C. एलिगेंस ब्लास्टोमेरे विच्छेदन: एगशेल को हटाने और भ्रूण कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो सी एलिगेंस ब्लास्टोमेरेस को शुरुआती भ्रूण से अलग करने की एक विधि का परिचय देता है।  परिणामस्वरूप कोशिकाएं कोशिका संस्कृति या पूर्व वीवो प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं।

Protocol

यह प्रोटोकॉल सू एट अल से एक अंश है,इन   विट्रो रिकंस्ट्रक्ट्यूटेड कैनोरहैबिटिस एलिगेंस भ्रूण ब्लास्टोमेरेस और चिपकने वाले पॉलीस्टीरिन मोतियों, जे विस एक्सपी (2019)।

1. भ्रूण ब्लास्टोमेरे का अलगाव
2. कट और ब्लीचिंग समाधान के साथ संपर्क से बचने के लिए दस्ताने और प्रयोगशाला कोट पहनें।
   1. दाएं और बाएं हाथ से माइक्रोकैपिलरी (क्षमता; 10 माइक्रोल) के प्रत्येक छोर को पकड़ें।
   2. तनाव लागू करने के लिए और दो हाथ से खींचे गए केशिकाओं(चित्रा 1A)बनाने के लिए एक बर्नर पर केशिका के केंद्र को लाने के लिए माइक्रोकैपिलरी को दोनों सिरों की ओर खींचें।
   3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत संदंश के साथ हाथ से खींचे गए केशिकाओं की युक्तियों को ट्रिम करें और खींचे गए केशिका को मुंह में पाइपिंग उपकरण में संलग्न करें। दो प्रकार के पिपेट तैयार करें। पिपेट के लिए टिप खोलने का आकार लगभग 2x और 1x होना चाहिए भ्रूण हस्तांतरण और अंडे के खोल हटाने के लिए सी एलिगेंस भ्रूण (30 माइक्रोन) की छोटी धुरी लंबाई, क्रमशः चित्रा 1B-D)।
   4. एक मल्टीवेल स्लाइड(चित्रा 2A,नीचे) के एक कुएं पर अंडे नमक समाधान के पिपेट 45 माइक्रोन।
   5. अंडे नमक के घोल से युक्त अच्छी तरह से 5-10 वयस्क सी एलिगेंस रखें।
   6. प्रारंभिक सी एलिगेंस भ्रूण प्राप्त करने के लिए, सी एलिगेंस शरीर के दाईं और बाईं ओर दो सुइयों को स्थिति बनाकर वयस्कों को टुकड़ों में काटें और एक दूसरे के पिछले सुइयों को फिसलने(चित्रा 2A;ऊपरी योजनाबद्ध) ।
   7. पिपेट 45 μL हाइपोक्लोराइट समाधान अच्छी तरह से अंडे नमक समाधान(चित्रा 2B)युक्त के बगल में एक अच्छी तरह से आगे है।
   8. अच्छी तरह से हाइपोक्लोराइट समाधान(चित्रा 2B)युक्त कुएं के बगल में बाद के तीन कुओं पर शेल्टन के विकास माध्यम के पिपेट 45 माइक्रोन।
   9. भ्रूण हस्तांतरण(चित्रा 2B)के लिए हाथ से तैयार केशिका के साथ मुंह पाइपिंग द्वारा हाइपोक्लोराइट समाधान में 1-सेल चरण और प्रारंभिक 2-सेल चरण भ्रूण स्थानांतरित करें।
   10. 40-55 एस के लिए प्रतीक्षा करें ।
   11. भ्रूण हस्तांतरण(चित्रा 2B)के लिए हाथ से तैयार केशिका के साथ मुंह pipetting द्वारा शेल्टन के विकास माध्यम में हाइपोक्लोराइट समाधान से भ्रूण को स्थानांतरित करके भ्रूण धोएं ।
   12. भ्रूण हस्तांतरण(चित्रा 2B)के लिए हाथ से तैयार केशिका के साथ मुंह pipetting द्वारा शेल्टन के विकास माध्यम के एक नए कुएं में भ्रूण को फिर से स्थानांतरित करके भ्रूण धोएं ।
   13. भ्रूण हस्तांतरण के लिए हाथ से तैयार केशिका के साथ मुंह pipetting द्वारा शेल्टन के विकास माध्यम के एक नए कुएं में धोया भ्रूण हस्तांतरण । अंडे के हाथ हटाने के लिए हाथ से तैयार केशिका का उपयोग करके, पिपटिंग(चित्रा 2C;मध्य योजनाबद्ध) को सावधानीपूर्वक दोहराएं। यदि अंडे का खेल सफलतापूर्वक हटा दिया जाता है, तो भ्रूणीय कोशिकाएं अधिक गोलाकार(चित्रा 2C;दाएं) बन जाएंगी।
   14. अंडे के हाथ हटाने(चित्रा 2डी)के लिए हाथ से तैयार केशिका के साथ धीरे-धीरे और लगातार पाइपिंग करके 2-सेल चरण भ्रूणीय ब्लास्टोमेरेस को अलग करें।

चित्रा 1: ब्लास्टोमेरे अलगाव। (A)कांच के केशिका का हाथ खींचना । (ख)भ्रूण हस्तांतरण के लिए हाथ से तैयार कांच के केशिका । (ग)अंडे के शेल हटाने के लिए हाथ से तैयार ग्लास केशिका । (घ)योजनाएं अंडे के खोल हटाने के लिए केशिका खोलने के उचित आकार दिखा । तीर भ्रूण को इंगित करते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन दिखाते हैं।

चित्रा 2: ब्लास्टोमेरे आइसोलेशन वर्कफ्लो। (क)भ्रूण प्राप्त करने के लिए अंडे के नमक बफर में वयस्क सी एलिगेंस का विच्छेदन । तस्वीरें अंडे के शेल हटाने से पहले 2-सेल और 4-सेल स्टेज भ्रूण दिखाती हैं। (ख)हाइपोक्लोराइट उपचार और धुलाई। (ग)योजनाबद्ध तरीके अंडे के शेल हटाने के लिए उपयुक्त समय को दर्शाते हैं । तस्वीर अंडे के हानेल हटाने के बाद एक 4 सेल चरण भ्रूण से पता चलता है । (घ)ब्लास्टोमेरे सेपरेशन । तस्वीर एक अलग 2 सेल चरण भ्रूण से पता चलता है । सी और डी में तीर के आकार पाइपिंग के दौरान आवश्यक सापेक्ष बलों को इंगित करते हैं। स्केल बार 50 माइक्रोन दिखाते हैं।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.