ショウジョウバエ アクティビティモニタ(DAM):ハエのロコモド活動を測定する方法

Overview

このビデオでは、運動活動を追跡するために使用される ショウジョウバエ 活動モニタ(DAM)について説明します。研究者は、DAMから収集した活動データを使用して、フルーツハエの概日リズムを研究します。注目のプロトコル クリップは、デバイスにハエをロードし、概日実験の活動データを記録する方法を示しています。

Protocol

このプロトコルは、ショウジョウバエ、J.Vis.Exp.(2010)で概日リズムと睡眠パラメータを研究するためのロコモ運動活動をアッセイするChiuららからの抜粋です。 

1. 活動管およびロコモド活動モニタリングシステムへのハエの積み込み

1. ハエを活動管に積み込む前に、活動モニターを収容するために使用されるインキュベーターをオンにします。インキュベーターコントロールを使用して温度を調整し、ダムシステムライトコントローラまたはインキュベーター独自の光制御システムを使用して、所望の実験計画に従ってライト/ダークレジームを設定します。ハエを活動管にロードするのに必要な時間は、温度が安定するのに十分である必要があります。
2. 二酸化炭素でハエを麻酔します。
3. 細かいペイントブラシを使用して、1つのフライをアクティビティチューブにそっと移します。
4. 細かい鉗子で約半インチの糸の真ん中をつかみ、活動管の非食品端に糸を挿入して開口部を差し込み、実験中にハエが逃げるのを防ぎ、同時にチューブへの気流を可能にします。あるいは、小さな穴を持つプラスチックキャップ(トリキネティクス社)を使用して開口部を閉じることもできます。
5. ハエが目覚めるまでチューブが側面に置かれているか、そうでなければハエが食べ物にくっつくりする危険性があることを確認してください。
6. 活動モニターにチューブを挿入します。トリキネティクスモニター(Trikinetics DAM2とDAM2-7)の新しい、よりコンパクトなモデルでは、赤外線ビームが中心位置にチューブを通過することを確認するために、ゴムバンドで所定の位置にチューブを保持する必要があります。
7. アクティビティモニタをインキュベーターに入れ、電話線を介してデータ収集システムに接続します。DAMシステム・コレクション・ソフトウェアを使用して、すべてのモニターが正しく接続され、各モニターからデータが収集されていることを確認します。モニターは各ガラス活動の管の中心を横切って赤外線光線を放出する。ハエの運動活動は、赤外線ビームが壊れるたびに「1」が記録されるか、赤外線ビームが壊れていない「ゼロ」が記録される生のバイナリデータとして記録される。

2. 概日周期と振幅の測定のためのデータを記録する実験計画

1. ハエは、2〜5日間、所望の明暗(LD)と温度レジームにさらすことによって同期され、緊張します。最も一般的に使用されるエントレインメント条件は、25°Cで12時間の光/12時間暗い(12:12 LD)の光/暗いサイクルです。 この一般的に受け入れられている標準的な条件は、本質的にショ ウジョウバエ がアフロ赤道の場所に由来するという考えに基づいています。概日リズムを研究する際には、慣れ親しむために必要なフレーズがあります。このプロトコルに関連して、インキュベーターでライトが点灯する時間はツァイトゲバー時間 0 (ZT0) と定義され、それ以外の時間はその値に対して相対的です (例えば、12:12 LD サイクルでは、ZT12 はライトが消灯する時間です)。標準的な12:12 LD条件下では、野生型 ショウジョウバエメラノガスター は通常、2回の活動を示す。ZT0を中心とした1つは「朝」のピークと呼び、もう1つは「夕方」のピークと呼ばれます(図1A)。朝と夕方の試合は内因性の時計によって制御されますが、明暗の遷移に応答して活動の一過性のバーストである「驚くべき」応答もあります。2日間のエントレインメントは最小であり、例えば、より時間がかかり、一定の暗闇の中でフリーランニング期間を測定することを目的とした大画面で使用することができます(下記のステップ2を参照)。しかし、日照暗サイクル中に活動パターンを研究したい場合は、より多くのデータを得るために、LDで4〜5日間ハエを維持することが望ましい。基本的に、最終的なデータ分析におけるハエの数またはLD日数(例えば、LD運動活動の最後の2日間分のプールデータ)は、より信頼性の高い日当活動プロファイルおよび測定(例えば、朝または夕方のピークのタイミング)を生成する。また、日の長さ(光周期)や温度の関数として、毎日の活動分布もさまざまです。光周期や温度を標準から変える主な理由は、毎日の活動パターンが季節的な適応を受ける方法を研究したい場合です(例えば、陳ら、コールドスプリングハーブSymp Quant Biol)。 (2007))) ショウジョウバエ はまた、毎日の温度サイクル(例えば、グレーザーとスタネスキー 、Curr Biol) に合体することができる。(2005);セハドバら、 ニューロン (2009))。わずか2〜3°Cによって変化する温度サイクルは、活動リズムを訓練するのに十分です。
2. 自由な走行運動活動リズムは、訓練期間が終了した後の一定の暗さと温度条件下で測定されます(上記、ステップ1を参照)。光周期の設定は、LDの最終日の暗い段階でいつでも変更することができ、実験の次の日はDDの初日を表す。DDデータ収集の7日間は、ハエの概日周期と振幅(例えば、リズムの強さ)を計算するのに十分である。一般に、特定の遺伝子型に対して信頼性の高いフリーランニング期間を得るためには、少なくとも16個のハエのサンプルサイズが必要です。日の活性の測定のみに関心がある場合でも、内因性期間の変化がLDの活動の毎日の分布を変える可能性があるため、DDでハエのフリーランニング期間を測定するのが最善です。例えば、長い内因性の時期を持つハエは、通常、LDで遅れた夕方のピークを示す(例えば、 図2を参照)。
3. 実験の終わりに、DAMシステムソフトウェアを使用して収集された生のバイナリデータは、ポータブルデータストレージデバイス、例えばUSBキーにダウンロードされます。
4. 生のバイナリデータは、DAM Filescancan102X(Trikinetics社)を使用して処理され、概日パラメータを分析する場合は15分と30分のビン、または睡眠/休息パラメータを分析する場合は1〜5分のビンに合計されます。現在、5分間の連続した非活動は、 ショウジョウバエ (ヘンドリックスら、ニューロン (2000)における睡眠/休息の標準的な定義である。ホーとセガル、 メソッドエンジモル 、(2005))。
5. DAMシステムで収集されたデータを分析する方法はさまざまですが、ラボで日常的に使用されている方法のみを提供します。Excel は、異なるサンプル グループに遺伝子型を割り当てる場合に使用します。FaasXソフトウェア(M.ブーディノールとF.ルイヤー、センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック、ギ・シュル・イヴェット・セデックス、フランス)または不眠症(Matlabベースのプログラム)。レスリーアシュモア、ピッツバーグ大学、PA)は、それぞれ概日(期間とパワー)または睡眠/休息(例えば、睡眠率、平均休息吹き出物の長さ)パラメータを調べるために使用されます。

Representative Results

図1:AasXを用いて生成されたエカチオングラフは、リズミカルな野生型ハエ⁽¹⁺トランスジーン当たり0ハエ毎にw)(AおよびB)対不整脈^w/0変異体(CおよびD)の毎日の運動活動リズムを示す。オスのハエは25°Cに保たれ、12:12 LD(明:暗い)サイクルで4日間、DD(一定の暗闇)で7日間続いた。フライラインごとに、個々のハエ(n>32)の運動活動レベルを15分のビンで測定し、平均してそのラインのグループプロファイル代表を得ました。AとCは、明暗サイクル(LD 2-3)で2日目と3日目を平均して生成されたアクティビティデータを示し、BとDは一定の暗闇の中で2日目と3日目を平均することによって生成されたアクティビティデータを示す(DD 2-3)。縦棒は、明るい期間(明るい灰色)または暗い期間(濃い灰色)の間に15分のビンに記録されたアクティビティ(任意の単位)を表します。LD誘導グラフの下部にある水平バー。白、点灯。黒、ライトオフ ZT0、ZT12 はそれぞれ、光周期の開始と終了を表します。DDの誘導グラフの場合;CT0とCT12は、灰色のバーで示される一定の暗い条件で主観的な日の開始と終了を表します。パネル A では、M = 朝のピーク。E = 夕方のピーク。パネルAの矢印は、野生型ハエで観測された朝と夕方のピークの予想行動を表し^、0つの不整脈のハエ当たりwには存在しない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:野生型、短い、または長い期間を持つハエの運動活動データを示すFaasXソフトウェアを用いて生成された二重プロットのアクトグラム。オスのハエは25°Cに保たれ、12:12 LDサイクルで4日間飼育され、続いてFaasXのサイクルPを使用してフリーランニング期間(t)の計算のために一定の暗闇(DD)で8日間続いた。野生のタイプのピリオド^[w/0;あたり+;を持つ3つのフライライン。⁰突然変異体が+トランスジーンを運ぶあたり]、長い期間^[0あたりw;あたり(S47A)。; (S47A) トランスジーンあたり0突然変異体で運ぶ、および短い期間^[0あたりw; per(S47D);;per(S47D)トランスジーン]あたり0突然変異体を運ぶごとに、ここに示されている(Chiuら. 2008)。 X軸は、それぞれLDまたはDDのZTまたはCT時間を表し、Y軸は15分のビンに合計された活動数(任意の単位)を表します。赤い点線は、実験の各日の夕方のピークを接続します。LD の間、夕方のピークは 24 時間の LD サイクルとの同期を維持するために強制されます。たとえば、短い期間のハエの場合、夕方の活動のタイミングはDDで連続する日ごとに早く発生します(ここに示すように24時間の時間スケールに対してプロットすると)、長い期間を持つハエの場合は右へのシフトが観察されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014