Summary
Het huidige protocol combineert ex vivo stimulatie en flowcytometrie om polyfunctionele T-cel (TPF) profielen te analyseren in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) binnen Japanse encefalitisvirus (JEV) -gevaccineerde kinderen. De detectiemethode en het flowcytometriekleurenschema van JEV-specifieke TPF's werden getest om een referentie te bieden voor vergelijkbare studies.
Abstract
T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een belangrijke rol bij het beheersen van flavivirusinfectie, hetzij na vaccinatie of na natuurlijke infectie. De "kwaliteit" van een T-cel moet worden beoordeeld op functie en een hogere functie wordt geassocieerd met een krachtigere immuunbescherming. T-cellen die tegelijkertijd twee of meer cytokines of chemokines op eencellig niveau kunnen produceren, worden polyfunctionele T-cellen (TPFs) genoemd, die immuunresponsen bemiddelen via een verscheidenheid aan moleculaire mechanismen om degranulatiemarkers (CD107a) tot expressie te brengen en interferon (IFN) -γ, tumornecrosefactor (TNF) -α, interleukine (IL) -2 of macrofaag ontstekingseiwit (MIP) -1α uit te scheiden. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat TPF'snauw samenhangen met het behoud van het langetermijnimmuungeheugen en de bescherming en dat hun verhoogde aandeel een belangrijke marker is van beschermende immuniteit en belangrijk is voor de effectieve bestrijding van virale infecties en reactivering. Deze evaluatie is niet alleen van toepassing op specifieke immuunresponsen, maar ook op de beoordeling van kruisreactieve immuunresponsen. Hier, met het Japanse encefalitisvirus (JEV) als voorbeeld, werden de detectiemethode en het flowcytometriekleurenschema van JEV-specifieke TPF'sgeproduceerd door perifere mononucleaire bloedcellen van kinderen die waren gevaccineerd tegen Japanse encefalitis getest om een referentie te bieden voor vergelijkbare studies.
Introduction
Japans encefalitisvirus (JEV) is een belangrijk door muggen overgedragen virus dat behoort tot het geslacht Flavivirus binnen de Flaviviridae-familie1. Veel landen in Azië en de Stille Oceaan worden al lang geconfronteerd met enorme uitdagingen op het gebied van de volksgezondheid als gevolg van de enorme ziektelast veroorzaakt door Japanse encefalitis (JE), maar dit is dramatisch verbeterd met de toenemende beschikbaarheid van verschillende soorten vaccinaties2. Adaptieve beschermende immuunresponsen die worden opgeroepen door natuurlijke infectie of vaccinatie dragen bij aan de preventie en antivirale regulatie. Humorale immuniteit en celgemedieerde immuniteit worden geclassificeerd als adaptieve immuniteit, en de inductie van de eerste is altijd beschouwd als een belangrijke strategie bij het ontwerpen van vaccins, zij het met relatief beperkt begrip in het verleden3. De rol van T-cel-gemedieerde immuniteit bij het beperken van flavivirusverspreiding en virusklaring is echter steeds meer gericht op en uitgebreid bestudeerd4. Bovendien is T-celimmuniteit niet alleen onmisbaar bij JEV-specifieke antivirale reacties, maar speelt het ook een prominente rol bij kruisbescherming tegen secundaire infectie met heterologe flavivirussen, wat in eerdere studies is aangetoond5. Er wordt gespeculeerd dat dit effect potentiële antilichaam-gemedieerde versterkingseffecten bij infectie5 kan omzeilen. Van belang is dat een dergelijke kruisreactieve T-celimmuniteit belangrijk is, vooral bij afwezigheid van vaccins en antivirale geneesmiddelen tegen flavivirussen. Hoewel er veel studies zijn uitgevoerd om de bijdrage van T-cellen aan JEV-infectie te bepalen met betrekking tot CD4+ en CD8+ T-cellen 6,7, blijven de respectieve afstammingslijnen die cytokines afscheiden en hun functionele diversificatie onbepaald, wat betekent dat de opheldering van de exacte functies van helper- en killer T-cellen wordt belemmerd.
De schaal van hun antivirale afweer bepaalt de kwaliteit van T-celresponsen. CD4+ of CD8+ T-cellen die compatibel twee of meer functies kunnen verlenen, waaronder cytokinesecretie en degranulatie, worden gekarakteriseerd als polyfunctionele T-cellen (TPFs) bij specifieke stimulatie op eencellig niveau8. CD4 + T-cellen die enkele of meerdere cytokines produceren, kunnen verschillende effecten en immuungeheugens hebben. IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-cellen hebben bijvoorbeeld meer kans om een effectieve beschermende respons op lange termijn te vormen dan IL-2+ CD4+ T-cellen9, die kunnen worden gebruikt als een belangrijke parameter bij het evalueren van het vaccinatie-effect. De frequentie van IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-cellen is verhoogd bij patiënten met langdurige niet-progressie van verworven immuundeficiëntiesyndroom (AIDS), terwijl CD4+ T-cellen bij patiënten met AIDS-progressie meer geneigd zijn om alleen IFN-γ te produceren vanwege het bevorderende effect van IL-2 op T-celproliferatie10. Bovendien bleek een subset van IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ langdurig in vivo te overleven en synergetisch de dodingsfunctiete bevorderen 11. Hoewel CD8+ T-cellen meer kans hebben om cytotoxische activiteit te vertonen, zijn sommige CD4+ T-cellen ook uitgerust met cytotoxische activiteit als een indirect gedetecteerde expressie van oppervlakte-CD107a-moleculen12. Bovendien drukken bepaalde T-celsubsets de chemokine MIP-1α uit, die vaak wordt uitgescheiden door monocyten om deel te nemen aan T-cel-gemedieerde neutrofiele rekrutering13. Op dezelfde manier kunnen CD8 + TPF'sook worden gebruikt om de veelzijdigheid van de bovenstaande markers te karakteriseren. Studies hebben aangetoond dat de prime-boost-strategie effectief een langdurige periode van TPF-beschermende effecten kan induceren13, wat de bescherming die door vaccinatie wordt opgewekt, kan verbeteren. Een centraal kenmerk bij het onderzoeken van het immuunsysteem is het vermogen van geheugen-T-cellen om sterkere, snellere en effectievere reacties op secundaire virale uitdagingen mogelijk te maken dan naïeve T-cellen. Effectorgeheugen T-cellen (TEM) en T-cellen met centraal geheugen (TCM) zijn belangrijke T-celsubsets die vaak worden gedifferentieerd door de samengestelde expressie van CD27/CD45RO of CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ of CCR7+ CD45RA-) heeft de neiging om te lokaliseren in secundaire lymfoïde weefsels, terwijl TEM (CD27- CD45RO+ of CCR7- CD45RA-) lokaliseert in lymfoïde en perifere weefsels15,16. TEM biedt onmiddellijke maar niet aanhoudende verdediging, terwijl TCM de respons ondersteunt door zich te vermenigvuldigen in de secundaire lymfoïde organen en nieuwe effectoren te genereren17. Aangezien geheugencellen specifieke en efficiënte terugroepreacties op virussen kunnen bemiddelen, rijzen er dus vragen over de bijdrage van deze subset van polyfuncties.
Met de ontwikkeling van flowcytometrietechnologie is het gebruikelijk geworden om tegelijkertijd markers van meer dan 10 clusters, fenotypen en differentiatieantigenen te detecteren, wat gunstig is om de functionele immunologische kenmerken op individuele T-cellen overvloediger te annoteren om misinterpretatie en moeilijkheden bij het begrijpen van T-celfenotypen te verminderen. Deze studie gebruikte ex vivo stimulatie en flowcytometrie om TPF-profielen in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) bij JEV-gevaccineerde kinderen te analyseren. Door deze aanpak toe te passen, zal het begrip van korte- en langetermijn JEV-specifieke en zelfs cross-reactieve T-celimmuniteit geïnduceerd door vaccinatie worden uitgebreid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische goedkeuring voor de huidige studie werd verkregen door de ethische commissie van het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (goedkeuringsnummer: 2020-k-85). Vrijwilligers werden gerekruteerd van Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Perifere veneuze bloedmonsters werden verkregen van ogenschijnlijk gezonde kinderen (2 jaar oud) die eerder een prime en verhoogde vaccinatie hadden gekregen met levend verzwakt JE SA14-14-2-vaccin gedurende minder dan een half jaar (JE-gevaccineerde kinderen, n = 5) en niet-gevaccineerde kinderen (6 maanden oud, n = 5). Geïnformeerde toestemming van menselijke proefpersonen werd opgeheven omdat alleen de resterende monsters, na klinisch te zijn getest, in deze studie werden gebruikt. Om de privacy van de vrijwilligers te beschermen, werden alle gegevens volledig geanonimiseerd en gedeïdentificeerd.
1. Isolatie van PBMC's uit perifeer veneus bloed
- Verzamel perifere veneuze bloedmonsters (2 ml) van JE-gevaccineerde en niet-gevaccineerde kinderen in EDTA-K 2-antistollingsbuizen (zie materiaaltabel) met behulp van de standaard venapunctietechniek18.
- Voeg 2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) toe om het perifere bloed te verdunnen.
OPMERKING: Het proces wordt zo snel mogelijk afgehandeld om maximale overlevingskansen te behouden. - Voeg 4 ml van het dichtheidsgradiëntmedium (zie materiaaltabel) toe aan een centrifugebuis van 15 ml en breng het verdunde bloed langzaam over naar de bovenste laag van het scheidingsmedium.
OPMERKING: Meng het bloed niet met het scheidingsmedium en vernietig het contactoppervlak dat door de twee vloeistoffen wordt gevormd; anders wordt het scheidingseffect niet bereikt. - Centrifugeer bij 800 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Observeer de significante lagen na centrifugatie.
- Breng de PBMC's (de middelste laag) over naar een andere centrifugebuis van 15 ml en was de PBMC's met 10 ml RPMI-1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS, zie materiaaltabel).
- Centrifugeer op 800 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet.
- Resuspendeer de PBMC's met 1 ml RPMI-1640 medium met 10% FBS en tel de cellen met een op trypan blue gebaseerde geautomatiseerde teller (zie Materiaaltabel).
2. Stimulatie van PBMC's door geïnactiveerde JEV-deeltjes om cytokine-expressie te induceren
- Stel twee subgroepen van de JEV-stimulatie- en controlegroepen in respectievelijk de JE-gevaccineerde en niet-gevaccineerde monsters in.
- Pas het aantal PBMC's aan op 2 × 106 cellen / ml met RPMI-1640-medium dat 10% FBS bevat en zaai de PBMC's in 24-well platen (2 × 106 cellen / 1 ml medium per put); ent drie putten voor elke groep.
- Stimuleer de PBMC's van de JEV-stimulatiegroep met geconcentreerde geïnactiveerde JEV-deeltjes5 (2 × 105 PFU) gedurende 16 uur bij 37 °C in aanwezigheid van monoklonale antilichamen CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) en CD49d (1 μg/ml), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) en monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Gebruik voor oppervlaktekleuring BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000) (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De JEV werd geïnactiveerd door UV-bestraling zoals eerder beschreven19. - Stimuleer de PBMC's van de controlegroep zonder geconcentreerde virusdeeltjes gedurende 16 uur bij 37 °C in aanwezigheid van monoklonale antilichamen CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) en CD49d (1 μg/ml, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) en monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Beits het oppervlak met BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000).
3. Ex vivo intracellulaire kleuring
- Verzamel de celsuspensie van elke groep in een microcentrifugebuis van 1,5 ml, centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant met een pipet.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml 1x PBS, voeg fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof (1 μL / ml, 1: 1.000, zie tabel met materialen) toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Centrifugeer bij 500 × g (bij kamertemperatuur) gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml van 1x PBS. Centrifugeer bij 500 × g (bij kamertemperatuur) gedurende 5 min. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Voer kleuring van het celoppervlakmarkering uit.
- Resuspendeer de cellen in 100 μL 1x PBS en voeg 2 μL van elk oppervlaktemarkersantilichaam (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 en BV480-anti-CD45RO, verdunningsfactor: 1:50, zie Materiaaltabel) toe aan de celsuspensie in elke buis.
OPMERKING: Het kleur fluorescerende antilichaamkleuringsprotocol is weergegeven in tabel 1. - Incubeer de buizen (stap 3.4.1) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en bescherm ze tegen licht. Centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
OPMERKING: Het antilichaam van BUV737-anti-CD27 en BV480-anti-CD45RO kan worden vervangen door BUV737-anti-CCR7 en BV480-anti-CD45RA als annotatie van de geheugen-T-cellen.
- Resuspendeer de cellen in 100 μL 1x PBS en voeg 2 μL van elk oppervlaktemarkersantilichaam (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 en BV480-anti-CD45RO, verdunningsfactor: 1:50, zie Materiaaltabel) toe aan de celsuspensie in elke buis.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml van 1x PBS. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Voer fixatie en membraanbreuk uit.
- Resuspendeer de cellen met 500 μL membraanbrekende fixatieve oplossing (zie Materiaaltabel) en fixeer de cellen gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml van 1x PBS. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 × g bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant voorzichtig.
- Voer intracellulaire cytokinekleuring uit.
- Resuspensie de cellen in 100 μL van 1x PBS en voeg 2 μL van elk cytokine-antilichaam (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 en APC-anti-MIP-1α, verdunningsfactor: 1:50, zie Materiaaltabel) toe aan de celsuspensie in elke buis.
OPMERKING: De volumes en informatie over geconjugeerde antilichamen van fluoroforen zijn weergegeven in tabel 1. - Incubeer de buizen (stap 3.8.1) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspensie de cellen in 100 μL van 1x PBS en voeg 2 μL van elk cytokine-antilichaam (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 en APC-anti-MIP-1α, verdunningsfactor: 1:50, zie Materiaaltabel) toe aan de celsuspensie in elke buis.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml van 1x PBS. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant voorzichtig. Voeg 500 μL 1x PBS toe om de cellen te resuspenderen.
4. Flowcytometrie opstelling
- Isoleer het PBMC-monster alleen volgens de in stap 1 beschreven procedures als het controlemonster. Verdeel de celsuspensie in 12 gelijke delen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml (100 μL/buis) zoals hieronder vermeld.
- Stel onbevlekte, APC-Cy7-live/dead fixable stained, BV650-anti-CD3 single-stained, BUV395-anti-CD4 single-stained, BV421-anti-CD8 single-stained, BUV737-anti-CD27 single-stained, BV480-anti-CD45RO stained, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ stained, PE-anti-TNF-α single-stained, BV785-anti-IL-2 single-stained en APC-anti-MIP-1α single-stained samples.
- Voeg de celoppervlakmarkers en intracellulaire cytokinekleuring toe zoals beschreven in stap 3. Voeg voor elk monster met één kleuring slechts één van de fluoroforen uit de kleuringsstap toe. Voeg 500 μL 1x PBS toe om de cellen en vortex met lage snelheid te resuspenderen.
- Gebruik een niet-gekleurd monster om de voorwaartse verstrooiing (FSC), zijverstrooiing (SSC) en verschillende fluorescerende kleurstofspanningen aan te passen.
OPMERKING: Voor deze studie zijn de volgende spanningen ingesteld. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V en BV785: 725 V. - Pas met behulp van de single-staining monsters de flowcytometriecompensatie aan om de contaminatiesignalen tussen de verschillende fluoroforen te elimineren.
OPMERKING: De compensatieparameters zijn weergegeven in tabel 2.
5. Gating strategie en data-analyse
OPMERKING: In deze studie werden voor deze analyse de T-cellen van het centrale geheugen (TCM van CD8+ of CD4+ T-cellen als CD27+ CD45RO+ of CCR7+ CD45RA- en de effectorgeheugen T-cellen (TEM) van CD8+ of CD4+ T-cellen als CD27- CD45RO+ of CCR7- CD45RA- respectievelijkgedefinieerd 16.
- Teken een polygoonpoort door het FSC-gebied (FSC-A)/SSC-gebied (SSC-A) dot plot om de intacte lymfocytenpopulatie te selecteren met uitsluiting van het puin (figuur 1A).
- Teken een rechthoekige poort door de FSC-A/FSC-width (FSC-W) dot plot om de afzonderlijke cellen te selecteren (figuur 1B).
- Teken een rechthoekige poort door de live/dead/SSC-A dot plot om de levende cellen te selecteren (Figuur 1C).
- Teken een rechthoekige poort door de CD3/SSC-A dot plot om de CD3+ T-cellen te identificeren (Figuur 1D).
- Teken een quad gate door de CD4/CD8 dot plot om de CD4+ of CD8+ T cellen te identificeren (Figuur 1E).
- Teken een quad gate door de CD45RO/CD27 dot plot om de CD4+ of CD8+ T cellen onder te verdelen in TCM (CD27+ CD45RO+) en TEM (CD27- CD45RO+) (Figuur 1F-I).
- Teken de poorten van CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 en MIP-1α uit de TCM - of TEM-cellen van de CD8+ of CD4+ T-cellen om respectievelijk de frequentie van verschillende responspatronen te bepalen.
- Laad de monsters sequentieel op de cytometrie. Gebruik een stophek20 om 1 × 106 lymfocyten te verkrijgen.
OPMERKING: De individuele gebruiker kan meer dan 1 × 106 cellen verzamelen. Dit aantal was een compromis tussen de tijd die nodig was en het verzamelen van voldoende cellen om zinvolle resultaten te leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de gatingstrategie die wordt gebruikt om de TCM of TEM van CD8+ of CD4+ T-cellen te verdelen uit een representatieve JEV-stimulatiegroep van JE-gevaccineerde kinderen. De FSC-A/SSC-A dot plot wordt gebruikt om lymfocyten te identificeren, en de FSC-A/FSC-W dot plot wordt gebruikt om afzonderlijke cellen te identificeren. Levensvatbare cellen worden geselecteerd op de live/dead/SSC-A dot plot. De CD3/SSC-A dot plot wordt gebruikt om de CD3+ T cellen te identificeren. De CD4/CD8 dot plot wordt gebruikt om respectievelijk de CD3+ CD4+ en CD3+ CD8+ T cellen te identificeren. De TCM (CD27+ CD45RO+) en TEM (CD27- CD45RO+) van CD8+ of CD4+ T cellen worden afzonderlijk geselecteerd op de CD45RO/CD27 dot plot. Cellen met het fenotype CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ en MIP-1α+ van CD8+ TCM (figuur 1F), CD8+ TEM (figuur 1G), CD4+ TCM (figuur 1H) en CD4+ TEM (figuur 1I) worden afzonderlijk geselecteerd door de overeenkomstige rechthoekige poort te tekenen.
De polyfunctionele karakterisering van centrale en effectorgeheugen CD4+ en CD8+ T-celresponsen (inclusief degranulatie, cytokines en chemokines) op JEV bij JE-gevaccineerde en niet-gevaccineerde kinderen wordt weergegeven in tabel 3. Deze resultaten geven aan dat verhoogde niveaus van CD107a, IFN-γ, TNF-α en IL-2 werden gedetecteerd in de CD8 + TCM-cellen van de gevaccineerde kinderen na JEV-stimulatie in vergelijking met die bij niet-gevaccineerde kinderen. Het niveau van MIP-1α verschilde niet tussen de twee groepen. Van TEM-cellen wordt gedacht dat ze antivirale effecten uitoefenen direct na restimulatie met JEV. Hogere niveaus van CD107a en IFN-γ werden gedetecteerd in de CD8 + TEM-cellen van de gevaccineerde groep onder JEV-stimulatie in vergelijking met de niet-gevaccineerde groep. TNF-α, IL-2 en MIP-1α waren echter niet significant verhoogd in die positieve cellen.
Het JEV-antigeen induceerde met succes hogere niveaus van CD107a, IFN-γ, TNF-α en MIP-1α in de CD4 + TCM-cellen van de gevaccineerde groep in vergelijking met de niet-gevaccineerde groep. Het aandeel IL-2+ cellen verschilde echter niet tussen de twee groepen onder JEV-stimulatie. Het aandeel van de CD107a+, IFN-γ+ en TNF-α+ subgroepen van CD4+ TEM-cellen in de gevaccineerde groep was hoger in aanwezigheid van JEV dan in de niet-gevaccineerde groep.
Figuur 1: Illustratie van de gatingstrategie om de TCM of TEM van CD8+ of CD4+ T cellen en hun subsets te identificeren. (A) Lymfocyten werden geïdentificeerd met behulp van de FSC-A/SSC-A dot plot. (B) Afzonderlijke cellen werden geïdentificeerd met behulp van de FSC-A/FSC-W dot plot. (C) Levende cellen werden geïdentificeerd met behulp van de live/dead/SSC-A dot plot. (D) CD3+ T-cellen werden geïdentificeerd met behulp van de CD3/SSC-A dot plot. (E) CD3+ CD4+ T en CD3+ CD8+ T cellen werden geïdentificeerd met behulp van de CD4/CD8 dot plot. (F) CD8+ TCM met het fenotype CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ en MIP-1α+ werden afzonderlijk onderverdeeld. (G) CD8+ TEM met de vijf fenotypen werden afzonderlijk onderverdeeld. (H) CD4+ TCM met de vijf fenotypen werden afzonderlijk onderverdeeld. (I) CD4+ TEM met de vijf fenotypen werden afzonderlijk onderverdeeld. De getallen op elk paneel vertegenwoordigen het percentage cellen in de poorten. De kleurcodering vertegenwoordigt de frequentie van voorkomen van de cellen, waarbij rood de hoogste frequentie is en blauw de laagste. Afkortingen: SSC-A = side scatter-area; FSC-A = voorwaarts strooigebied; FSC-W = voorwaartse strooibreedte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antilichaam Target | Geconjugeerde fluorofoor | Dosering | Kloon | Isotype | Excitatie laserlijn | Ex-Max (nm) | Em-Max (nm) |
| Cd3 | Bv650 | 2 μL | Sk7 | Muis IgG1, κ | Violet | 407 | 650 |
| Cd4 | Buv395 | 2 μL | Sk3 | Muis IgG1, κ | UV | 348 | 39 |
| cd8 | Bv421 | 2 μL | Sk1 | Muis IgG1, κ | Violet | 407 | 421 |
| cd27 | Buv737 | 2 μL | L128 | Muis IgG1, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RO | Bv480 | 2 μL | Uchl1 | Muis IgG2a, κ | Violet | 436 | 478 |
| Ccr7 | Buv737 | 2 μL | 3D12 | Rat IgG2a, κ | UV | 350 | 737 |
| Cd45ra | Bv480 | 2 μL | HI100 | Muis IgG2b, κ | Violet | 436 | 478 |
| CD107A | Bv605 | 2 μL | H4A3 | Muis IgG1, κ | Violet | 407 | 602 |
| Il-2 | Bv785 | 2 μL | MQ1-17H12 | Rat IgG2a, κ | Violet | 407 | 786 |
| IFN-γ | Fitc | 2 μL | 4S. B3 | Muis IgG1, κ | Blauw | 494 | 520 |
| TNF-α | PE | 2 μL | MAB11 | Muis IgG1, κ | Geel-Groen | 496, 564 | 578 |
| MIP-1α | APC | 2 μL | 11a3 | Muis IgG2a, κ | Rood | 650 | 660 |
| Zombie NIR | APC-Cy7 | 1 μL | - | - | Rood | 650 | 779 |
Tabel 1: Het kleur fluorescerende antilichaamkleuringsprotocol voor flowcytometrische analyses. Afkortingen: BV = brilliant violet; BUV = briljant ultraviolet; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanine.
| Compensatiereferentie van flowcytometrie (%) | ||||||||||||
| Fitc | APC | APC-Cy7 | Bv421 | Bv480 | Bv605 | Bv560 | Bv785 | Buv395 | Buv737 | PE | ||
| Fitc | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-Cy7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| Bv421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| Bv480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| Bv605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| Bv560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| Bv785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| Buv395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| Buv737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| PE | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
Tabel 2: De compensatieparameters voor flowcytometrische analyses. Afkortingen: BV = brilliant violet; BUV = briljant ultraviolet; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanine.
| Groep van TPF | Polyfunctionele karakterisering (%) | |||||||
| Prikkel | CD107A | IFN-γ | TNF-α | Il-2 | MIP-1α | |||
| CD8+ T-cellen | TCM | Gevaccineerde | JEV | 1,50±0,48 | 1,60±0,69 | 0,66±0,32 | 0,54±0,27 | 0,16±0,11 |
| Ctrl | 0,51±0,38 | 0,31±0,13 | 0,28±0,13 | 0,37±0,20 | 0,02±0,05 | |||
| Niet-gevaccineerd | JEV | 0,38±0,19 | 0,20±0,03 | 0,19±0,09 | 0,16±0,04 | 0,19±0,09 | ||
| Ctrl | 0,50±0,28 | 0,27±0,09 | 0,19±0,05 | 0,23±0,14 | 0,08±0,11 | |||
| P-waarde* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| TEM | Gevaccineerde | JEV | 1,47±0,58 | 1.21±0.22 | 0,49±0,36 | 0,33±0,31 | 0,24±0,17 | |
| Ctrl | 0,82±0,48 | 0,39±0,15 | 0,16±0,18 | 0,23±0,256 | 0,09±0,21 | |||
| Niet-gevaccineerd | JEV | 0,41±0,25 | 0,14±0,09 | 0,15±0,11 | 0,20±0,07 | 0,15±0,13 | ||
| Ctrl | 0,34±0,13 | 0,21±0,15 | 0,17±0,10 | 0,19±0,19 | 0,01±0,02 | |||
| P-waarde* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| CD4+ T-cellen | TCM | Gevaccineerde | JEV | 1,55±0,43 | 1,16±0,24 | 0,57±0,25 | 0,29±0,18 | 0,19±0,07 |
| Ctrl | 0,44±0,27 | 0,26±0,20 | 0,15±0,06 | 0,12±0,06 | 0,04±0,07 | |||
| Niet-gevaccineerd | JEV | 0,28±0,08 | 0,21±0,08 | 0,17±0,03 | 0,21±0,16 | 0,10±0,03 | ||
| Ctrl | 0,31±0,13 | 0,26±0,06 | 0,14±0,04 | 0,25±0,13 | 0,04±0,04 | |||
| P-waarde* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| TEM | Gevaccineerde | JEV | 1,54±0,58 | 1.33±0.15 | 0,89±0,25 | 0,37 ±0,22 | 0,21±0,05 | |
| Ctrl | 0,46±0,49 | 0,35±0,30 | 0,13±0,08 | 0,14±0,09 | 0,05±0,11 | |||
| Niet-gevaccineerd | JEV | 0,27±0,09 | 0,23±0,10 | 0,30±0,15 | 0,23±0,03 | 0,14±0,06 | ||
| Ctrl | 0,35±0,21 | 0,24±0,14 | 0,19±0,20 | 0,25±0,08 | 0,05±0,07 | |||
| P-waarde* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * Mann-Whitney U-test, PBMC's van gevaccineerde persoon gestimuleerd door JEV vs. PBMC's van niet-gevaccineerde personen gestimuleerd door JEV werden alleen getoond. | ||||||||
Tabel 3: Polyfunctionele karakterisering van de TCM en TEM van CD4+ of CD8+ T celresponsen op JEV. Gevaccineerd, n = 5; niet-gevaccineerd, n = 5. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. P < 0,05 duidde op een significant verschil. * PBMC's van gevaccineerde personen gestimuleerd door JEV versus PBMC's van niet-gevaccineerde personen die alleen door JEV worden gestimuleerd, worden getoond. Afkortingen: TPFs = polyfunctionele T-cellen; IFN-γ = interferon-γ; TNF-α = tumornecrosefactor-α; IL-2 = interleukine-2; MIP-1α = macrofaag inflammatoir eiwit-1α; TCM = centraal geheugen T-cellen; TEM = effectorgeheugen T-cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol vertegenwoordigt een haalbare op flowcytometrie gebaseerde detectiemethode voor TPF-profielen in de PBMC's van kinderen die zijn gevaccineerd met het JEV-vaccin SA14-14-2. Deze studie gebruikte de veneuze bloed PBMC's van zowel gevaccineerde als niet-gevaccineerde kinderen als onderzoeksmateriaal. Met de stimulatie van PBMC's met het JEV-antigeen kunnen die versterkte antigeenspecifieke TPF'sworden gekenmerkt door multicolor flowcytometrie-antilichaamkleuring. In vergelijking met de conventionele enzyme-linked immunospot assay-methode, is het uitstekende voordeel van flowcytometrie dat de functionele kenmerken van PBMC's op het niveau van één cel zo divers mogelijk worden gepresenteerd, waardoor het aantal PBMC's dat nodig is voor detectie wordt verminderd, wat vooral geschikt is voor kinderen.
Een duidelijke vaccinatiegeschiedenis, gehandhaafde levensvatbaarheid van de cel, de T-celimmunogeniteit van de stimulator en compatibele kleurmatchingstrategieën zijn kritieke stappen in dit protocol. China heeft de vaccinatie van JEV SA14-14-2 sinds 2008 opgenomen in het nationale uitgebreide immunisatieprogramma en heeft de vaccinatiegeschiedenis opgenomen in uniform beheer, dat beschikbaar is gekomen voor de toegankelijkheid van de vaccingeschiedenis3. De PBMC's die in dit protocol zijn onderzocht, werden experimenteel op ijs gehouden om de maximale levensvatbaarheid van de cel te behouden. Het gebruik van specifieke stimuli is eerder op grote schaal aangetoond als effectief 4,5,21,22. De kleurmatchingstrategie is de belangrijkste beperking in deze methode en de bruikbaarheid van deze strategie is gepresenteerd in de continue verfijning voorafgaand aan de test en het matchen van instrumentparameters. Bovendien bood dit protocol twee opties voor het annoteren van de geheugen-T-cellen. Door de bovenstaande configuratie en optimalisatie van de experimentele parameters kan het haalbaar zijn om specifieke en zelfs cross-reactieve immuniteit te meten door de schaal en frequentie van TPF-reacties op vaccinatie te beoordelen door middel van flowcytometrie. De vijf representatieve indicatoren om TPF'ste karakteriseren zijn echter een beperking van deze studie; de momenteel gangbare functionele moleculen (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 en MIP-1α) kunnen worden uitgebreid om het spectrum te detecteren om de veelzijdigheid van TPFs op basis van het gepresenteerde protocol vollediger te karakteriseren.
JEV-infectie wordt beschouwd als een door vaccinatie te voorkomen ziekte waarbij vaccinatie-opgeroepen geheugen T-celreacties van cruciaal belang kunnen zijn bij het handhaven van langdurige immuunbescherming, vooral omdat antilichaamresponsen in de loop van de tijd afnemen4. Als de belangrijkste totipotent beschermende component in geheugen T-cellen, moet TPFs worden voorgesteld als een routinetestitem voor de evaluatie van de werkzaamheid van vaccins en, omgekeerd, het ontwerp en de ontwikkeling van gerichte T-celvaccins begeleiden. In feite wordt de rol van T-celimmuniteit bij flavivirusinfectiecontrole steeds meer gewaardeerd en kan het zelfs de rol van antilichamen ten goede of ten kwade omzeilen5. De verduidelijking van het TPF-profiel zal ongetwijfeld het repertoire van antigene epitopen verder beperken, wat de kosten van vaccins zal verminderen door de targeting te verbeteren. De synergetische effecten van CD4+ en CD8+ T-cellen vullen elkaar aan en zijn ongetwijfeld prominenter aanwezig op TPF's. Daarom wordt voorgesteld dat studies over TPF'szich richten op (1) profielverschillen tussen TPF'sop lange en korte termijn; (2) de identificatie van T PF-epitopen waarvoor HLA-beperkingen gelden; en (3) de verkenning en het onderzoek van meer polyfunctionele subpopulaties.
Het identificeren van TPF-cellen in de immuuncontrole van virale infectie was gemeld 23,24,25. De beschrijving van de volledige detectiestrategie en het proces van TPF'sis echter niet goed georganiseerd. Bovendien is het kleurenschema van deze methode van toepassing op modellen met meerdere flowcytometers. De markeringen kunnen ook worden aangepast om andere functionele subgroepen te detecteren op basis van deze kleurovereenkomst.
Deze studie leverde een TPF-detectiestrategie op door ex vivo specifieke stimulatie en flowcytometrie te combineren om T PF-subsetprofielen in de PBMC's van JEV-vaccinontvangers te analyseren. De geïsoleerde PBMC's werden eerst gestimuleerd met het JEV-antigeen en vervolgens gekleurd met de overeenkomstige fluorescerend gelabelde antilichamen, en JEV-specifieke CD4 + en CD8 + geheugen TPF-swerden gekenmerkt door flowcytometrie. Op basis van dit resultaat kunnen de T PF-frequenties van dubbele, drievoudige, viervoudige en vijfvoudige functies verder worden berekend om TPF'sgedetailleerder en uitgebreider te beschrijven. Routinematige veneuze bloedvolumes (2 ml) bij kinderen zijn voldoende gebleken voor TPF-onderzoeken. Daarom wordt verwacht dat de detectiemethoden voor virusspecifieke TPF'szullen worden gebruikt om metingen van T-cel-gemedieerde adaptieve immuniteit geassocieerd met vaccinatie of infectie te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
R.W. werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82002130), beijing natural science foundation of China (7222059). ZD.X. werd ondersteund door het CAMS Innovatiefonds voor Medische Wetenschappen (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A.
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
