Drosophila Aktivitetsmonitor (DAM): En metode til måling af lokomotivaktivitet i fluer

Overview

Denne video beskriver Drosophila aktivitetsmonitor (DAM) system, der anvendes til at spore bevægelsesaktivitet. Forskere bruger aktivitetsdata indsamlet fra DAM til at studere døgnrytmen i frugtfluer. Det fremhævede protokolklip viser, hvordan man indlæser fluer i enheden og registrerer aktivitetsdata for døgnrytmeeksperimenter.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Chiu et al.,Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp. (2010).

1. Lastning fluer i aktivitetsrør og lokomotorisk aktivitet overvågningssystem

1. Før du indlæser fluer i aktivitetsrør, skal du tænde for de inkubatorer, der vil blive brugt til at huse aktivitetsmonitorerne. Juster temperaturen ved hjælp af inkubatorstyringen, og indstil lys-/mørkeregimet ved hjælp af DAM-systemets lysstyringscontroller ELLER inkubatorernes eget lysstyringssystem i overensstemmelse med det ønskede eksperimentelle design. Den tid, der er nødvendig for at indlæse fluer i aktivitetsrør, skal være tilstrækkelig til, at temperaturen stabiliseres.
2. Bedøve fluerne med kuldioxid.
3. Brug en fin pensel til forsigtigt at overføre en enkelt flue til et aktivitetsrør.
4. Grib midten af et enkelt stykke garn, der er omkring en halv tomme med fine pincet og indsæt garnet i den non-food ende af aktivitetsrøret for at tilslutte åbningen og forhindre fluen i at undslippe under eksperimentet, samtidig med at luftstrømmen til røret. Alternativt kan plasthætter med små huller (Trikinetik, Inc.) bruges til at lukke åbningen.
5. Sørg for, at rørene er lagt på deres sider, indtil fluen vågner, ellers er der risiko for, at fluen sidder fast på maden.
6. Sæt rørene ind i aktivitetsmonitorerne. Med den nyere, mere kompakte model af trikinetikmonitorerne (Trikinettics DAM2 og DAM2-7) er det nødvendigt at holde rørene på plads med elastikker for at sikre, at den infrarøde stråle passerer røret i midterpositionen.
7. Sæt aktivitetsmonitorerne ind i inkubatorerne, og sæt dem til dataindsamlingssystemet via telefonledningerne. Kontroller ved hjælp af DAM System indsamling software til at sikre, at alle skærme er tilsluttet korrekt, og data bliver indsamlet fra hver af dem. Skærmen udsender infrarød lysstråle over midten af hvert glasaktivitetsrør. Fluernes bevægelsesaktivitet registreres som rå binære data, hvor "en" registreres, hver gang den infrarøde stråle brydes, eller der registreres et 'nul', hvor den infrarøde stråle ikke brydes.

2. Eksperimentelt design til registrering af data til bestemmelse af døgnrytmens periodicitet og amplitude

1. Fluer synkroniseres og omskoles ved at udsætte dem for det ønskede lys / mørke (LD) og temperaturregime i 2-5 hele dage. Den mest almindeligt anvendte entrainment tilstand er en lys / mørk cyklus på 12 timer lys / 12 timer mørk (12:12 LD) ved 25 °C. Denne almindeligt accepterede standardtilstand er hovedsageligt baseret på tanken om, at Drosophila stammede fra afro-ækvatoriale steder. Når man studerer døgnrytmen er der nogle fraseologi, at man har brug for at blive fortrolig med. I forbindelse med denne protokol defineres det tidspunkt, hvor lysene tændes i inkubatoren, som zeitgebertid 0 (ZT0), og alle andre tidspunkter er i forhold til denne værdi (f.eks. er ZT12 det tidspunkt, hvor lysene slukkes, i en 12:12 LD-cyklus). Under standard 12:12 LD betingelser, vilde type Drosophila melanogaster typisk udviser to anfald af aktivitet; en centreret omkring ZT0 hed "morgen" peak og en anden omkring ZT12 hed "aften" peak(Figur 1A). Morgen- og aftenkampene styres af det endogene ur, men der er også "startle" reaktioner, der er forbigående udbrud af aktivitet som reaktion på de lyse / mørke overgange. To dages træning er det mindste og kan f.eks. bruges på store skærme, der er mere tidskrævende og er rettet mod at måle friløbsperioder i konstant mørke (se nedenfor, trin 2). Men hvis du er interesseret i at studere aktivitetsmønstrene i løbet af en daglig lys-mørk cyklus, er det at foretrække at opretholde fluerne i 4-5 dage i LD for at få flere data. I det væsentlige vil en forøgelse af antallet af fluer eller antallet af LD-dage i den endelige dataanalyse (f.eks. puljedata fra de sidste to dage til en værdi af LD-lokomotorisk aktivitet) generere mere pålidelige daglige aktivitetsprofiler og målinger (f.eks. timing af morgen- eller aftentop). Desuden varierer den daglige aktivitetsfordeling som funktion af daglængde (fotoperiode) og temperatur. En væsentlig årsag til at ændre fotoperioden eller temperaturen fra standarden er, hvis man ønskede at studere, hvordan daglige aktivitetsmønstre gennemgår sæsontilpasning (f.eks. Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). Drosophila kan også omskoles til daglige temperaturcyklusser (f.eks. Glaser og Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). Temperaturcyklusser, der kun varierer med 2-3 °C, er tilstrækkelige til at omskole aktivitetsrytmer.
2. Fritløbende bevægelsesmotoriske aktivitetsrytmer måles under konstante mørke og temperaturforhold, når indkøringsperioden er afsluttet (se ovenfor trin 1). Indstillingen for lyscyklussen kan ændres når som helst i den mørke fase på den sidste dag i LD, således at eksperimentets efterfølgende dag repræsenterer den første dag i DD. Syv dages DD-dataindsamling er tilstrækkelig til at beregne fluernes cirkadiske periode og amplitude (f.eks. kraft eller rytmestyrke). Generelt er en stikprøvestørrelse på mindst 16 fluer nødvendig for at opnå pålidelige friløbsperioder for en bestemt genotype. Selv om man kun er interesseret i at måle døgnaktivitet, er det stadig bedst at måle fluernes friløbsperioder i DD, da ændringer i endogen periode kan ændre den daglige aktivitetsfordeling i LD. F.eks. udviser fluer med lange endogene perioder normalt forsinkede aftentoppe i LD (f.eks. se figur 2).
3. Ved eksperimentets afslutning downloades rå binære data indsamlet ved hjælp af DAM-systemsoftwaren til en bærbar datalagringsenhed, f.eks. USB-nøgle.
4. De rå binære data behandles ved hjælp af DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) og lægges sammen i 15 og 30 minutters placeringer, når der analyseres cirkadiske parametre, eller 1 til 5 minutters placeringer, når der analyseres slumre- og hvileparametre. I øjeblikket er fem sammenhængende minutter af inaktivitet standarddefinitionen af søvn / hvile i Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho og Sehgal, Metoder Enzymol., (2005)).
5. Der er mange forskellige måder at analysere de data, der er indsamlet på DAM-systemet, men vi vil kun levere de metoder, der rutinemæssigt bruges i vores laboratorium. Microsoft Excel bruges til at tildele genotype til forskellige eksempelgrupper. FaasX-software (M. Boudinot og F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Frankrig) eller Insomniac (Matlab-baseret program; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) bruges til at undersøge cirkadiske (f.eks periode og magt) eller søvn / hvile (f.eks procent søvn, gennemsnitlig hvile bout længde) parametre hhv.

Representative Results

Figur 1: Forførelsesgrafer genereret ved hjælp af FaasX, der viser daglige lokomotoriske aktivitetsrytmer af rytmiske vilde typefluer (w pr.⁰ fluer med en per+ transgen) (A og B) vs. arytmisk w pr.⁰ mutanter (C og D). Hanfluer blev holdt ved 25 °C og trænet i 4 dage i 12:12 LD (lys: mørk) cyklusser efterfulgt af syv dage i DD (konstant mørke). For hver fluelinje blev de individuelle fluers bevægelsesniveauer (n>32) målt i 15-minutters skraldespande og derefter beregnet som gennemsnit for at opnå en gruppeprofilrepræsentant for den pågældende linje. A og C viser de aktivitetsdata, der genereres fra gennemsnittet af den anden og tredje dag i lys/mørk cyklus (LD 2-3), mens B og D viser de aktivitetsdata, der genereres fra gennemsnittet af den anden og tredje dag i konstant mørke (DD 2-3). Lodrette søjler repræsenterer den aktivitet (i vilkårlige enheder), der registreres i 15-minutters placeringer i lysperioden (lysegrå) eller den mørke periode (mørkegrå). Vandrette stænger i bunden af LD-forførelsesgrafer; hvid, lys på; sort, lys fra. ZT0 og ZT12 repræsenterer henholdsvis start og slutning af fotoperiod. For DD-forførelsesgrafer; CT0 og CT12 repræsenterer starten og slutningen af den subjektive dag under konstante mørke forhold, betegnet med den grå bjælke. I panel A, M = morgen peak; E = aften peak. Pilene i panel A repræsenterer foregribende opførsel af morgen- og aftentoppe observeret i vilde type fluer, som er fraværende i w pr.⁰ arytmiske fluer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Dobbeltplotaktogram genereret ved hjælp af FaasX-softwaren, der illustrerer lokomotoriske aktivitetsdata for fluer med vild type, kort eller lang periode. Hanfluer blev holdt ved 25 °C og omskolet i 4 dage i 12:12 LD-cyklusser efterfulgt af otte dage i konstant mørke (DD) til beregning af den fritløbende periode (t) ved hjælp af Cycle-P i FaasX. Tre fluelinjer med vild typeperiode [w pr.⁰; pr. +; pr.⁰ mutant, der transporterer per+ transgen], lang periode [w pr.⁰; pr. (S47A) pr.⁰ mutant, der transporterer transgenet pr. (S47A) og en kort periode [w pr.⁰; pr. (S47D) pr.⁰ mutantbærende per(S47D) transgen] er vist her (Chiu et al. 2008). X-aksen repræsenterer henholdsvis ZT- eller CT-tid i henholdsvis LD eller DD, og Y-aksen repræsenterer aktivitetsantal (vilkårlige enheder), der opsummeres i 15-minutters placeringer. De røde prydede linjer forbinder aftentoppene for hver dag i eksperimenterne. Bemærk, at i løbet af LD aftenen peak er 'tvunget' til at opretholde synkronisering med 24-timers LD cyklus, mens der i DD den frie løb periode kan afvige fra 24 timer. For eksempel vil tidspunktet for aftenaktiviteten for fluer med korte perioder forekomme tidligere på hver efterfølgende dag i DD (når plottet mod en 24 timers tidsskala, som vist her), mens et skift til højre observeres for fluer med lange perioder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014