Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस (जेईवी) -टीकाकरण वाले बच्चों के भीतर परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) में पॉलीफंक्शनल टी सेल (टीपीएफ) प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए एक्स विवो उत्तेजना और फ्लो साइटोमेट्री को जोड़ता है। जेईवी-विशिष्ट टीपीएफ की पहचान विधि और प्रवाह साइटोमेट्री रंग योजना का परीक्षण इसी तरह के अध्ययनों के लिए एक संदर्भ प्रदान करने के लिए किया गया था।
Abstract
टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा फ्लेविवायरस संक्रमण को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, या तो टीकाकरण के बाद या प्राकृतिक संक्रमण के बाद। टी सेल की "गुणवत्ता" को फ़ंक्शन द्वारा मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है, और उच्च कार्य अधिक शक्तिशाली प्रतिरक्षा सुरक्षा से जुड़ा होता है। टी कोशिकाएं जो एक साथ एकल-कोशिका स्तर पर दो या दो से अधिक साइटोकिन्स या केमोकाइन का उत्पादन कर सकती हैं, उन्हें पॉलीफंक्शनल टी सेल (टीपीएफएस) कहा जाता है, जो डिग्रेनुलेशन मार्करों (सीडी 107 ए) को व्यक्त करने और इंटरफेरॉन (आईएफएन) -γ, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ) -α, इंटरल्यूकिन (आईएल) -2, या मैक्रोफेज भड़काऊ प्रोटीन (एमआईपी) -1 को स्रावित करने के लिए विभिन्न आणविक तंत्रों के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मध्यस्थता करते हैं। इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि टीपीएफदीर्घकालिक प्रतिरक्षा स्मृति और सुरक्षा के रखरखाव से निकटता से संबंधित हैं और उनका बढ़ा हुआ अनुपात सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा का एक महत्वपूर्ण मार्कर है और वायरल संक्रमण और पुनर्सक्रियन के प्रभावी नियंत्रण में महत्वपूर्ण है। यह मूल्यांकन न केवल विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर लागू होता है, बल्कि क्रॉस-रिएक्टिव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन पर भी लागू होता है। यहां, जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस (जेईवी) को एक उदाहरण के रूप में लेते हुए, जापानी एन्सेफलाइटिस के खिलाफ टीकाकरण वाले बच्चों के परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित जेईवी-विशिष्ट टीपीएफकी पहचान विधि और फ्लो साइटोमेट्री रंग योजना का परीक्षण इसी तरह के अध्ययनों के लिए संदर्भ प्रदान करने के लिए किया गया था।
Introduction
जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस (जेईवी) फ्लेविविरिडे परिवार1 के भीतर जीनस फ्लेविवायरस से संबंधित एक महत्वपूर्ण मच्छर जनित वायरस है। कई एशिया-प्रशांत देशों को जापानी एन्सेफलाइटिस (जेई) के कारण भारी बीमारी के बोझ के कारण लंबे समय से भारी सार्वजनिक स्वास्थ्य चुनौतियों का सामना करना पड़ा है, लेकिन विभिन्न प्रकार के टीकाकरण की बढ़ती उपलब्धता के साथ इसमें नाटकीय रूप से सुधारहुआ है। प्राकृतिक संक्रमण या टीकाकरण द्वारा उत्पन्न अनुकूली सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं रोकथाम और एंटीवायरल विनियमन में योगदान करती हैं। ह्यूमरल इम्युनिटी और सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा को अनुकूली प्रतिरक्षा के रूप में वर्गीकृत किया गया है, और पूर्व के प्रेरण को हमेशा वैक्सीन डिजाइन में एक महत्वपूर्ण रणनीति के रूप में माना जाता है, हालांकि पिछले3 में अपेक्षाकृत सीमित समझ के साथ। हालांकि, फ्लेविवायरस प्रसार और वायरस निकासी को सीमित करने में टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा की भूमिका पर तेजी से ध्यानकेंद्रित किया गया है और बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। इसके अलावा, टी सेल प्रतिरक्षा न केवल जेईवी-विशिष्ट एंटीवायरल प्रतिक्रियाओं में अपरिहार्य है, बल्कि हेटरोलॉगस फ्लेविवायरस के साथ माध्यमिक संक्रमण से क्रॉस-प्रोटेक्शन में भी एक प्रमुख भूमिका निभाती है, जिसे पिछलेअध्ययनों में प्रदर्शित किया गया है। यह अनुमान लगाया जाता है कि यह प्रभाव संक्रमण 5 में संभावित एंटीबॉडी-मध्यस्थता वृद्धि प्रभावों को बायपास करसकता है। ध्यान दें, इस तरह के क्रॉस-रिएक्टिव टी सेल प्रतिरक्षा महत्वपूर्ण है, खासकर फ्लेविवायरस के खिलाफ टीकों और एंटीवायरल दवाओं की अनुपस्थिति में। यद्यपि सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं 6,7 के संबंध में जेईवी संक्रमण में टी कोशिकाओं के योगदान को निर्धारित करने के लिए कई अध्ययन किए गए हैं, साइटोकिन्स और उनके कार्यात्मक विविधीकरण को स्रावित करने वाले संबंधित वंश अनिर्धारित रहते हैं, जिसका अर्थ है कि सहायक और हत्यारा टी कोशिकाओं के सटीक कार्यों की व्याख्या में बाधा उत्पन्न होती है।
उनके एंटीवायरल बचाव का पैमाना टी सेल प्रतिक्रियाओं की गुणवत्ता निर्धारित करता है। सीडी 4 + या सीडी 8 + टी कोशिकाएं जो साइटोकिन स्राव और विघटन सहित दो या दो से अधिक कार्यों को प्रदान कर सकती हैं, उन्हें एकल-कोशिका स्तर8 पर विशिष्ट उत्तेजना पर पॉलीफंक्शनल टी कोशिकाओं (टीपीएफ) के रूप में जाना जाता है। सीडी 4 + टी कोशिकाएं जो एकल या कई साइटोकिन्स का उत्पादन करती हैं, उनमें विभिन्न प्रभाव और प्रतिरक्षा यादें हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, आईएल -2 + आईएफएन -γ + सीडी 4 + टी कोशिकाएं आईएल -2 + सीडी 4 + टी कोशिकाओं9 की तुलना में दीर्घकालिक प्रभावी सुरक्षात्मक प्रतिक्रिया बनाने की अधिक संभावना रखती हैं, जिसका उपयोग टीकाकरण प्रभाव का मूल्यांकन करने में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में किया जा सकता है। आईएल -2 + आईएफएन -γ + सीडी 4 + टी कोशिकाओं की आवृत्ति अधिग्रहित प्रतिरक्षा कमी सिंड्रोम (एड्स) की दीर्घकालिक गैर-प्रगति वाले रोगियों में बढ़ जाती है, जबकि एड्स की प्रगति वाले रोगियों में सीडी 4 + टी कोशिकाएं टी सेल प्रसार10 पर आईएल -2 के बढ़ावा देने वाले प्रभाव के कारण अकेले आईएफएन -γ का उत्पादन करने के लिए अधिक इच्छुक होती हैं। इसके अलावा, आईएल -2 + आईएफएन -γ + टीएनएफ -α + का एक उप-समूह विवो में लंबे समय तक जीवित रहने और सहक्रियात्मक रूप से किलिंग फ़ंक्शन11 को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था। यद्यपि सीडी 8 + टी कोशिकाएं साइटोटोक्सिक गतिविधि प्रदर्शित करने की अधिक संभावना रखती हैं, कुछ सीडी 4 + टी कोशिकाएं सतह सीडी 107 ए अणुओं12 की अप्रत्यक्ष रूप से पता लगाई गई अभिव्यक्ति के रूप में साइटोटोक्सिक गतिविधि से भी लैस होती हैं। इसके अलावा, कुछ टी सेल उपसमुच्चय केमोकाइन एमआईपी -1 को व्यक्त करते हैं, जिसे अक्सर टी सेल-मध्यस्थता न्यूट्रोफिल भर्ती13 में भाग लेने के लिए मोनोसाइट्स द्वारा स्रावित किया जाता है। इसी तरह, सीडी 8 + टीपीएफका उपयोग उपरोक्त मार्करों की बहुमुखी प्रतिभा को चिह्नित करने के लिए भी किया जा सकता है। अध्ययनों से पता चला है कि प्राइम-बूस्ट रणनीति प्रभावी रूप से टीपीएफ सुरक्षात्मक प्रभाव13 की लंबी अवधि को प्रेरित कर सकती है, जो टीकाकरण द्वारा प्राप्त सुरक्षा को बढ़ा सकती है। प्रतिरक्षा प्रणाली की जांच में एक केंद्रीय विशेषता मेमोरी टी कोशिकाओं की क्षमता है जो भोले टी कोशिकाओं की तुलना में माध्यमिक वायरल चुनौतियों के लिए मजबूत, तेज और अधिक प्रभावी प्रतिक्रियाओं की सुविधा प्रदान करती है। प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाएं (टीईएम) और केंद्रीय मेमोरी टी कोशिकाएं (टीसीएम) महत्वपूर्ण टी सेल उपसमुच्चय हैं जो अक्सर सीडी 27 / सीडी 45 आरओ या सीसीआर 7 / सीडी 45 आरए14 की समग्र अभिव्यक्ति द्वारा विभेदित होते हैं। टीसीएम (सीडी 27 + सीडी 45 आरओ + या सीसीआर 7 + सीडी 45 आरए -) माध्यमिक लिम्फोइड ऊतकों में स्थानीयकृत होता है, जबकि टीईएम (सीडी 27- सीडी 45 आरओ + या सीसीआर 7- सीडी 45 आरए -) लिम्फोइड और परिधीय ऊतकों में स्थानीयकृत होता है। टीईएम तत्काल लेकिन निरंतर रक्षा प्रदान नहीं करता है, जबकि टीसीएम माध्यमिक लिम्फोइड अंगों में प्रसार और नए प्रभावकों को उत्पन्न करके प्रतिक्रिया को बनाएरखता है। इस प्रकार, यह देखते हुए कि मेमोरी कोशिकाएं वायरस के लिए विशिष्ट और कुशल रिकॉल प्रतिक्रियाओं को मध्यस्थ कर सकती हैं, पॉलीफ़ंक्शंस के इस उप-समूह के योगदान के बारे में सवाल उठते हैं।
फ्लो साइटोमेट्री तकनीक के विकास के साथ, 10 से अधिक समूहों, फेनोटाइप्स और भेदभाव एंटीजन के मार्करों का एक साथ पता लगाना आम हो गया है, जो टी सेल फेनोटाइप्स की गलत व्याख्या और कठिनाइयों को कम करने के लिए व्यक्तिगत टी कोशिकाओं पर कार्यात्मक इम्यूनोलॉजिकल विशेषताओं को अधिक प्रचुर मात्रा में एनोटेट करने के लिए फायदेमंद है। इस अध्ययन ने जेईवी-टीकाकरण वाले बच्चों के भीतर परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) में टीपीएफ प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए एक्स विवो उत्तेजना और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया। इस दृष्टिकोण को लागू करते हुए, टीकाकरण द्वारा प्रेरित लघु और दीर्घकालिक जेईवी-विशिष्ट और यहां तक कि क्रॉस-रिएक्टिव टी सेल प्रतिरक्षा की समझ का विस्तार किया जाएगा।
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Protocol
वर्तमान अध्ययन के लिए नैतिक अनुमोदन बीजिंग चिल्ड्रन हॉस्पिटल, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी की आचार समिति द्वारा प्राप्त किया गया था (अनुमोदन संख्या: 2020-के -85)। स्वयंसेवकों को बीजिंग चिल्ड्रन हॉस्पिटल, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी से भर्ती किया गया था। परिधीय शिरापरक रक्त के नमूने स्पष्ट रूप से स्वस्थ बच्चों (2 वर्ष की आयु) से प्राप्त किए गए थे, जिन्होंने पहले आधे साल से कम समय के लिए लाइव-एटेन्यूएटेड जेई एसए 14-14-2 वैक्सीन के साथ एक प्रमुख और बढ़ावा दिया था (जेई-टीकाकरण वाले बच्चे, एन = 5) और बिना टीकाकरण वाले बच्चे (6 महीने, एन = 5)। मानव विषयों की सूचित सहमति को माफ कर दिया गया था क्योंकि नैदानिक रूप से परीक्षण किए जाने के बाद केवल अवशिष्ट नमूने इस अध्ययन में उपयोग किए गए थे। स्वयंसेवकों की गोपनीयता की रक्षा के लिए, सभी डेटा को पूरी तरह से अनाम और डी-आइडेंटिफाई किया गया था।
1. परिधीय शिरापरक रक्त से पीबीएमसी का अलगाव
- मानक वेनिपंक्चर तकनीक18 द्वारा ईडीटीए-के 2-एंटीकोगुलेटेड ट्यूबों में जेई-टीकाकरण और बिना टीकाकरण वाले बच्चों से परिधीय शिरापरक रक्त के नमूने (2 एमएल) एकत्र करें (सामग्री की तालिका देखें)।
- परिधीय रक्त को पतला करने के लिए फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (1x PBS) के 2 एमएल जोड़ें।
नोट: प्रक्रिया को अधिकतम उत्तरजीविता बनाए रखने के लिए जल्द से जल्द संभाला जाता है। - घनत्व ढाल माध्यम के 4 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, और धीरे-धीरे पतला रक्त को पृथक्करण माध्यम की ऊपरी परत में स्थानांतरित करें।
नोट: रक्त को पृथक्करण माध्यम के साथ मिश्रण न करें या दो तरल पदार्थों द्वारा गठित संपर्क सतह को नष्ट न करें; अन्यथा, पृथक्करण प्रभाव प्राप्त नहीं किया जाएगा। - कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद महत्वपूर्ण परतों का निरीक्षण करें।
- पीबीएमसी (मध्य परत) को एक और 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और पीबीएमसी को 10 एमएल आरपीएमआई -1640 माध्यम के साथ धोएं जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस, सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं।
- कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को सावधानी से छोड़ दें।
- पीबीएमसी को 10% एफबीएस युक्त आरपीएमआई -1640 माध्यम के 1 एमएल के साथ पुन: निलंबित करें और ट्रिपैन ब्लू-आधारित स्वचालित काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
2. साइटोकिन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए निष्क्रिय जेईवी कणों द्वारा पीबीएमसी की उत्तेजना
- जेई-टीकाकरण और बिना टीकाकरण वाले नमूनों में क्रमशः जेईवी उत्तेजना और नियंत्रण समूहों के दो उपसमूह सेट करें।
- पीबीएमसी की संख्या को 10% एफबीएस युक्त आरपीएमआई -1640 माध्यम के साथ 2 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें, और पीबीएमसी को 24-वेल प्लेटों (2 × 106 कोशिकाओं / 1 एमएल माध्यम प्रति कुएं) में बीज दें; प्रत्येक समूह के लिए तीन कुओं का टीकाकरण करें।
- मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सीडी 28(1 μg / mL, 1: 1,000) और CD49d (1μg / mL), गोल्गीप्लग (1 μg / mL, 1: 1,000), और मोनेनिन (1 μg / mL, 1: 1,000), और मोनेनिन (1 μg / mL, 1:1,000) की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए केंद्रित निष्क्रिय जेईवी कण 5 (2 × 105 पीएफयू) के साथ जेईवी उत्तेजना समूह के पीबीएमसी को उत्तेजित करें। सतह धुंधला करने के लिए, BV605-एंटी-CD107a (1 μg/mL, 1:1,000) का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: जेईवी को यूवी विकिरण द्वारा निष्क्रिय कर दिया गया था जैसा कि पहले19 वर्णित है। - मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सीडी 28 (1 μg / mL, 1: 1,000) और CD49d (1 μg / mL, 1: 1,000), गोल्गीप्लग (1 μg / mL, 1: 1,000), और मोनेनिन (1 μg / mL, 1: 1,000), और मोनेनिन (1 μg / mL, 1: 1,000) की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित वायरस कणों के बिना नियंत्रण समूह के PBMCs को उत्तेजित करें। सतह को BV605-एंटी-CD107a (1 μg/mL, 1:1,000) के साथ दाग दें।
3. पूर्व विवो इंट्रासेल्युलर धुंधलापन
- प्रत्येक समूह से सेल निलंबन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
- कोशिका निलंबन में 1 mL 1x PBS में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, सेल निलंबन में फिक्स करने योग्य व्यवहार्यता डाई (1 μL/mL, 1:1,000, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम (कमरे के तापमान पर) पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
- कोशिकाओं को 1x PBS के 1 mL में पुन: निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम (कमरे के तापमान पर) पर। सुपरनैटेंट को सावधानी से छोड़ दें।
- सेल सतह मार्कर धुंधला करने का प्रदर्शन करें।
- कोशिकाओं को 1x PBS के 100 μL में पुन: निलंबित करें, और प्रत्येक ट्यूब में सेल निलंबन के लिए प्रत्येक सतह मार्कर एंटीबॉडी (BV650-एंटी-CD3, BUV395-एंटी-CD4, BV421-एंटी-CD8, BUV737-एंटी-CD27, और BV480-एंटी-CD45RO, कमजोर पड़ने कारक: 1:50, सामग्री की तालिका देखें) के 2 μL जोड़ें।
नोट: रंग फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल तालिका 1 में दिखाया गया है। - कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्यूबों (चरण 3.4.1) को इनक्यूबेट करें, और उन्हें प्रकाश से बचाएं। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
नोट: बीयूवी 737-एंटी-सीडी 27 और बीवी 480-एंटी-सीडी 45 आरओ के एंटीबॉडी को मेमोरी टी कोशिकाओं के एनोटेशन के रूप में बीयूवी 737-एंटी-सीसीआर 7 और बीवी 480-एंटी-सीडी 45 आरए के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
- कोशिकाओं को 1x PBS के 100 μL में पुन: निलंबित करें, और प्रत्येक ट्यूब में सेल निलंबन के लिए प्रत्येक सतह मार्कर एंटीबॉडी (BV650-एंटी-CD3, BUV395-एंटी-CD4, BV421-एंटी-CD8, BUV737-एंटी-CD27, और BV480-एंटी-CD45RO, कमजोर पड़ने कारक: 1:50, सामग्री की तालिका देखें) के 2 μL जोड़ें।
- कोशिकाओं को 1x PBS के 1 mL में पुन: निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनैटेंट को सावधानी से छोड़ दें।
- निर्धारण और झिल्ली तोड़ने का प्रदर्शन करें।
- झिल्ली-ब्रेकिंग फिक्सेटिव समाधान के 500 μL के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें। 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को हटा दें।
- कोशिकाओं को 1x PBS के 1 mL में पुन: निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 500 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को सावधानी से हटा दें।
- इंट्रासेल्युलर साइटोकिन धुंधला करें।
- कोशिकाओं को 1x PBS के 100 μL में पुन: निलंबित करें, और प्रत्येक साइटोकाइन एंटीबॉडी (FITC-एंटी-IFN-γ, PE-एंटी-TNF-α, BV785-एंटी-IL-2, और APC-एंटी-MIP-1, कमजोर पड़ने कारक: 1:50, सामग्री की तालिका देखें) के 2 μL को प्रत्येक ट्यूब में सेल निलंबन में जोड़ें।
नोट: फ्लोरोफोर संयुग्मित एंटीबॉडी पर वॉल्यूम और जानकारी तालिका 1 में दिखाई गई है। - अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्यूबों (चरण 3.8.1) को इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
- कोशिकाओं को 1x PBS के 100 μL में पुन: निलंबित करें, और प्रत्येक साइटोकाइन एंटीबॉडी (FITC-एंटी-IFN-γ, PE-एंटी-TNF-α, BV785-एंटी-IL-2, और APC-एंटी-MIP-1, कमजोर पड़ने कारक: 1:50, सामग्री की तालिका देखें) के 2 μL को प्रत्येक ट्यूब में सेल निलंबन में जोड़ें।
- कोशिकाओं को 1x PBS के 1 mL में पुन: निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और सतह पर तैरने वाले को सावधानी से हटा दें। कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए 1x PBS का 500 μL जोड़ें।
4. फ्लो साइटोमेट्री सेट-अप
- नियंत्रण नमूने के रूप में चरण 1 में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करते हुए अकेले पीबीएमसी नमूने को अलग करें। सेल निलंबन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (100 μL / ट्यूब) में 12 बराबर भागों में विभाजित करें जैसा कि नीचे उल्लेख किया गया है।
- बिना दाग वाले, एपीसी-साइ7-लाइव/डेड फिक्सेबल दागदार, बीवी650-एंटी-सीडी3 सिंगल-सना हुआ, बीयूवी395-एंटी-सीडी4 सिंगल-सना हुआ, बीवी421-एंटी-सीडी8 सिंगल-सना हुआ, बीयूवी737-एंटी-सीडी27 सिंगल-सना हुआ, बीवी480-एंटी-सीडी45आरओ दागदार, बीवी605-एंटी-सीडी107ए, एफआईटीसी-एंटी-आईएफएन-α γ के सिंगल-स्टेन्ड, पीई-एंटी-आईएनएफ-107, पीई-एंटी-आईएनएफ-107, एफआईटीसी-एंटी-आईएफएन-γ के सिंगल-स्टेन्ड नमूने लगाए जाएं।
- चरण 3 में वर्णित सेल सतह मार्कर और इंट्रासेल्युलर साइटोकिन धुंधला जोड़ें। प्रत्येक एकल-धुंधला नमूने के लिए, धुंधला चरण से केवल एक फ्लोरोफोर जोड़ें। कम वेग के साथ कोशिकाओं और भंवर को फिर से निलंबित करने के लिए 1x PBS का 500 μL जोड़ें।
- एक दाग रहित नमूने का उपयोग करके, फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी), साइड स्कैटर (एसएससी), और विभिन्न फ्लोरोसेंट डाई वोल्टेज को समायोजित करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, निम्नलिखित वोल्टेज सेट किए गए थे। एफएससी: 440 वी, एसएससी: 233 वी, बीवी 650: 575 वी, एपीसी-साइ7: 449 वी, बीयूवी 395: 500 वी, बीवी 421: 402 वी, बीयूवी 737: 585 वी, बीवी 480: 444 वी, बीवी 605: 457 वी, एफआईटीसी: 475 वी, पीई: 469 वी, एपीसी: 623 वी, और बीवी 7 - एकल-धुंधला नमूने का उपयोग करके, विभिन्न फ्लोरोफोरे के बीच संदूषण संकेतों को खत्म करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री मुआवजे को समायोजित करें।
नोट: मुआवजा पैरामीटर तालिका 2 में दिखाए गए हैं।
5. गेटिंग रणनीति और डेटा विश्लेषण
नोट: वर्तमान अध्ययन में, इस विश्लेषण के लिए, केंद्रीय मेमोरी टी कोशिकाओं (सीडी 8 + या सीडी 4 + टी कोशिकाओं के टीसीएम को सीडी 27 + सीडी 45 आरओ + या सीसीआर 7 + सीडी 45 आरए के रूप में- और सीडी 8 + या सीडी 4 + टी कोशिकाओं के प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाओं (टीईएम) को सीडी 27- सीडी 45 आरओ + या सीसीआर 7- सीडी 45 आरए के रूप में क्रमशः16 परिभाषित किया गया था।
- मलबे को छोड़कर बरकरार लिम्फोसाइट आबादी का चयन करने के लिए एफएससी-क्षेत्र (एफएससी-ए)/एसएससी-क्षेत्र (एसएससी-ए) डॉट प्लॉट के माध्यम से एक बहुभुज गेट खींचें (चित्रा 1 ए)।
- एकल कोशिकाओं का चयन करने के लिए एफएससी-ए/एफएससी-चौड़ाई (एफएससी-डब्ल्यू) डॉट प्लॉट के माध्यम से एक आयताकार गेट खींचें (चित्रा 1 बी)।
- जीवित कोशिकाओं का चयन करने के लिए जीवित/मृत/एसएससी-ए डॉट प्लॉट के माध्यम से एक आयताकार द्वार बनाएं (चित्र 1सी)।
- सीडी 3 + टी कोशिकाओं (चित्रा 1 डी) की पहचान करने के लिए सीडी 3 / एसएससी-ए डॉट प्लॉट के माध्यम से एक आयताकार गेट खींचें।
- CD4+ या CD8+ T कोशिकाओं (चित्रा 1E) की पहचान करने के लिए CD4/CD8 डॉट प्लॉट के माध्यम से एक क्वाड गेट खींचें।
- CD45RO/CD27 डॉट प्लॉट के माध्यम से एक क्वाड गेट खींचें ताकि CD4+ या CD8+ T कोशिकाओं को TCM (CD27+ CD45RO+) और TEM (CD27- CD45RO+) में उप-विभाजित किया जा सके (चित्र 1F-I)।
- विभिन्न प्रतिक्रिया पैटर्न की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए क्रमशः सीडी 8 + या सीडी 4 + टी कोशिकाओं के टीसीएम या टीईएम से सीडी 107 ए, आईएफएन -γ, टीएनएफ -α, आईएल -2 और एमआईपी -1 के गेट खींचें।
- नमूनों को साइटोमेट्री पर क्रमिक रूप से लोड करें। 1 × 106 लिम्फोसाइट्स प्राप्त करने के लिए स्टॉपिंग गेट20 का उपयोग करें।
नोट: व्यक्तिगत उपयोगकर्ता 10 6 कक्षों × 1 से अधिक एकत्र करसकता है। यह संख्या सार्थक परिणाम प्रदान करने के लिए लगने वाले समय और पर्याप्त कोशिकाओं के संग्रह के बीच एक समझौता था।
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Representative Results
चित्रा 1 जेई-टीकाकरण वाले बच्चों के प्रतिनिधि जेईवी उत्तेजना समूह से सीडी 8 + या सीडी 4 + टी कोशिकाओं के टीसीएम या टीईएम को विभाजित करने के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति को दर्शाता है। एसएससी-ए डॉट प्लॉट का उपयोग लिम्फोसाइटों की पहचान करने के लिए किया जाता है, और एफएससी-ए / एफएससी-डब्ल्यू डॉट प्लॉट का उपयोग एकल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। एसएससी-ए डॉट प्लॉट पर व्यवहार्य कोशिकाओं का चयन किया जाता है। CD3/SSC-A डॉट प्लॉट का उपयोग CD3+ T कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। CD4/CD8 डॉट प्लॉट का उपयोग क्रमशः CD3+ CD4+ और CD3+ CD8+ T कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। CD8+ या CD4+ T कोशिकाओं के TCM (CD27+ CD45RO+) और T EM (CD27- CD45RO+) को CD45RO/CD27 डॉट प्लॉट पर अलग से चुना जाता है। सीडी 8 + टी सीएम (चित्रा 1 एफ), सीडी 8 + γ टी ईएम (चित्रा 1 जी), सीडी 4 + टीसीएम (चित्रा 1 एच), और सीडी 4 + टी ईएम (चित्रा 1 आई) से सीडी 107 ए +, आईएल -2 +, टीएनएफ -2 +, टीएनएफ -α + और एमआईपी -1 + के फेनोटाइप वाली कोशिकाओं को संबंधित आयताकार गेट खींचकर अलग से चुना जाता है।
जेई-टीकाकरण और बिना टीकाकरण वाले बच्चों में जेईवी के लिए केंद्रीय और प्रभावक मेमोरी सीडी 4 + और सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रियाओं (डीग्रेनुलेशन, साइटोकिन्स और केमोकाइन्स सहित) के पॉलीफंक्शनल लक्षण वर्णन तालिका 3 में दिखाए गए हैं। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि बिना टीकाकरण वाले बच्चों की तुलना में जेईवी उत्तेजना के बाद टीका लगाए गए बच्चों के सीडी 8 + टीसीएम कोशिकाओं में सीडी 107 ए, आईएफएन -γ, टीएनएफ -α और आईएल -2 के बढ़े हुए स्तर का पता चला था। एमआईपी -1 का स्तर दोनों समूहों के बीच भिन्न नहीं था। टीईएम कोशिकाओं को जेईवी के साथ पुन: उत्तेजना पर सीधे एंटीवायरल प्रभाव डालने के लिए माना जाता है। बिना टीकाकरण वाले समूह की तुलना में जेईवी उत्तेजना के तहत टीका लगाए गए समूह के सीडी 8 + टीईएम कोशिकाओं में सीडी 107 ए और आईएफएन -γ के उच्च स्तर का पता चला था। हालांकि, टीएनएफ -α, आईएल -2, और एमआईपी -1 , उन सकारात्मक कोशिकाओं में काफी ऊंचा नहीं था।
जेईवी एंटीजन ने बिना टीकाकरण वाले समूह की तुलना में टीकाकरण समूह के सीडी 4 + टीसीएम कोशिकाओं में सीडी 107 ए, आईएफएन -γ, टीएनएफ -α और एमआईपी -1 के उच्च स्तर को सफलतापूर्वक प्रेरित किया। हालांकि, आईएल -2 + कोशिकाओं का अनुपात जेईवी उत्तेजना के तहत दो समूहों के बीच भिन्न नहीं था। टीकाकरण समूह में सीडी 4 + टीईएम कोशिकाओं के सीडी 107 ए +, आईएफएन -γ + और टीएनएफ -α + उपसमुच्चय का अनुपात बिना टीकाकरण वाले समूह की तुलना में जेईवी की उपस्थिति में अधिक था।
चित्र 1: CD8+ या CD4+ T कोशिकाओं के TCM या TEM और उनके उपसमुच्चय की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति का चित्रण। (A) लिम्फोसाइटों की पहचान FSC-A/SSC-A डॉट प्लॉट का उपयोग करके की गई थी। (बी) एफएससी-ए/एफएससी-डब्ल्यू डॉट प्लॉट का उपयोग करके एकल कोशिकाओं की पहचान की गई थी। (ग) जीवित/मृत/एसएससी-ए डॉट प्लॉट का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं की पहचान की गई थी। (घ) सीडी3+टी कोशिकाओं की पहचान सीडी3/एसएससी-ए डॉट प्लॉट का उपयोग करके की गई थी। (E) CD3+ CD4+ T और CD3+ CD8+ T कोशिकाओं की पहचान CD4/CD8 डॉट प्लॉट का उपयोग करके की गई थी। (एफ) सीडी 107 ए +, आईएल -2 +, टीएनएफ -α +, आईएफएन -γ + और एमआईपी -1 + के फेनोटाइप के साथ सीडी 8 + टीसीएम को अलग से विभाजित किया गया था। (जी) पांच फेनोटाइप के साथ सीडी 8 + टीईएम को अलग से विभाजित किया गया था। (एच) पांच फेनोटाइप के साथ सीडी 4 + टीसीएम को अलग से विभाजित किया गया था। (I) पांच फेनोटाइप के साथ सीडी 4 + टीईएम को अलग से विभाजित किया गया था। प्रत्येक पैनल पर संख्याएं गेट में कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती हैं। रंग कोडिंग कोशिकाओं की घटना की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करती है, जहां लाल उच्चतम आवृत्ति है और नीला सबसे कम है। संक्षिप्तरूप: एसएससी-ए = साइड स्कैटर-एरिया; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-क्षेत्र; एफएससी-डब्ल्यू = आगे स्कैटर-चौड़ाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| एंटीबॉडी लक्ष्य | संयुग्मित फ्लोरोफोरे | खुराक | क्लोन | आइसोटाइप | उत्तेजना लेजर लाइन | एक्स-मैक्स (एनएम) | ईएम-मैक्स (एनएम) |
| CD3 | BV650 | 2 μL | SK7 | माउस IgG1, κ | बैंगनी | 407 | 650 |
| CD4 | BUV395 | 2 μL | SK3 | माउस IgG1, κ | यूवी | 348 | 39 |
| CD8 | BV421 | 2 μL | SK1 | माउस IgG1, κ | बैंगनी | 407 | 421 |
| CD27 | BUV737 | 2 μL | L128 | माउस IgG1, κ | यूवी | 350 | 737 |
| CD45RO | BV480 | 2 μL | UCHL1 | Mouse IgG2a, κ | बैंगनी | 436 | 478 |
| CCR7 | BUV737 | 2 μL | 3D12 | Rat IgG2a, κ | यूवी | 350 | 737 |
| CD45RA | BV480 | 2 μL | HI100 | माउस IgG2b, κ | बैंगनी | 436 | 478 |
| CD107a | BV605 | 2 μL | H4A3 | माउस IgG1, κ | बैंगनी | 407 | 602 |
| आईएल -2 | BV785 | 2 μL | MQ1-17H12 | Rat IgG2a, κ | बैंगनी | 407 | 786 |
| IFN-γ | एफआईटीसी | 2 μL | 4 एस। B3 | माउस IgG1, κ | नीला | 494 | 520 |
| TNF-α | पीई | 2 μL | MAB11 | माउस IgG1, κ | पीला-हरा | 496, 564 | 578 |
| MIP-1α | एपीसी | 2 μL | 11A3 | Mouse IgG2a, κ | लाल | 650 | 660 |
| ज़ोंबी एनआईआर | APC-Cy7 | 1 μL | - | - | लाल | 650 | 779 |
तालिका 1: प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए रंग फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल। संक्षिप्तीकरण: बीवी = शानदार बैंगनी; बीयूवी = शानदार पराबैंगनी; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफिकोसायनिन।
| प्रवाह साइटोमेट्री का मुआवजा संदर्भ (%) | ||||||||||||
| एफआईटीसी | एपीसी | APC-Cy7 | BV421 | BV480 | BV605 | BV560 | BV785 | BUV395 | BUV737 | पीई | ||
| एफआईटीसी | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| एपीसी | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-Cy7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| BV421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| BV480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| BV605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| BV560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| BV785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| BUV395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| BUV737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| पीई | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
तालिका 2: प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए मुआवजे के पैरामीटर। संक्षिप्तीकरण: बीवी = शानदार बैंगनी; बीयूवी = शानदार पराबैंगनी; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफिकोसायनिन।
| टीपीएफ का समूह | पॉलीफंक्शनल लक्षण वर्णन (%) | |||||||
| उत्तेजना | CD107a | IFN-γ | TNF-α | आईएल -2 | MIP-1α | |||
| CD8+ T कोशिकाएँ | टीसीएम | टीकाकृत | JEV | 1.50±0.48 | 1.60±0.69 | 0.66±0.32 | 0.54±0.27 | 0.16±0.11 |
| Ctrl | 0.51±0.38 | 0.31±0.13 | 0.28±0.13 | 0.37±0.20 | 0.02±0.05 | |||
| बिना टीकाकरण के | JEV | 0.38±0.19 | 0.20±0.03 | 0.19±0.09 | 0.16±0.04 | 0.19±0.09 | ||
| Ctrl | 0.50±0.28 | 0.27±0.09 | 0.19±0.05 | 0.23±0.14 | 0.08±0.11 | |||
| P मान* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| टीईएम | टीकाकृत | JEV | 1.47±0.58 | 1.21±0.22 | 0.49±0.36 | 0.33±0.31 | 0.24±0.17 | |
| Ctrl | 0.82±0.48 | 0.39±0.15 | 0.16±0.18 | 0.23±0.256 | 0.09±0.21 | |||
| बिना टीकाकरण के | JEV | 0.41±0.25 | 0.14±0.09 | 0.15±0.11 | 0.20±0.07 | 0.15±0.13 | ||
| Ctrl | 0.34±0.13 | 0.21±0.15 | 0.17±0.10 | 0.19±0.19 | 0.01±0.02 | |||
| P मान* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| CD4+ T कोशिकाएँ | टीसीएम | टीकाकृत | JEV | 1.55±0.43 | 1.16±0.24 | 0.57±0.25 | 0.29±0.18 | 0.19±0.07 |
| Ctrl | 0.44±0.27 | 0.26±0.20 | 0.15±0.06 | 0.12±0.06 | 0.04±0.07 | |||
| बिना टीकाकरण के | JEV | 0.28±0.08 | 0.21±0.08 | 0.17±0.03 | 0.21±0.16 | 0.10±0.03 | ||
| Ctrl | 0.31±0.13 | 0.26±0.06 | 0.14±0.04 | 0.25±0.13 | 0.04±0.04 | |||
| P मान* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| टीईएम | टीकाकृत | JEV | 1.54±0.58 | 1.33±0.15 | 0.89±0.25 | 0.37±0.22 | 0.21±0.05 | |
| Ctrl | 0.46±0.49 | 0.35±0.30 | 0.13±0.08 | 0.14±0.09 | 0.05±0.11 | |||
| बिना टीकाकरण के | JEV | 0.27±0.09 | 0.23±0.10 | 0.30±0.15 | 0.23±0.03 | 0.14±0.06 | ||
| Ctrl | 0.35±0.21 | 0.24±0.14 | 0.19±0.20 | 0.25±0.08 | 0.05±0.07 | |||
| P मान* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * मान-व्हिटनी यू-टेस्ट, जेईवी बनाम जेईवी द्वारा प्रेरित टीकाकरण वाले व्यक्ति से पीबीएमसी। जेईवी द्वारा उत्तेजित बिना टीकाकरण वाले व्यक्ति से पीबीएमसी केवल दिखाए गए थे। | ||||||||
तालिका 3: जेईवी के लिए सीडी 4 + या सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रियाओं के टीसीएम और टीईएम का पॉलीफंक्शनल लक्षण वर्णन। टीका लगाया गया, एन = 5; बिना टीकाकरण के, एन = 5। परिणाम एसडी ± औसत के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। पी < 0.05 ने एक महत्वपूर्ण अंतर का संकेत दिया। * केवल जेईवी द्वारा प्रेरित टीकाकरण वाले व्यक्तियों से पीबीएमसी बनाम बिना टीकाकरण वाले व्यक्तियों से प्रेरित पीबीएमसी दिखाए गए हैं। संक्षेप: टीपीएफएस = पॉलीफंक्शनल टी कोशिकाएं; आईएफएन-γ = इंटरफेरॉन-γ; टीएनएफ-α = ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α; आईएल -2 = इंटरल्यूकिन -2; एमआईपी -1 = मैक्रोफेज भड़काऊ प्रोटीन -1; टीसीएम = केंद्रीय मेमोरी टी कोशिकाएं; टीईएम = प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाएं।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल जेईवी वैक्सीन एसए 14-14-2 के साथ टीका लगाए गए बच्चों के पीबीएमसी में टीपीएफ प्रोफाइल के लिए एक व्यवहार्य फ्लो साइटोमेट्री-आधारित पहचान विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस अध्ययन ने अनुसंधान सामग्री के रूप में टीकाकरण और बिना टीकाकरण वाले दोनों बच्चों के शिरापरक रक्त पीबीएमसी का उपयोग किया। जेईवी एंटीजन के साथ पीबीएमसी की उत्तेजना के साथ, उन प्रवर्धित एंटीजन-विशिष्ट टीपीएफको मल्टीकलर फ्लो साइटोमेट्री एंटीबॉडी स्टेनिंग की विशेषता हो सकती है। पारंपरिक एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोस्पॉट परख विधि की तुलना में, फ्लो साइटोमेट्री का उत्कृष्ट लाभ एकल-कोशिका स्तर पर पीबीएमसी की कार्यात्मक विशेषताओं को यथासंभव विविध रूप से प्रस्तुत कर रहा है, जिससे पता लगाने के लिए आवश्यक पीबीएमसी की संख्या कम हो जाती है, जो विशेष रूप से बच्चों के लिए उपयुक्त है।
एक स्पष्ट टीकाकरण इतिहास, सेल व्यवहार्यता बनाए रखना, उत्तेजक की टी सेल इम्युनोजेनेसिटी, और संगत रंग मिलान रणनीतियां इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं। चीन ने 2008 से राष्ट्रीय विस्तारित टीकाकरण कार्यक्रम में जेईवी एसए 14-14-2 के टीकाकरण को शामिल किया है और टीकाकरण इतिहास को एकीकृत प्रबंधन में शामिल किया है, जोवैक्सीन इतिहास की पहुंच के लिए उपलब्ध हो गया है। इस प्रोटोकॉल में जांच किए गए पीबीएमसी को अधिकतम सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए प्रयोगात्मक रूप से बर्फ पर रखा गया था। विशिष्ट उत्तेजनाओं का उपयोग पहले व्यापक रूप से प्रभावी 4,5,21,22 के लिए प्रदर्शित किया गया है। रंग मिलान रणनीति इस विधि में मुख्य बाधा है, और इस रणनीति की प्रयोज्यता को निरंतर पूर्व-परीक्षण शोधन और उपकरण पैरामीटर मिलान में प्रस्तुत किया गया है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल ने मेमोरी टी कोशिकाओं को एनोटेट करने के लिए दो विकल्प प्रदान किए। उपरोक्त विन्यास और प्रयोगात्मक मापदंडों के अनुकूलन के माध्यम से, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा टीकाकरण के लिए टीपीएफ प्रतिक्रियाओं के पैमाने और आवृत्ति का आकलन करके विशिष्ट और यहां तक कि क्रॉस-रिएक्टिव प्रतिरक्षा को मापना प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, टीपीएफको चिह्नित करने के लिए पांच प्रतिनिधि संकेतक इस अध्ययन की एक सीमा हैं; वर्तमान में सामान्य कार्यात्मक अणुओं (सीडी 107 ए, आईएफएन -γ, टीएनएफ -α, आईएल -2, और एमआईपी -1) को स्पेक्ट्रम का पता लगाने के लिए विस्तारित किया जा सकता है ताकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल के आधार पर टीपीएफकी बहुमुखी प्रतिभा को और अधिक पूरी तरह से चिह्नित किया जा सके।
जेईवी संक्रमण को एक टीकाकरण-रोकथाम योग्य बीमारी माना जाता है जिसमें टीकाकरण-उत्पन्न स्मृति टी-सेल प्रतिक्रियाएं लंबे समय तक चलने वाली प्रतिरक्षा सुरक्षा को बनाए रखने में महत्वपूर्ण हो सकती हैं, खासकर जब एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं समय के साथ कम होजाती हैं। मेमोरी टी कोशिकाओं में मुख्य टोटिपोटेंट सुरक्षात्मक घटक के रूप में, टीपीएफको वैक्सीन प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए एक नियमित परीक्षण आइटम के रूप में सुझाया जाना चाहिए और इसके विपरीत, लक्षित टी सेल टीकों के डिजाइन और विकास का मार्गदर्शन करना चाहिए। वास्तव में, फ्लेविवायरस संक्रमण नियंत्रण में टी-सेल प्रतिरक्षा की भूमिका तेजी से सराहना की जा रही है, और यह बेहतर या बदतर 5 के लिए एंटीबॉडी की भूमिका को भी बायपास कर सकतीहै। टीपीएफ प्रोफाइल का स्पष्टीकरण निस्संदेह एंटीजेनिक एपिटोप्स के प्रदर्शनों की सूची को और कम कर देगा, जो लक्ष्यीकरण में सुधार करके टीकों की लागत को कम करने के लिए बाध्य है। सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के सहक्रियात्मक प्रभाव एक दूसरे के पूरक हैं और निस्संदेह टीपीएफपर अधिक प्रमुख हैं। इसलिए, यह प्रस्तावित है कि टीपीएफपर अध्ययन (1) दीर्घकालिक और अल्पकालिक टीपीएफके बीच प्रोफाइल अंतर पर ध्यान केंद्रित करते हैं; (2) एचएलए-प्रतिबंधित टीपीएफ एपिटोप्स की पहचान; और (3) अधिक पॉलीफंक्शनल उप-आबादी की खोज और अनुसंधान।
वायरल संक्रमण के प्रतिरक्षा नियंत्रण में टीपीएफ कोशिकाओं की पहचान 23,24,25 की सूचना दी गई थी। हालांकि, टीपीएफकी पूर्ण पहचान रणनीति और प्रक्रिया का विवरण अच्छी तरह से व्यवस्थित नहीं किया गया है। इसके अलावा, इस विधि की रंग योजना कई प्रवाह साइटोमीटर मॉडल पर लागू होती है। मार्करों को इस रंग मिलान के आधार पर अन्य कार्यात्मक उपसमूहों का पता लगाने के लिए भी समायोजित किया जा सकता है।
इस अध्ययन ने जेईवी वैक्सीन प्राप्तकर्ताओं के पीबीएमसी में टीपीएफ उप-समूह प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए एक्स विवो विशिष्ट उत्तेजना और फ्लो साइटोमेट्री के संयोजन से टीपीएफ डिटेक्शन रणनीति प्रदान की। पृथक पीबीएमसी को पहले जेईवी एंटीजन के साथ उत्तेजित किया गया था और फिर संबंधित फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था, और जेईवी-विशिष्ट सीडी 4 + और सीडी 8 + मेमोरी टीपीएफएस को फ्लो साइटोमेट्री की विशेषता थी। इस परिणाम के आधार पर, डबल, ट्रिपल, चौगुनी और क्विंटपल कार्यों की टीपीएफ आवृत्तियों को टीपीएफका अधिक विस्तार से और अधिक व्यापक रूप से वर्णन करने के लिए आगे गणना की जा सकती है। बच्चों में नियमित शिरापरक रक्त की मात्रा (2 एमएल) को टीपीएफ अध्ययन के लिए पर्याप्त दिखाया गया है। इसलिए, वायरस-विशिष्ट टीपीएफके लिए पता लगाने के तरीकों का उपयोग टीकाकरण या संक्रमण से जुड़े टी सेल-मध्यस्थता अनुकूली प्रतिरक्षा के उपायों का पता लगाने के लिए किए जाने की उम्मीद है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
आरडब्ल्यू को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82002130), बीजिंग नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (7222059) द्वारा समर्थित किया गया था। जेडडी.एक्स को मेडिकल साइंसेज के लिए सीएएमएस इनोवेशन फंड (2019-आई 2 एम-5-026) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
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