Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Cellefri proteinsyntese fra eksonuklease-mangelfulle cellulære ekstrakter ved bruk av lineære DNA-maler

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64236
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 4, 1
1INRAe, AgroParisTech, Micalis Institute, Université Paris-Saclay, 2Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI), 3Medical Faculty, University of Würzburg, 4Centre de Biochimie Structurale, INSERM U1054, CNRS UMR 5048, University of Montpellier
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en protokoll for fremstilling og bufferkalibrering av celleekstrakter fra eksonuklease V knockout-stammer av Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD og ΔrecB). Dette er en rask, enkel og direkte tilnærming for ekspresjon i cellefrie proteinsyntesesystemer ved hjelp av lineære DNA-maler.

Abstract

Cellefri proteinsyntese (CFPS) har nylig blitt svært populær innen syntetisk biologi på grunn av sine mange fordeler. Bruk av lineære DNA-maler for CFPS vil ytterligere gjøre det mulig for teknologien å nå sitt fulle potensial, redusere eksperimenttiden ved å eliminere trinnene for kloning, transformasjon og plasmidekstraksjon. Lineært DNA kan raskt og enkelt forsterkes ved PCR for å oppnå høye konsentrasjoner av malen, og unngår potensiell in vivo ekspresjonstoksisitet. Imidlertid nedbrytes lineære DNA-maler raskt av eksonukleaser som er naturlig tilstede i celleekstraktene. Det er flere strategier som har blitt foreslått for å takle dette problemet, for eksempel å legge til nukleasehemmere eller kjemisk modifikasjon av lineære DNA-ender for beskyttelse. Alle disse strategiene koster ekstra tid og ressurser og har ennå ikke oppnådd nær-plasmidnivåer av proteinuttrykk. En detaljert protokoll for en alternativ strategi presenteres her for bruk av lineære DNA-maler for CFPS. Ved å bruke celleekstrakter fra eksonuklease-mangelfulle knockoutceller, forblir lineære DNA-maler intakte uten å kreve noen sluttmodifikasjoner. Vi presenterer forberedelsestrinnene av cellelysat fra Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stamme ved sonikeringslyse og bufferkalibrering for Mg-glutamat (Mg-glu) og K-glutamat (K-glu) spesielt for lineært DNA. Denne metoden er i stand til å oppnå proteinuttrykksnivåer som er sammenlignbare med det fra plasmid-DNA i E. coli CFPS.

Introduction

Cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS) brukes i økende grad som en rask, enkel og effektiv metode for biosensorteknikk, desentralisert produksjon og prototyping av genetiske kretser1. På grunn av deres store potensial brukes CFPS-systemer regelmessig innen syntetisk biologi. Men så langt er CFPS-systemer avhengige av sirkulære plasmider som kan begrense teknologien fra å nå sitt fulle potensial. Forberedelse av plasmid-DNA avhenger av mange tidkrevende trinn under kloning og store mengder DNA-isolasjon. På den annen side kan PCR-forsterkning fra et plasmid, eller en syntetisert DNA-mal, brukes til å bare forberede CFPS-maler innen få timer 2,3. Derfor tilbyr anvendelse av lineært DNA en lovende løsning for CFPS. Imidlertid nedbrytes lineært DNA raskt av eksonukleaser som er naturlig tilstede i cellulære ekstrakter4. Det finnes løsninger som løser dette problemet, for eksempel bruk av λ-GamS-protein5 eller DNA som inneholder Chi-steder6 som beskyttelsesmidler, eller direkte beskyttelse av det lineære DNA ved kjemisk modifisering av endene 2,7,8,9. Alle disse metodene krever tilskudd til celleekstraktet, som er kostbart og tidkrevende. Det har lenge vært kjent at eksonuklease V-komplekset (RecBCD) nedbryter lineært DNA i cellelysater4. Nylig viste vi at lineært DNA kan beskyttes mye bedre i lysater fra celler slått ut for eksonukleasegener (recBCD)10.

I denne protokollen er trinn for fremstilling av cellefrie lysater fra E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stammen ved sonikeringslyse beskrevet i detalj. Sonikeringslyse er en vanlig og rimelig teknikk som brukes av flere laboratorier11,12. Ekstraktene produsert fra denne stammen trenger ikke tillegg av noen ekstra komponent- eller DNA-malmodifisering for å støtte uttrykk fra lineære DNA-maler. Metoden er avhengig av det essensielle trinnet i bufferoptimalisering for celleekstrakter spesielt for lineært DNA-uttrykk fra innfødte E. coli-promotorer. Det har vist seg at denne spesifikke bufferoptimaliseringen for lineær DNA-ekspresjon er nøkkelen for innfødte σ70-promotorer for å gi høy proteinproduksjon uten GamS-protein eller Chi DNA-tilskudd, til og med unngå rensing av PCR-produktene10. Den optimale konsentrasjonen av Mg-glu for lineær DNA-ekspresjon ble funnet å være lik den for plasmid-DNA. Den optimale konsentrasjonen av K-glu viste imidlertid en betydelig forskjell mellom lineært og plasmid-DNA, sannsynligvis på grunn av en transkripsjonsrelatert mekanisme10. Funksjonaliteten til proteiner uttrykt ved hjelp av denne metoden har blitt demonstrert for flere applikasjoner, for eksempel rask screening av tåholdbrytere og aktivitetsvurdering av enzymvarianter10.

Denne protokollen gir en enkel, effektiv og kostnadseffektiv løsning for bruk av lineære DNA-maler i E. coli-cellefrie systemer ved ganske enkelt å bruke mutante ΔrecBCD-celleekstrakter og spesifikk kalibrering for lineært DNA som mal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av medier og buffer

  1. Tilberedning av 2xYT+P medium (fast og flytende)
    1. Forbered flytende og faste medier som beskrevet i tabell 1, og steriliser deretter ved autoklavering.
      MERK: Denne protokollen krever en 2xYT+P agarplate som inneholder kloramfenikol (10 μg/ml). Volumet av flytende medier er proporsjonalt med volumet av lysatet som kreves. Her brukes et startvolum på 5 L flytende 2xYT + P-medium. Volumet kan imidlertid justeres etter behov, vel vitende om at 1 liter av cellekulturen resulterer i 2 til 3 ml av det endelige cellelysatet.
  2. Tilberedning av kloramfenikol (34 mg/ml)
    1. Vei 0,34 g kloramfenikol, tilsett etanol til 10 ml, og oppløs ved blanding. Aliquot 1 ml hver i flere rør, og oppbevares ved -20 °C for senere bruk.
  3. Klargjøring av S30A-buffer
    1. Forbered S30A-buffer i henhold til tabell 2, med sikte på 2 liter av denne bufferen.
      MERK: Nok en gang er volumet av denne bufferen proporsjonal med volumet av lysatet som kreves.
    2. Før autoklavering, juster bufferens pH til 7,7 ved hjelp av iseddik.
    3. Autoklav bufferen.
    4. Oppbevar denne bufferen ved 4 °C etter autoklavering.
    5. Før bruk, tilsett DTT (filtrert av et 0,22 μm membranfilter) til S30A-bufferen for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2 mM (2 ml lager 1 M DTT til 1 L S30A-buffer).
      MERK: Nok en gang er volumet av denne bufferen proporsjonal med volumet av lysatet som kreves.
  4. Fremstilling av energiløsning
    MERK: Denne energiløsningen er basert på Sun et al. papir13 (14x lagerkonsentrasjon). Tabell 3 rekapitulerer komponentene som trengs for utarbeidelse av energiløsningslageret, med katalognummer for alle kjemikaliene som brukes i denne protokollen.
    1. Forbered stamløsningene i henhold til tabell 3 og hold dem på is.
    2. Kalibrer pH som forespurt for de angitte komponentene, enten med Tris-buffer 2 M (60,57 g Tris-base i et 250 ml volum sterilt vann) eller KOH 15 % (15 g KOH i et 100 ml volum sterilt vann) som angitt i tabell 3.
    3. I et 15 ml rør legger du til volumet av hver komponent i den rekkefølgen som er angitt i tabell 3.
    4. Aliquot energiløsningen, 150 μL per rør.
    5. Blitsfrys aliquots på tørris og oppbevares ved -80 °C.
  5. Fremstilling av aminosyre (AA) løsning
    MERK: Aminosyreoppløsning fremstilles av RTS Amino Acid Sampler kit. Hver av de 20 aminosyrene er gitt i dette settet som et 1,5 ml volum ved 168 mM, bortsett fra leucin som er på 140 mM. Her er den forberedte lagerløsningen 4x konsentrert, i stedet for arbeidsløsningen som kreves. Den endelige konsentrasjonen av aminosyreoppløsningen er 6 mM for alle aminosyrer, unntatt leucin som er på 5 mM.
    1. Tine de 20 aminosyreslangene ved vortexing og inkubere ved 37 °C til de er helt oppløst.
      MERK: Cys oppløses kanskje ikke helt.
    2. I et 50 ml rør tilsettes 12 ml sterilt vann og 1,5 ml hver av aminosyrene i den rekkefølgen som er angitt i tabell 4.
    3. Vortex til oppløsningen er noenlunde klar, inkuber ved 37 °C om nødvendig.
      MERK: Cys oppløses kanskje ikke helt.
    4. Aliquot 500 μL av aminosyreoppløsningen per rør på is.
    5. Flash-frys aliquotene på tørris og oppbevar ved -80 °C.
  6. Klargjøring av løsninger for bufferkalibrering
    1. Klargjør stamløsningen for Mg-glu (100 mM) og K-glu (3 M) som angitt i tabell 5. Lag en seriell fortynning (i 1 ml volum) fra disse lagrene for Mg-glu (0 til 20 mM) og K-glu (20 til 300 mM) som angitt i tilleggsfil 1 for kalibreringstrinn.
      MERK: Disse lagerkonsentrasjonene er for kalibreringstrinnet og må kanskje endres når du konfigurerer det endelige eksperimentet. De høyeste konsentrasjonene av bestandene som er testet for denne protokollen er 1 M og 4,5 M for henholdsvis Mg-glu og K-glu.
  7. Klargjøring av PEG8000 løsningslager
    1. Forbered 50 ml 40% PEG8000-løsning (20 g PEG8000 i et 50 ml volum sterilt vann).

2. Cellekultur og lysatpreparat (4 dagers eksperiment)

  1. Dag 1
    1. Strekstamme BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (tabell 6) fra -80 °C glyserolmasse til en 2xYT+P agarplate som inneholder 10 μg/ml kloramfenikol. Alternativt kan BL21 Rosetta2 ΔrecB (tabell 6) også brukes10.
    2. Inkuber over natten ved 37 °C.
  2. Dag 2
    1. Inokuler en enkelt koloni fra ovennevnte agarplate til 10 ml 2xYT + P supplert med 10 μg / ml kloramfenikol.
    2. Inkuber over natten ved 37 °C med 200 o/min risting.
  3. Dag 3
    1. Lag en subkultur ved å fortynne nattkulturen 100 ganger til 4 liter ferske 2xYT + P-medier som inneholder 10 μg / ml kloramfenikol.
      MERK: For eksempel legges 40 ml av overnattingskulturen til 3960 ml ferske medier. Etter fortynning er 4 L-mediet delt inn i 4 kolber (5 L volum) slik at hver kolbe inneholder 1 L.
    2. Inkuber ved 37 ° C, 200 o / min i omtrent 3 til 4 timers vekst for å nå en OD600 på 1,5-2,0. Fortynn kulturen med 4x hvis måling OD600 > 0,8.
      MERK: Den nøyaktige inkubasjonstiden kan variere i henhold til belastning, innledende inokulum, labware og instrumentene som brukes. ΔrecB/ΔrecBCD knockout-stammene har vekstrater som kan sammenlignes med BL21 Rosetta2-foreldrene (supplerende figur 1).
    3. Legg kulturen på is.
    4. Spinn ned cellene ved 5000 x g i 12 minutter ved 4 °C, og kast deretter supernatanten ved dekantering.
    5. Resuspender cellepellets i 800 ml kjølt S30A + DTT.
      MERK: Volumet av S30A + DTT er 5 ganger mindre enn det opprinnelige cellekulturvolumet. For eksempel, for et startvolum på 1 L av cellekulturen, resuspender cellepellets i 200 ml S30A + DTT. Det anbefales også å utføre dette trinnet i et kjølerom ved 4 °C, samt å holde alle materialer på is.
    6. Spinn ned cellene ved 5000 x g i 12 minutter ved 4 °C, og kast deretter supernatanten ved dekantering.
    7. Gjenta trinn 2.3.5 og 2.3.6.
    8. Resuspender cellepellets i 160 ml kjølt S30A+DTT.
      MERK: Denne gangen er volumet av S30A + DTT 25 ganger mindre enn det opprinnelige cellekulturvolumet. For eksempel, for et startvolum på 1 L av cellekulturen, resuspender cellepellets i 40 ml S30A + DTT. Igjen anbefales det å utføre dette trinnet i et kaldt rom ved 4 ° C, samt å holde materialene på is.
    9. Overfør cellene til kjølte og forhåndsveide 50 ml rør.
    10. Spinn ned cellene ved 2000 x g i 8 minutter ved 4 °C, og kast deretter supernatanten ved dekantering.
    11. Spinn ned cellene ved 2000 x g i 4 minutter ved 4 °C, og fjern deretter den gjenværende supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette.
    12. Mål vekten av røret på nytt for å beregne vekten av cellepelleten.
    13. Hold cellepellets på -80 °C.
  4. Dag 4
    1. Ta cellepellets fra -80 °C og tine dem på is i 1-2 timer.
    2. Resuspender cellepellets i 0,9 ml S30A + DTT-buffer per gram av pellets vekt. Pipette sakte for å resuspendere cellene, unngå topp skum så mye som mulig, hvis noen.
    3. Plasser 1 ml aliquots av de resuspenderte cellene i 1,5 ml mikrorør, og hold dem på is eller en forkjølt kuldeblokk ved 4 ° C (det er å foretrekke å bruke metallblokker).
      MERK: Hvis den siste aliquoten er mye mindre enn 1 ml, er det bedre å kaste den enn å sonikere et suboptimalt volum. Det optimale volumet (1 ml) for sonikering ble bestemt for dette oppsettet (rør, sonikator og sonde), og kan variere for en annen.
    4. Sonicate hvert rør i en sonikator (3 mm sonde, frekvens 20 kHz), med et oppsett på 20% amplitude i tre sykluser (30 s sonikering, 1 min pause).
      MERK: Den totale energien som ble levert over de tre syklusene var ~ 266 Joules (~ 80-110 Joules per syklus). I løpet av dette trinnet, hold rørene på kuldeblokken som er omgitt av is. Veksle mellom to kuldeblokker for å unngå overoppheting av sonden (standby-kuldeblokken holdes også kald på is). Begge kuldeblokkene ble forkjølt i kjøleskapet dagen før sonikeringen.
    5. Spinn ned lysatet ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    6. Samle supernatanten (cellelysat) med en pipette og overfør til et 50 ml rør.
    7. Inkuber cellelysatet ved 37 °C ved 200 o / min agitasjon i 80 minutter.
    8. Spinn ned lysatet ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    9. Samle supernatanten og aliquot 30 μL hver i forkjølte 1,5 ml mikrorør, mens du holder alle rørene på is.
    10. Flash-frys lysat aliquots på tørris og lagre ved -80 °C.

3. Cellefri bufferkalibrering for lineært DNA

MERK: Cellefri buffer ble kalibrert for optimale Mg-glu- og K-glukonsentrasjoner som beskrevet i Sun et al.13. Tilleggsfil 1 er nødvendig for kalibreringstrinnene. Reaksjonene ble satt til et endelig volum på 10,5 μL hver. Ekstrakter ble kalibrert ved bruk av 1 nM lineært (se avsnitt 4 nedenfor) eller plasmid-DNA. Forsøkene kan utføres samme dag som bufferne fremstilles, eller de tilberedte bufferne kan fryses ved -80 °C for å utføre eksperimentet en annen dag. For alle kalibreringstrinn ble hver komponent tint på is før blanding og pipettering i en plate med 384 brønner.

  1. Forbered en Master Mix, i henhold til 'Buffer Preparation' -fanen i Excel-filen Supplementary File 1, som inneholder: (a) celleekstrakt (33% av det totale reaksjonsvolumet), (b) reporter-DNA (som lineært og / eller plasmid-DNA) til en endelig konsentrasjon på 1 nM, (c) cellefri buffer (PEG8000, AA-løsning og energiløsning), og (d) K-glu til en endelig konsentrasjon på 80 mM.
  2. For et reaksjonsvolum på 10,5 μL, ta 1,05 μL (10% total reaksjon) av forskjellige konsentrasjoner av Mg-glu 10x konsentrerte lagre (endelige konsentrasjonsområder: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 og 20 mM) og tilsett 9,45 μL (90% total reaksjon) av Master Mix. Bland forsiktig.
    MERK: Bruk PCR åtte-strimmel rør for å forberede fortynninger og bland med en flerkanals pipette. Om nødvendig kan et annet utvalg av Mg-glukonsentrasjoner brukes.
  3. Pipette 10 μL av de ovennevnte reaksjonene i en 384-brønns firkantet mikroplate, dekk den med en klebende platetetning, og mål genuttrykk som fluorescensutgang. Registrer fluorescensdata med en plateleser (f.eks. 485 nm; Em: 528 nm) med jevne mellomrom (f.eks. 5 min) i 8 timers inkubasjon ved 30 °C med kontinuerlig orbital risting ved 307 cpm.
    MERK: Hvis nødvendig, spinn ned mikroplaten på 384 brønner (<2 500 x g, 1 min, romtemperatur) før du starter datainnsamlingen. Endepunktsmålinger ble brukt til å sammenligne GFP-uttrykk i de forskjellige buffersammensetningene. Fluorescensverdiene kan konverteres til standardiserte enheter for plotting (se nedenfor).
  4. Identifiser Mg-glukonsentrasjonen som resulterer i den høyeste fluorescensverdien ved endepunktet.
    MERK: Hvis du er usikker på den optimale Mg-glukonsentrasjonen som er oppnådd, gjenta trinn 3.2 med mer varierte konsentrasjonsområder.
  5. Med den optimaliserte Mg-glukonsentrasjonen, fortsett til K-glukalibrering for en rekke konsentrasjoner (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 og 240 mM), ved å bruke de samme volumene som er angitt i trinn 3.2. Kjør eksperimentet og identifiser den høyeste fluorescensverdien blant K-glu-konsentrasjonene som ble testet. Dette indikerer den optimale buffersammensetningen for Mg-glu og K-glu for dette lysatet.
    MERK: Hvis du er usikker på den optimale K-glu-konsentrasjonen som er oppnådd, gjenta trinnet med mer varierte konsentrasjonsområder.
  6. Når Mg-glu- og K-glu-verdiene er etablert, klargjør du lagerrør av den optimaliserte buffersammensetningen i henhold til det oppnådde batchvolumet. Bruk fanen 'Bufferforberedelse' i tilleggsfil 1 for å beregne antall bufferrør som trengs, aliquot 38 μL per rør, og oppbevar ved -80 °C.

4. Lineært DNA-preparat

MERK: For lysatkalibrering brukes plasmid P70a-deGFP. Dette plasmidet ble opprettholdt i E. coli KL740 cl857+ (tabell 6) for miniprep ved bruk av Plasmid Miniprep Kit, eller maxiprep ved bruk av Plasmid Maxiprep Kit. Lineære DNA-fragmenter brukt som ekspresjonsmaler i de cellefrie reaksjonene ble PCR forsterket ved hjelp av primerne og malene oppført i tabell 7 og tabell 8.

  1. PCR-forsterkning fra plasmid P70a-deGFP ved bruk av DNA-polymerase med oligoprimere listet opp i tabell 7. Sett opp PCR-reaksjonene i et volum på 50 μL, i henhold til produsentens protokoll, ved hjelp av termosyklerprogrammet: [98 °C i 2 min; 40 sykluser x (98 °C i 30 s → 66 °C i 30 s → 72 °C i 60 s); 72 °C i 10 min; 4 °C i ∞].
  2. Fordøye mal-DNA i PCR-reaksjonene ved å tilsette 1 μL DpnI-restriksjonsenzym per 50 μL PCR-reaksjon og ruge ved 37 °C i 1 time. Rens deretter PCR-reaksjonen ved hjelp av et PCR &-DNA-oppryddingssett og eluer i nukleasefritt vann.
  3. Kontroller PCR-produktene på en 1% agarosegel (1x TAE) før bruk.
  4. Kvantifiser de rensede PCR-produktene (eller plasmidpreps) ved hjelp av Nanodrop (ND-1,000).
    MERK: Hvis du bruker en DNA-polymerase/buffer som er direkte kompatibel med nedstrøms cellefri reaksjon, kan rensetrinnet (trinn 2) hoppes over helt og konsentrasjonen av urenset DNA måles ved en fluorometrisk analyse med DNA-bindende fargestoff i stedet (se Batista et al.10).

5. Eksperimentell utførelse

MERK: I tillegg til å bruke tilleggsfil 1 til å kalibrere bufferlageret for hver lysatbatch som er klargjort (over), anbefales det å bruke fanen 'Reaksjonsforberedelse' i filen for å sette opp de påfølgende cellefrie reaksjonene. Som tidligere er reaksjonenes volum satt til 10,5 μL per reaksjon, hvorav bare 10 μL til slutt pipetteres i 384-brønnsplaten for datainnsamling. Her brukes 5 nM av hver mal for cellefritt uttrykk. Det er viktig å være konsekvent når pipettering av reaksjonene - bruk samme pipette og type spisser. Dispenser forsiktig for å unngå bobler i brønnen eller væske som fester seg til brønnens vegger. Spinn om nødvendig ned platen (<2 500 x g, 1 min, romtemperatur).

  1. Beregn volumene som skal pipettes ved å legge inn prøvebeskrivelsene og replikasjonene som trengs per prøve i fanen 'Reaksjonsforberedelse' i tilleggsfil 1.
    MERK: Hvis det kreves et annet reaksjonsvolum enn 10,5 μL, kan det også legges inn i tilleggsfil 1. Filen vil beregne antall rør av tidligere optimaliserte bufferlagre og celleekstraktrørene som skal tines på is.
  2. Merk et 1,5 ml mikrorør for optimal Master Mix-preparat (separat for lineært og plasmid-DNA), tilsett de riktige volumene av bufferen og lysatet, og bland forsiktig.
    MERK: På grunn av forskjeller i optimale K-glukonsentrasjoner i bufferne, bør kopier av fanen 'Reaksjonsforberedelse' lages for bruk separat for lineært og plasmid-DNA.
  3. Pipetter DNA-prøvene først, etterfulgt av nukleasefritt vann, og til slutt Optimal Master Mix (MM) fra trinn 5.2. Bland den cellefrie reaksjonen forsiktig med pipetten like før du legger til plateleseren og unngå bobler.
    MERK: Bruk et PCR-åtte-strimmelrør for å blande reaksjonsvolumet for en ekstra replikasjon. For eksempel, hvis tekniske triplikater er tiltenkt, lag en blanding for fire reaksjoner og la et dødt volum ligge i røret for å redusere pipetteringsfeil mens du legger prøvene til platen.
  4. Sett opp reaksjonene i plateleseren (Ex 485 nm; Em 528 nm). Kinetiske løp registrerte fluorescensdata med jevne mellomrom (f.eks. 5 min) i 8 timers inkubasjon ved 30 °C, med kontinuerlig orbital risting ved 307 cpm.
    MERK: Endepunktsmålinger ble rapportert som 8 timers tidspunkt. Fluorescensverdiene som samles inn er i vilkårlige enheter (a.u.), men de kan konverteres til standardiserte enheter for plotting (se nedenfor).

6. FITC og GFP relativ kvantifisering

MERK: GFP-uttrykk eksporteres av plateleseren i vilkårlige fluorescensenheter (a.u.). Det anbefales imidlertid å bruke standardiserte måleenheter for å sammenligne fluorescensverdier mellom forskjellige innstillinger (batcher, utstyr, brukere og laboratorier). Her presenteres detaljerte trinn for å konvertere fluorescensverdiene (a.u.) til FITC-ekvivalente og eGFP (μM)-verdier, ved bruk av standardkurver for NIST-FITC og rekombinant eGFP. Oppbevar NIST-FITC lagerløsning ved 4 °C og oppbevar rekombinant eGFP ved -20 °C. Sørg for at stamløsningen og seriefortynninger er beskyttet mot lys. Ved levering anbefales det å aliquot den rekombinante eGFP i mindre volumer for å unngå flere fryse-tine sykluser.

  1. Klargjør en oppløsning med 100 mM natriumborat, pH 9,5, og oppbevar den ved romtemperatur eller ved 4 °C.
  2. Forbered 12 fortynninger (70 μL hver) for standardkurven, 2x per trinn (50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562, 0,781, 0,390, 0,195, 0,097, 0,048 og 0 μM) NIST-sporbar FITC-standard fra 50 μM lager ved bruk av natriumboratløsningen. Forbered fortynningsserien i tre eksemplarer.
  3. I likhet med trinn 6.2, fremstill serielle fortynninger (70 μL hver) fra den rekombinante eGFP ved bruk av natriumboratoppløsningen (1,2, 0,3, 0,075, 0,0188, 0,0047, 0,0012, 0,0003, 0,00007 og 0 μM). For molaritetsberegning, vurder proteinets fulle størrelse (28 kDa) og konsentrasjonen av den rensede eGFP (1 g / L). Forbered fortynningsserien i tre eksemplarer.
  4. Tilsett 20 μL av hver fortynning (ni brønner hver = tre fortynninger serie x tre tekniske replikasjoner) i en 384-brønns firkantet mikroplate, dekket av en selvklebende platetetning, og inkuber i en plateleser for måling.
    MERK: Her var innstillingene som ble brukt excitasjon: 485/20, utslipp: 528/20, med gevinst 50. Imidlertid kan ytterligere bølgelengde / forsterkningskombinasjoner også brukes til å kalibrere for andre fluorescerende molekyler og / eller forsterkningsinnstillinger. For å beregne konverteringsfaktoren kreves samme bølgelengde- og forsterkningsinnstillinger for å skaffe GFP-fluorescensdataene fra de cellefrie eksperimentene og standardkurvedataene.
  5. Bruk det lineære signalområdet (her, for eksempel [FITC] ≤ 0,781 μM) for å passe til skråningen [y = ax og R2] for hver tilstand.
    MERK: Utvalget kan variere for forskjellige maskiner og standardløsninger som brukes.
  6. Lagre dataene for FITC- og eGFP-kalibrering for å beregne relative målinger for laboratoriet ved å følge eksemplet i tabell 9. Del verdiene oppnådd i fluorescens vilkårlige enheter (a.u.) med kurvehellingen "a" -verdien (y = ax) for å estimere GFP-produksjon når det gjelder FITC eller eGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her vises representative resultater etter kalibrering av lysatet for optimale Mg-glutamat- og K-glutamatnivåer separat for lineært og plasmid-DNA (figur 1). Mg-glutamat optimal konsentrasjon er lik på tvers av Δ recB og ΔrecBCD ekstrakter ved 8 mM (figur 1B). Imidlertid er den optimale K-glutamatkonsentrasjonen for plasmid-DNA 140 mM, mens den optimale K-glutamatkonsentrasjonen for lineært DNA for samme ekstrakt er 20 mM (figur 1C). I en komparativ analyse av GFP-ekspresjon i ekstrakter fra WT- og ΔrecBCD-celler ble det sett at buffersammensetningen av ekstrakter må kalibreres spesifikt for optimal ekspresjon fra lineært og plasmid-DNA brukt i eksonuklease V-slettede ekstrakter.

Etter kalibreringstrinn ble nivåer av GFP-uttrykk sammenlignet fra lineært og plasmid-DNA (5 nM) i WT- og Δ recBCD-ekstraktet (figur 1D). GFP-ekspresjon fra lineært DNA nådde 102% og 138% av uttrykket fra plasmid-DNA i ekstrakter fra henholdsvis ΔrecB- og ΔrecBCD-stammer. Sammen viser disse resultatene at ekspresjon fra lineært DNA, ved hjelp av en innfødt E. coli σ70-promotor, kan nå samme nivå som fra plasmiduttrykk når cellelysatet fremstilles fra slike mutanter og den cellefrie bufferen er spesielt kalibrert for lineært DNA.

Figure 1
Figur 1: Differensiell bufferoptimalisering for lineært og plasmid-DNA i ΔrecB/ΔrecBCD-ekstrakter. (A) En 1361 bp lineær DNA-amplikon ble forsterket fra plasmid p70a-deGFP og brukt som mal for genuttrykk for bufferkalibrering. (B) Mg-glutamat bufferkalibrering med 1 nM av hver DNA-type ved bruk av forskjellige konsentrasjoner fra 0 til 20 mM (med K-glutamat fast ved 80 mM). Firkantede bokser angir valgte konsentrasjonspunkter. P = plasmid DNA, L = lineært DNA. (C) Etter å ha valgt den optimale Mg-glutamatkonsentrasjonen for hvert lysat, ble K-glutamat titrert fra 20 til 240 mM. Firkantede bokser angir valgte konsentrasjonspunkter. P = plasmid DNA, L = lineært DNA. Data vist i varmekartene (B) og (C) er fra et enkelt eksperiment. (D) Etter bufferkalibrering ble cellefrie reaksjoner utført med 5 nM av hver DNA-type. Extract BL21 Rosetta2 støtter ikke lineær DNA-ekspresjon, mens differensielt optimaliserte ekstrakter fra ΔrecB- og ΔrecBCD-stammer utviser lineært DNA (grønt) uttrykk som ligner på plasmid DNA (blå) nivåer. Viste endepunktdata er gjennomsnittlig ± SD for tre replikasjoner gjort på samme dag og samlet inn etter 8 timers inkubasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Visuell representasjon av protokollen. Arbeidsflyt for cellelysatpreparering og lysatoptimalisering for lineært DNA som mal i CFPS-syntese. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Liste over komponenter for fremstilling av flytende og faste 2xYT+P-medier. Mengden (i gram) av hver komponent er spesifisert for 1 liter medium. Skaler opp proporsjonalt etter behov. Mediene må autoklaveres før bruk. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Liste over komponenter for fremstilling av buffer S30A+DTT. Mengden (i gram) av hver komponent er spesifisert for 1 L buffer S30A. Skaler opp proporsjonalt etter behov. S30A-bufferen må autoklaveres og deretter kjøles ned (4 °C) før bruk. DTT-bufferen må fremstilles og filtreres separat som angitt (i 15 ml rør) og oppbevares i -20 °C. Rett før du bruker buffer S30A, legg til 2 ml DTT (fra 1 M lager) til 1 L S30A-buffer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Liste over komponenter for klargjøring av energiløsninger. Mengden (i gram) eller volumet av hver komponent er spesifisert (i kolonne G) for fremstilling av et spesifisert volum (i kolonne H) av stamløsninger for den angitte konsentrasjonen (i kolonne F). PH for hver komponent må justeres om nødvendig, som det er angitt (i kolonne I og J). 14x energiløsningslager fremstilles ved å blande det oppførte volumet av hver komponent (i kolonne K) i den angitte rekkefølgen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Liste over komponenter for fremstilling av aminosyreoppløsning. For fremstilling av 4x aminosyreoppløsningen må alle aminosyrene blandes i den rekkefølgen som er oppført. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5. Liste over komponenter for fremstilling av lysatkalibreringsløsninger. Mengden (i gram) av Mg-glutamat og K-glutamat stamløsninger er spesifisert for å fremstille 50 ml av den angitte konsentrasjonen av hver buffer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 6: Liste over bakteriestammer brukt i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 7: Liste over primere brukt i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 8: Plasmid brukt i denne protokollen for lysatkalibrering og som mal for lineær DNA-amplifisering ved PCR. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 9: FITCH- og eGFP-konvertering. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi at cellelysat fremstilt fra E. coli BL21 Rosetta2 med en genomisk knockout for enten recB - eller recBCD-operon støtter høyt proteinuttrykk fra lineære DNA-maler . Denne protokollen utdyper en trinnvis lysatkalibreringsprosedyre som er spesifikk for lineære DNA-maler (figur 2), som er et kritisk trinn som fører til at det høye uttrykket fra σ70-promotorer i lineært DNA, når nærplasmidnivåer for ekvimolære DNA-konsentrasjoner. Denne protokollen fremhever viktigheten av bufferkalibrering i henhold til typen DNA (lineært eller plasmid) som skal brukes i den endelige applikasjonen.

Protokollen kan bidra til å unngå plasmidkloning, noe som gir betydelige gevinster i tid og kostnad. Lineære DNA-fragmenter kan syntetiseres av kommersielle leverandører og/eller forsterkes ved PCR i laboratoriet. Den samme prosessen ved bruk av plasmid-DNA vil ta minst 1 uke lenger, med tanke på kloning, sekvensverifisering og DNA-forberedelsestrinn10. Det anbefales å forberede store mengder av celleekstraktet og lineære DNA-maler for å minimere batch-til-batch-variabilitet mellom eksperimenter14,15.

Denne metoden har vist seg å være robust og brukes på tvers av laboratorier10. Resultatene fra disse ekstraktene har vært konsistente på tvers av biologiske replikasjoner, forskjellige ekstraktbatcher, samt på tvers av forskjellige stammebakgrunner10. Robustheten til protokollen har også blitt testet på tvers av forskjellige eksperimentelle parametere: cellelysemetoder, temperaturer, DNA-maler og forskjellige DNA-konsentrasjoner. Metoden er allerede brukt for rask screening og karakterisering av genetiske konstruksjoner for to relevante anvendelser: toehold switch library characterization og enzyme activity screening10.

Selv om høye ekspresjonsnivåer ble oppnådd i denne studien fra lineært DNA i ΔrecB / ΔrecBCD-ekstrakter fra den svært produktive foreldrestammen E. coli BL21 Rosetta2, ville metoden kreve genomteknikk for en ny stamme av interesse. I motsetning til dette er tilskudd med beskyttelsesmidler for lineært DNA, som GamS5 eller Chi DNA6, lettere å søke om en ny belastning, men dyrere og mer tidkrevende.

Protokollen som er gitt her, vil lette bruken av lineære DNA-maler i cellefrie systemer og akselerere design-build-test-syklusene for det syntetiske biologisamfunnet. Enklere cellefritt uttrykk fra lineære DNA-maler i ΔrecB / ΔrecBCD-ekstrakter kan distribueres for produksjon av små molekyler av interesse, biosimilarer og andre on-demand pasientnære applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

ACB og JLF anerkjenner finansieringsstøtte fra ANR SINAPUV-tilskuddet (ANR-17-CE07-0046). JLF og JB anerkjenner finansieringsstøtte fra ANR SynBioDiag-tilskuddet (ANR-18-CE33-0015). MSA og JLF anerkjenner finansieringsstøtte fra ANR iCFree-tilskuddet (ANR-20-BiopNSE). JB anerkjenner støtte fra ERC som starter "COMPUCELL" (tilskuddsnummer 657579). Centre de Biochimie Structurale anerkjenner støtte fra den franske infrastrukturen for integrert strukturbiologi (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK anerkjenner finansieringsstøtte fra INRAes MICA-avdeling, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) -regionens DIM-RFSI og ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Dette arbeidet ble støttet med finansiering gjennom European Research Council Consolidator Award (865973 til CLB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-YT Broth Invitrogen 22712020
1.5 mL Safe-Lock tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL microtube
384-well square-bottom microplate Thermo Scientific Nunc 142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) Sigma-Aldrich P8877
adhesive plate seal Thermo Scientific Nunc 232701
Agar Invitrogen 30391023
ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A8937
BL21 Rosetta2 Merck Millipore 71402
BL21 Rosetta2 ΔrecB Addgene 176582
BL21 Rosetta2 ΔrecBCD Addgene 176583
cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) Sigma-Aldrich  A9501
Chloramphenicol  Sigma-Aldrich C0378
CoA (Coenzyme A hydrate) Sigma-Aldrich C4282
Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile Corning 430790 15 mL tube
Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile Corning 430828 50 mL tube
CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) Alfa Aesar  J62238
DpnI NEB R0176S
DTT (DL-Dithiothreitol) Sigma-Aldrich D0632
Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) Sigma-Aldrich F7878
GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,  Disodium Salt) Sigma-Aldrich 371701
HEPES Sigma-Aldrich  H3375
K phosphate dibasic (K2HPO4) Carl Roth 231-834-5
K phosphate monobasic (H2KO4P) Sigma-Aldrich P5655
K-glutamate Alfa Aesar A17232
Mg-glutamate  Sigma-Aldrich 49605
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone Merck Millipore SLGP033RB membrane filter 0.22 µm
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit NEB T1030S PCR & DNA cleanup Kit
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010S Plasmid Miniprep Kit
NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)  Sigma-Aldrich  N6522
NIST-traceable FITC standard Invitrogen F36915 NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kit Macherey-Nagel 740414.1 Plasmid Maxiprep Kit
PEG 8000 Sigma-Aldrich 89510
plate reader Biotek  Synergy HTX
Purified Recombinant EGFP Protein Chromotek egfp-250 recombinant eGFP
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0492S DNA polymerase
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix New England Biolabs M0492L DNA polymerase
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Q32850 fluorometric assay with DNA-binding dye
RTS Amino Acid Sampler biotechrabbit BR1401801
Spermidine Sigma-Aldrich 85558
Sterile water Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving.
Tris base Life Science products Cytiva 17-1321-01 
tRNA Roche 10109550001
Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 SONICS VC505 sonicator
UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) Acros Organics  226310010
Water, nuclease-free Thermo R0581 nuclease-free water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
  3. Schinn, S. -M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
  4. Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
  5. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  6. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
  7. Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
  8. Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
  9. Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
  10. Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
  11. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
  12. Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  13. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  14. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  15. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).

Tags

Bioteknologi utgave 186
Cellefri proteinsyntese fra eksonuklease-mangelfulle cellulære ekstrakter ved bruk av lineære DNA-maler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabeti Azad, M., Cardoso Batista,… More

Sabeti Azad, M., Cardoso Batista, A., Faulon, J. L., Beisel, C. L., Bonnet, J., Kushwaha, M. Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates. J. Vis. Exp. (186), e64236, doi:10.3791/64236 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter