । एनट्रेनमेंट के दो दिन न्यूनतम हैं और इसका उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, बड़ी स्क्रीन में जो अधिक समय लेने वाली हैं और लगातार अंधेरे में मुक्त चलने वाली अवधि को मापने की दिशा में सक्षम हैं (नीचे देखें, चरण 2)। हालांकि, यदि आप दैनिक प्रकाश-अंधेरे चक्र के दौरान गतिविधि पैटर्न का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं, तो एलडी में 4-5 दिनों के लिए मक्खियों को बनाए रखना बेहतर है ताकि अधिक डेटा प्राप्त किया जा सके। अनिवार्य रूप से, मक्खियों की संख्या में वृद्धि या अंतिम डेटा विश्लेषण में एलडी दिनों की संख्या (उदाहरण के लिए, एलडी लोकोमोटर गतिविधि के पिछले दो दिनों के मूल्य से पूल डेटा) अधिक विश्वसनीय दैनिक गतिविधि प्रोफाइल और माप (उदाहरण के लिए, सुबह या शाम पीक का समय) उत्पन्न करेगा। इसके अलावा, गतिविधि का दैनिक वितरण दिन की लंबाई (फोटोपीरियोड) और तापमान के एक समारोह के रूप में भिन्न होता है। मानक से फोटोपीरियोड या तापमान में फेरबदल करने का एक प्रमुख कारण यह है कि यदि कोई यह अध्ययन करना चाहता था कि दैनिक गतिविधि पैटर्न मौसमी अनुकूलन से कैसे गुजरते हैं (उदाहरण के लिए चेन एट अल,कोल्ड स्प्रिंग हार्ब सिंप क्वांट बायोल। (2007)) ड्रोसोफिला को दैनिक तापमान चक्रों (जैसे ग्लेसर और स्टेनेवस्की, क्यूर बायोल) के लिए भी प्रशिक्षित किया जा सकता है। (2005); सेहादोवा एट अल. , न्यूरॉन (2009)) । तापमान चक्र जो केवल 2-3 डिग्री सेल्सियस से भिन्न होते हैं, गतिविधि लय को प्रशिक्षित करने के लिए पर्याप्त हैं।
2. एनट्रेनिंग अवधि समाप्त होने के बाद निरंतर अंधेरे और तापमान की स्थिति के तहत मुफ्त रनिंग लोकोमोटर गतिविधि लय को मापा जाता है (ऊपर देखें, चरण 1)। प्रकाश चक्र के लिए सेटिंग एलडी के अंतिम दिन अंधेरे चरण में कभी भी बदला जा सकता है कि प्रयोग के बाद के दिन डीडी के पहले दिन का प्रतिनिधित्व करता है । डीडी डेटा संग्रह के सात दिन मक्खियों की सर्कैडियन अवधि और आयाम (जैसे, शक्ति या लय की ताकत) की गणना करने के लिए पर्याप्त है । सामान्य तौर पर, एक विशेष जीनोटाइप के लिए विश्वसनीय मुक्त चलने वाली अवधि प्राप्त करने के लिए कम से कम 16 मक्खियों का नमूना आकार आवश्यक है। यहां तक कि अगर कोई केवल दैनिक गतिविधि को मापने में रुचि रखता है, तो डीडी में मक्खियों की मुक्त-चल रही अवधि को मापना अभी भी सबसे अच्छा है क्योंकि अंतर्जात अवधि में परिवर्तन एलडी में गतिविधि के दैनिक वितरण को बदल सकते हैं। उदाहरण के लिए, लंबी अंतर्जात अवधि के साथ मक्खियों आमतौर पर एलडी में देरी से शाम की चोटियों का प्रदर्शन करते हैं (उदाहरण के लिए, चित्र 2देखें)।
3. प्रयोग के समापन पर, बांध सिस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एकत्र किए गए कच्चे बाइनरी डेटा को पोर्टेबल डेटा स्टोरेज डिवाइस पर डाउनलोड किया जाता है, उदाहरण के लिए यूएसबी कुंजी।
4. कच्चे बाइनरी डेटा को DAM Filecan102X (ट्राइकिनेटिक्स, इंक) का उपयोग करके संसाधित किया जाता है और नींद/बाकी मापदंडों का विश्लेषण करते समय सर्कैडियन मापदंडों, या 1 से 5 मिनट के डिब्बे का विश्लेषण करते समय 15 और 30 मिनट के डिब्बे में अभिव्यक्त किया जाता है। वर्तमान में, निष्क्रियता के पांच समीपस्थ मिनट ड्रोसोफिला (हेन्ड्रिक्स एट अल, न्यूरॉन (2000) में नींद/आराम की मानक परिभाषा है; हो और सहगल, विधियां एंजामोल., (२००५)) ।
5. डैम सिस्टम पर एकत्र किए गए डेटा का विश्लेषण करने के कई अलग-अलग तरीके हैं लेकिन हम केवल उन तरीकों को नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में उपयोग किए जाने वाले तरीकों को प्रदान करेंगे। माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल का उपयोग विभिन्न नमूना समूहों को जीनोटाइप प्रदान करने के लिए किया जाता है। FaasX सॉफ्टवेयर (एम Boudinot और एफ Rouyer, केंद्र राष्ट्रीय डे ला Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, फ्रांस) या अनिद्रा (Matlab आधारित कार्यक्रम; लेस्ली एशमोर, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय, PA) का उपयोग क्रमशः सर्कैडियन (जैसे अवधि और शक्ति) या नींद/आराम (जैसे प्रतिशत नींद, मतलब बाकी मुक्केबाज़ी लंबाई) मापदंडों की जांच करने के लिए किया जाता है ।

Representative Results

चित्रा 1: फैक्स का उपयोग करके उत्पन्न एड्यूक्शन ग्राफ लयबद्ध जंगली प्रकार मक्खियों (डब्ल्यू प्रति⁰ मक्खियों प्रति + ट्रांसजीन ले जाने वाली मक्खियों) (ए और बी) बनाम अतालता डब्ल्यू प्रति⁰ म्यूटेंट (सी और डी)। नर मक्खियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था और 12:12 एलडी (प्रकाश: अंधेरा) चक्रों में 4 दिनों के लिए प्रशिक्षित किया गया था और डीडी (निरंतर अंधेरे) में सात दिनों के बाद। प्रत्येक फ्लाई लाइन के लिए, व्यक्तिगत मक्खियों (एन एंड जीटी;32) के लोकोमोटर गतिविधि के स्तर को 15 मिनट के डिब्बे में मापा गया था और फिर उस लाइन के लिए एक समूह प्रोफ़ाइल प्रतिनिधि प्राप्त करने के लिए औसत था। ए और सी प्रकाश/डार्क साइकिल (एलडी 2-3) में दूसरे और तीसरे दिन के औसत से उत्पन्न गतिविधि डेटा दिखाते हैं जबकि बी और डी लगातार अंधेरे (डीडी 2-3) में दूसरे और तीसरे दिनों के औसत से उत्पन्न गतिविधि डेटा दिखाते हैं । ऊर्ध्वाधर बार प्रकाश अवधि (हल्के ग्रे) या अंधेरे अवधि (डार्क ग्रे) के दौरान 15 मिनट के डिब्बे में दर्ज गतिविधि (मनमाने ढंग से इकाइयों में) का प्रतिनिधित्व करते हैं। एलडी शिक्षा रेखांकन के तल पर क्षैतिज सलाखों; सफेद, रोशनी पर; ब्लैक, लाइट्स ऑफ। ZT0 और ZT12 क्रमशः फोटोपीरियोड की शुरुआत और अंत का प्रतिनिधित्व करते हैं। डीडी शिक्षा रेखांकन के लिए; CT0 और CT12 लगातार अंधेरे परिस्थितियों में व्यक्तिपरक दिन की शुरुआत और अंत का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो ग्रे बार द्वारा चिह्नित है। पैनल ए में, एम = सुबह पीक; ई = शाम पीक। पैनल ए में तीर जंगली प्रकार की मक्खियों में देखी गई सुबह और शाम की चोटियों के अग्रिम व्यवहार का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो प्रति⁰ अतालता मक्खियों में अनुपस्थित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: फैक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न डबल-प्लॉट एक्टोग्राम जंगली प्रकार, छोटी या लंबी अवधि के साथ मक्खियों के लोकोमोटर गतिविधि डेटा को दर्शाते हैं। नर मक्खियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था और 12:12 एलडी चक्रों में 4 दिनों के लिए प्रशिक्षित किया गया था और इसके बाद फैक्स में साइकिल-पी का उपयोग करके मुक्त-रनिंग अवधि (टी) की गणना के लिए लगातार अंधेरे (डीडी) में आठ दिनों के बाद। जंगली प्रकार की अवधि के साथ तीन फ्लाई लाइनें [डब्ल्यू प्रति^0;प्रति +; प्रति⁰ उत्परिवर्ती प्रति + ट्रांसजीन ले जाने], लंबी अवधि [डब्ल्यू प्रति^0;प्रति (S47A); प्रति⁰ उत्परिवर्ती प्रति (S47A) ट्रांसजीन] ले जाने, और छोटी अवधि [डब्ल्यू प्रति^0;प्रति (S47D); प्रति⁰ उत्परिवर्ती प्रति (S47D) ट्रांसजीन] यहां दिखाया गया है (Chiu एट अल २००८) । एक्स-एक्सिस क्रमशः एलडी या डीडी में जेडटी या सीटी समय का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई-एक्सिस गतिविधि गिनती (मनमाने ढंग से इकाइयों) का प्रतिनिधित्व करता है जो 15 मिनट के डिब्बे में अभिव्यक्त होता है। लाल बिंदीदार रेखाएं प्रयोगों के प्रत्येक दिन के लिए शाम की चोटियों को जोड़ती हैं। ध्यान दें कि एलडी के दौरान शाम की चोटी 24-घंटा एलडी चक्र के साथ सिंक्रोनी बनाए रखने के लिए 'मजबूर' है, जबकि डीडी में मुक्त-रनिंग अवधि 24 घंटे से विचलित हो सकती है। उदाहरण के लिए, छोटी अवधि के साथ मक्खियों के लिए शाम की गतिविधि का समय डीडी में प्रत्येक क्रमिक दिन पर पहले हो जाएगा (जब 24 घंटे के समय पैमाने के खिलाफ साजिश रची जाती है, जैसा कि यहां दिखाया गया है), जबकि लंबी अवधि के साथ मक्खियों के लिए दाईं ओर एक बदलाव मनाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014