Abstract
성인 쥐 및 성장 인자가 풍부한 배지에서 배양 인간 척수 신경 줄기 / 선조 세포 (NSPCs)는 자기 갱신, 및 확장 신경 줄기 세포의 분화능 증식을 허용한다. 혈청 조건에서 이러한 능성 NSPCs는 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성, 차별화됩니다. 수확 된 조직의 bFGF (효소 파파인-EDTA 용액 중에서 해리 한 후 기계적으로 표피 성장 인자 (EGF)가 보충 된 배지로 Neurobasal 배지, 염기성 섬유 아세포 성장 인자에 도금 단일 세포 현탁액을 수득 해리 불연속 밀도 구배를 통해 분리되고 ) 및 헤파린. 성인 쥐 척수 NSPCs은 자기편 문화로 성장 자유 부동 neurosphere를 성인 인간의 척수 NSPCs으로 배양. 이러한 조건 하에서, 성인 척수 NSPCs은 전구 세포의 마커 익스프레스, 증식, 연속적 통로에 확장 될 수있다. 이러한 세포 수 bE는 다양한 자극에 반응하여 시험관 내에서 연구 및 외인성 인자는 신경 줄기 세포의 분화를 검사 혈통 제한을 촉진하기 위해 사용될 수있다. 능성 NSPCs 또는 그들의 자손 또한 회생 수리를 평가하기 위해 다양한 동물 모델에 이식 할 수있다.
Introduction
NSPCs 자기 갱신과 쉽게 체외에서 확장 할 수 있습니다 신경 혈통하기 위해 최선을 다하고 다 능성 세포이다. 그들은 자기 갱신 다 능성 줄기 세포보다 제한 조상의 속성을 표시하기 때문에 우리는 신경 줄기 / 전구 세포의 혼합 인구로이 세포를 참조하십시오. NSPCs은 태아와 성인 뇌와 척수 1, 2 모두에서 발견된다. 성인에서, NSPCs는 일반적으로 대기하고 측면 심실 2-4 안감 뇌실 영역 및 척수 5,6의 중심 운하를 둘러싼 뇌실 주위 백질 영역을 포함하는 특정 틈새 시장 내에 위치.
일반적으로, NSPCs는 EGF와 bFGF를 보충 무 혈청 배지에서 자유 부동 neurosphere를 또는 부착 단일 층, 줄기 / 전구 세포 집단에 대한 선택 분열 촉진으로 배양. 원래 레이놀즈와 바이스 (2)에 의해 개발 된 neurosphere 분석은 가장 일반적으로 문화에 사용되며,신경 줄기 세포를 확장합니다. 그들이 성장 인자 배지 포함 혈청에 도금 할 때 NSPCs는 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포로 분화, 능성을 보여줍니다. 배양 된 조직이 중앙 운하 6,7의 영역을 포함하는 경우 다 능성, 자기 갱신 NSPCs은 성인 쥐에서 척수를 분리하고 배양 할 수있다. 다른 영역으로부터 세포를 생성 반대로 성인 척수에서 생성 NSPCs 사용에 잠재적 이점이 조직 - 특이 적 세포가 가장 근접 부상이나 질병 다음 분실되거나 손상된 척수 세포 유사 있다는 것이다.
이전의 연구는 인간 성인 척수로부터 유래 neurosphere를 장기 또는 세포를 전파 8,9 충분한 수를 생성하기 위해 계대 수 없다는 것을 보여 주었다. 그러나, 배양 조건의 수정을, 우리는 시연, 성인의 척수 유래 NSPCs의 확장과 이식을보고 그 자체 갱신및 다 능성 NSPCs는 장기 이식 공여자 (10)의 성인 인간 척수로부터 분리 될 수있다. 주로, 성장 인자가 풍부한 배지에서 부착 기판에 절개 및 이들 세포를 배양 중에 백질의 대부분의 제거는 인간 성인 척수 NSPCs 증식 선정. 이 프로토콜에서 우리는 성인 쥐에서 인간의 장기 이식 기증자, 뇌실 주위 조직의 절개 및 NSPCs의 분리, 배양 및 확장에서 척수의 수확에 대해 설명합니다.
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Protocol
모든 동물의 절차는 동물 관리에 캐나다위원회에 의해 제조 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 설립 정책에 따라, 캐나다 동물 관리 대학 건강 네트워크의위원회, 토론토에 의해 승인됩니다. 인간의 척수 조직의 수확 용, 승인 대학 건강 네트워크 연구 윤리위원회에서 온타리오, 캐나다에 장기 기증을 감독 생활 재단의 트릴 - 선물로부터 얻은 것입니다.
해부 버퍼 문화 미디어 1. 준비
- 쥐 척수의 분리를 들어, 100 ㎖ 해부 버퍼 (1X PBS + 0.6 % 포도당 + 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신) 냉장을 준비합니다. 인간의 척수를 들어 100 ㎖ 해부 버퍼 (1X HBSS + 0.6 % 포도당 + 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신) 냉장을 준비합니다.
- 37 ° C에서 100 ml의 무 혈청 배지 (SFM)과 따뜻한을 준비합니다. SFM을 준비하기 위해, 2 mM L- 글루타민을 추가, 100 μg의 / m-A로 Neurobasal 배지에 L 페니실린 - 스트렙토 마이신, 2 % B27, 및 10 % 호르몬 믹스. 호르몬 믹스를 준비하려면,은 1 : 0.6 %의 포도당을 함유 한 DMEM / F12 배지를, 3 mM의 NaHCO3를, 5 mM의 HEPES, 25 μg의 / ㎖ 인슐린, 100 μg의 / ㎖ 아포 트랜스페린, 10 μm의 퓨 트레 신 (putrescine), 30 나노 셀레늄, 20 나노 프로게스테론.
- EFH 성장 인자가 풍부한 도금 미디어를 준비 37 ° C에서 따뜻한 SFM (20 NG / ㎖ EGF, 20 NG / ㎖의 bFGF, 2 μg의 / ㎖ 헤파린을 추가 할 수 있습니다). 인간의 EFH 인간 재조합 성장 인자 (재료의 표 참조)이 포함되어 있는지 확인합니다.
2. 수확 및 성인 쥐 뇌실 주위 척수 조직의 해부
- 에탄올 해부기구를 소독하고 사전에 멸균 생리 식염수, 또는 오토 클레이브 장비에 헹군다. 쥐 제공 - 하나의 기관에 따라 (6 ~ 8 주 이전) 나트륨 펜 토바 비탈 (65 ㎎ / ㎖에서 1 CC) 또는 마취 (즉, 4 % 이소 플루오 란)의 과다 복용의 독극물 주사는 동물 프로토콜을 승인했다. 디70 % 에탄올로 쥐의 뒷면을 여러개 대형 해부 가위 등의 표면에 피부를 제거합니다.
- 등의 표면에 수직 가위를 잡고 가로 뒷다리 위의 척추를 잘라. 길이 방향으로 가시 돌기를 노출 주동이의 방향으로 척추를 덮는 등의 근육을 잘라 작은 가위를 사용합니다.
- 노출 된 꼬리 끝에서 시작, 척수와 척추 사이의 공간에서 척추관의 측면 측면에 extradurally rongeurs 또는 작은 무딘 뼈 절단 공구를 삽입합니다. 얇은 판에 작은 상처 (왼쪽 뼈 아치와 척추의 양쪽에 가시 돌기의 권리를) 확인하고 조심스럽게 척수 (그림 1A-D)를 노출하는 얇은 판을 벗겨. 블레이드의 각도가 얕은 확인하고 기본 척수가 손상되지 않도록 코드 평행.
- 박람회에 주동이의 방향으로 추궁 절제술 계속흉부와 경부 척수를 전자.
- 조심스럽게 조심스럽게 코드를 해제 뿌리를 절단하는 무딘 조직 집게 및 사용 microscissors와 척추에서 척수를 절제. (1.1 전술) 4 ℃ 무균 쥐 해부 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 절제 척수를 놓습니다. 갓 준비 4 ° C의 해부 버퍼에 조직을 씻어 사용하는 가위는 1cm 세그먼트 (그림 1E)에 횡 방향으로 척수를 잘라.
- 조직의 각 세그먼트를 들어, 미세 집게로 조직을 잡고 한 손을 사용합니다. 다른 손으로 조심스럽게 해부 범위의 도움으로 덮는 수막, 백질과 회백질의 대부분을 제거 할 수 microscissors를 사용합니다. 대안 적으로, ependyma과 회백질 (도 1F-H)를 둘러싸는 소량 포함 척수의 뇌실 주위 영역을 남기고 회색 및 백색 물질의 대부분을 벗겨 미세 겸자 (4 듀 #)를 사용한다.
- 차가운 쥐 해부 버퍼를 포함하는 10cm 멸균 페트리 접시에 해부 뇌실 주위 조직을 풀.
3. 수확 및 성인의 뇌실 주위 척수 조직의 해부
참고 : 다른 장기는 장기 이식을 위해 제거 된 후 인간의 척수 조직이 성인 장기 이식 기증자에서 수확 (기증자 나이의 2~60년 시대였다). 생활 프로그램의 연령초-선물은 환자의 가족에서 연구 목적으로 조직의 제거를위한 동의를 얻고 우리가 대동맥 크로스 클램핑의 2 시간 이내에 코드를 수확 할 수 있었다 있도록 적시에 우리의 수확 팀을 알립니다. 남성과 여성의 성인 부정적인 혈청과 공여자없이 감염이 허용됩니다.
- 같은 전방 노출을 사용하여 전방 접근법을 통해 수술실에서 멸균 방식으로 수확 조직은 이미 장기 TRANSP에 의한 장기 제거 해부LANT 수확 팀.
- 큰 리브 살포기와 큰 혈관을 포함한 나머지 조직과 장기의 큰 패들 견인기와 후퇴를 통해 전방 척추를 노출.
- 절제 할 수있는 척추의 원하는 길이의 주동이와 꼬리 끝의 추간판 통해 잘라 긴 칼날이 장착 된 흉골 톱을 사용합니다. 각도 톱은 약 45 ° 내측 척추관 단지 짧은 정지 추체의 측면 부분에서 삼각 골을 잘라.
- 일괄 경질을 통해 절단되지 않도록주의하면서 곡선 osteotomes와 망치의 도움으로 원하는 부분의 추체의 중간 부분을 제거합니다. 부드럽게 톱니 집게로 경질 덮여 척수를 들어 올려 급격히 코드의 주동이와 꼬리 끝을 절개. 좌우 각각의 뿌리를 가로로 쪼개다 긴 가위와 집게를 사용합니다.
- 4 °에서 척수의 절제 세그먼트를 배치; C 살균 버퍼 (1X HBSS + 0.6 % 포도당 + 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신) 조직 배양 방에 수송을위한 대형 시험관에서.
- 참고 : 일반적으로 3 - 상부 흉추에서 척수의 6 CM 구간 및 / 또는 중간에 낮은 흉부 수준은 가능한 한 빨리 순환의 중단 후 멸균 조건에서 수술실에서 제거하고 차가운 멸균 버퍼에 배치됩니다 . 순환의 중단 및 척수의 제거 사이에 경과 된 시간은 기부 표적 장기를 수확하는 데 필요한 시간에 따라 변화하고 45 분에서 2 시간 범위였다있다. 심장 및 폐도 제거 된 경우, 절개도 하부 경추 코드의 일부분을 수확하기까지 rostrally 취할 수있다.
- 3 시간 이내에 일반적으로, 수확 후 가능한 한 빨리 인간의 척수 조직을 해부하다. 집게로 경질 및 기타 수막을 제거합니다. 갓 만든 4 ° C의 해부 버퍼의 척수 조직을 씻어1cm 세그먼트에 횡 방향으로 절단.
- 해부 범위의 도움으로, 각 조직 세그먼트에 대한 조직 포셉, 미세 집게와 microscissors를 사용하여 회색 물질의 대부분을 덮는 수막, 백질을 절제합니다. 차가운 인간 해부 버퍼를 포함 10cm 무균 페트리 접시에 ependyma 주변 회백질 소량 포함 해부 뇌실 조직을 풀.
4. 분리 및 배양 성인 쥐와 인간의 척수 NSPCs의
- 층류 후드에서 무균 적으로 다음 단계를 수행한다.
- microscissors와 1mm 3 조각으로 해부 쥐 또는 인간의 뇌실 주위 조직을 말하다.
- 효소 물질 / 시약의 표에 나타낸 바와 같이 파파인 해리 키트를 사용하여 단백질 분해 효소 다진 조직을 해리. 참고 : 시약 구성 요소 4 튜브를 포함한다; 유리 병 1 : 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS), 유리 병 2 : 파파인 containing L의 시스테인 및 EDTA, 바이알 3 : 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase의), 비알 4 : 소 혈청 알부민 (BSA)과 Ovomucoid 프로테아제 억제제.
참고 : 참고 : 파파인은 단백질 기질에 대한 폭 넓은 특이성을 가지고 설 프히 드릴 프로테아제이다. 파파인은 여기 카 리카 파파야 공장에서 라텍스에서 파생 된 대부분의 단백질 기질 더욱 광범위보다 췌장 단백질 분해 효소를 저하된다. 해리 과정에서 점성을 증가시키고 피펫 어려운 것 해리 배지로 방출 될 일부 세포 손상 유발 DNA가있다. 따라서, 그대로는 DNase의 세포에 손상을주지 않고 DNA를 소화하는 세포 분리 방법에 포함된다. Ovomucoids는 분리 단계 이후 파파인 활성을 억제하는 데 사용되는 프로테아제 억제제 당단백된다.
- 처음 사용시, EBSS (유리 병 1) 32 mL로 알부민 ovomucoid 억제제 혼합물 (유리 병 4)를 재구성 한 후 4 ℃에서 저장하고 이후의 절연 부에 사용.참고 :이 ovomucoid 억제제의 10 mg을하고 mL의 알부민 10 ㎎의 유효 농도에서 솔루션을 얻을 수 있습니다.
- 0.5 mM의 EDTA 1 MM의 L 시스테인에서 파파인 / ㎖의 20 대에서 해결책을 산출, 파파인 유리 병 (유리 병 2)에 EBSS (유리 병 1) 5 mL를 추가합니다. 파파인이 완전히 효소의 전체 활동을 보장하기 위해 용해 될 때까지 다른 십분의 37 ° C의 물을 욕조에 병을 배치, 완전히 용해 할 때 파파인 솔루션은 분명 나타나는지 확인합니다.
- (3 병) DNase의 약병에 EBSS (유리 병 1)의 500 μl를 추가하고 DNase의가 변성 전단에 민감한으로 가볍게 섞는다. 약 20 단위 / ml의 파파인 및 0.005 %의 DNase의 최종 농도 결과, 파파인 함유 바이알 DNase의 용액 250 μL를 추가한다. 나중에 사용하기 위해 DNase의 유리 병의 균형을 저장합니다.
- 위의 단계 4.4에서 제조 된 파파인 솔루션에 다진 쥐 또는 인간의 조직을 놓습니다. 인간의 조직 분리를 들어, 둘 사이에 동등하게 다진 조직을 분할파파인 바이알 (약 0.2 g / 병).
- 파파인 활성화 용액 중에 조직을 해리 로커 플랫폼에서 일정한 교반하에 37 ℃에서 인큐베이션. 각각 0.4 g - 약 0.2 다진 조직의 크기에 따라 1 내지 2 시간 동안 45 분에 1 시간, 및 인체 조직에 대한 쥐 조직을 인큐베이션.
- 흐린 세포 현탁액을 수득 나머지 조직편을 해리 10 ㎖ 피펫 혼합물 씹다. 실온에서 5 분 동안 300 XG에 멸균 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 (해리되지 않은 조직의 조각을 포함하지 않는다) 전송합니다.
- 매체에 함유 ovomucoid 파파인 억제제 펠렛 세포를 재현 탁.
- 15 ML 원뿔 튜브에 재구성 알부민 ovomucoid 방지 액 (유리 병 4) 300 μL와 2.7 ml의 EBSS (유리 병 1)을 혼합하여 ovomucoid 솔루션을 준비합니다. 위의 단계 4.4에서 저장 (3 병)의 DNase 솔루션 150 μl를 추가합니다.
- 에서 상층 액을 버린다세포 펠렛은 즉시 희석 DNase의 알부민 억제제 혼합물에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 단일 단계 불연속 밀도 기울기를 통해 원심 분리하여 세포 점막에서 별도의 손상 세포.
- 위에 부드럽게 15ml의 튜브 (4 바이알) 알부민 억제제 용액 5 mL를 첨가하고, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 불연속 밀도 구배를 준비 서서히 세포 현탁액 레이어 (단계 4.8에서 상술 한 바와 같이 제조) 알부민 억제제 솔루션입니다.
- 실온에서 6 분 70 XG에 원심 분리기.
- 주 :이 경계에서 최소의 혼합이 결과에 영향을주지 않지만 구배의 두 층 사이의 인터페이스는, 명확하게 볼 수 있어야한다. 멤브레인 단편 계면에 남아 해리 세포 튜브의 하단에 펠렛.
- 쥐 세포의 경우, 상층 액을 제거하고 래트 EFH 배지 1 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁 (37 ° C에서 미리는 예열).혈구와 라이브 세포 밀도를 계산하고 EFH에 / μL (10) 세포의 밀도로 T25 문화 플라스크에 넣고 세포를 접시. 랫트 조직에서 세포의 전형적인 수율은 / μL 미만 10 세포의 밀도로 요구되는 약 80 % viability.If 클론 배양 종자 세포는 약 2 × 106 세포이다. 5 % CO 2, 37 ℃에서 플라스크를 품어 1 주 분야의 응집을 방지하는 문화가 방해받지 않고 성장할 수 있습니다.
- 인체 세포의 경우, 상층 액을 제거하고, 인간 EFH 배지 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁 (37 ° C에서 미리는 예열). 도 40㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 필터 미엘린 및 세포막 파편을 제거하기 위해 EFH 30 ㎖로 하였다. 5 분 동안 300 XG 원심 분리기 및 EFH 배지 1 ㎖로 세포 펠렛을 재현 탁.
- 혈구와 살아있는 세포 밀도를 계산하고 총 부피 / 웰 105 세포의 밀도로 6 웰 배양 플레이트에 인간 세포 판형5 ㎖의 EFH / 웰. 인체 조직에서 세포의 전형적인 수율은 약 70 %의 생존과 약 1 × 10 6 세포입니다. 같은 마트 리겔로 부착 기판과 사전 코트 우물 (아래 참고 참조). 1 ml의 SFM : 40 μL 마트 리겔의 비율로 희석.
- 주 : 대안 적으로, 폴리 D 라이신 / 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐과 같은 다른 부착 기질을 사용할 수있다.
- 5 % CO 2에서 37 ° C에서 접시를 품어과 문화 1 주일 동안 방해받지 않고 성장할 수 있습니다.
성인 쥐와 인간의 척수 NSPCs 5.과 Passaging
- 쥐 NSPCs 작은 neurosphere를 초기 파종 1 주일 이내에 직경 약 70 μm의를 형성 할 것이다; 상기 세포 현탁액을 수집하고 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고, 기계적으로 해리를 neurosphere를 세포 펠렛을 분쇄하여 주간에 의해 통로 쥐 NSPCs.
- 신선한 쥐 EFH 매체를 함유하는 T25 플라스크에 세포를 해리 시드. 또한,계대 50 % 조건 쥐 매체를 사용합니다. 계대에서 쥐 NSPCs의 전형적인 수율은 통로 수를 기하 급수적으로 증가 약 5 × 10 6 세포입니다.
- 인간의 문화를 들어 일주일 초기 도금 후, 세포를 기판에 부착 할 수 있도록 회 매주 신선한 EFH와 배양액의 절반을 교체한다. 일반적 1~2주 이상 세포가 기판에 부착되면 신선한 EFH로 일주일에 두 번 배양액의 전체 부피를 대체.
- 4-8주 사이의 합류에 도달하기 전에 배양 세포.
- 또한 37 ° C에서 약 10 분간 인큐베이션 당 효소 기질로부터 세포를 분리하여 배양 세포를 효소의 2 ㎖로 (자재 표 참조). 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리 수집하고 부드럽게 갓 EFH 배지 1 ㎖로 세포 펠렛을 재현 탁.
- 혈구와 살아있는 세포를 계산하고 6 웰 배양 접시에 세포를 플레이트 (사전 공동위와 같은 단계 4.12)에서 105 세포의 밀도 / 웰 / 웰 EFH 5 ㎖의 전체 부피에 ated. 계대에서 인간 NSPCs의 전형적인 수율은 약 2 × 10 6 세포이며, 일반적으로는 통로에 두 배로. 계대 사이에 주 3 회 - 일반적으로 50 % 조건 EFH 매체 (2) 문화를 유지한다.
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Representative Results
EFH 매체에 현탁 배양에서 자란 성인 쥐 척수 세포는 초기 도금의 일주일 내 작은 neurosphere를 (미분화 세포의 콜로니)을 형성한다. 차 배양에서 도금 셀의 대부분은 죽게되고 성장 인자 응답 줄기 세포가 증식되고 EFH 매체에 대해 선택된다. 통로 (3)에 의해, 다수의 자유 부동 neurosphere를 약 100 μm의 직경 (그림 2A)에있을 것입니다. neurosphere를 라운드 및 위상 밝은이며, 고배율, 섬모 형상 microspikes은 세포 파편 (도 2B)의 덩어리 달리 neurosphere를 특유한 분야의 외측에 돌출 된 세포로부터 보인다. 랫트 조직에서 세포의 전형적인 수율은 약 80 %의 생존과 약 2 × 106 세포이다. neurosphere를 셀 클러스터의 응집을 피하기 위해 너무 높은 밀도로 시딩되지 않아야한다. 또한, 큰 neurosphere를는 해리가 어려워 질 및 세포해질 것이다구의 중심에 괴사. 문화가 계대 전에 너무 오래 남아있는 경우에도 발생합니다. EFH 문화에서, 성인 쥐의 척수 NSPCs (그림 2C) 증식 및 전구 세포에 대한 네 스틴 (그림 2D) 마커를 표현, 성숙한 신경 마커의 낮은 수준 (데이터가 표시되지 않음).
성인 인간의 척수 NSPC 문화는 쥐 NSPC 문화만큼 빠르게 성장하지 않습니다. 인간 척수 세포가 초기에 현탁 배양 경우, 그들은 골재와 파편 (도 3A)과 결합 된 세포의 수가 적은 경우 요철의 클러스터를 형성 할 것이다. 이러한 문화의 이후의 계대는 NSPC 인구의 농축을 홍보하지 않습니다. 인간 세포는 단층 접착 EFH에 도금되는 경우에는, 성장 인자 응답 NSPCs 기판 (도 3b) 및 후속하는 용지 교체에 부착하는 미엘린 및 세포 파편 (도 3c)를 제거한다. C의 전형적인 수율인체 조직에서 ELL 학생은 약 70 %의 생존과 약 1 × 10 6 세포입니다. 인간 NSPC 문화가 잘 부착 단일 층으로 설립 될 경우, NSPCs 후 무료 부동 neurosphere를 형성하기 위해 서스펜션 문화에서 도금 될 수 있습니다. EFH 배양 성인 인간 척수 NSPCs는 (도 3D) 증식 스틴 (도 3e) 및 Sox2이 (도 3f)을 표현 도시 전사 인자는 신경 줄기 세포, 및 성숙한 신경 마커의 매우 낮은 수준 (데이터에 의해 표현되는 도시하지 않음).
쥐의 척수 및 뇌실 주위 백질 영역의 해부 1. 후궁 절제술 그림. (A) 척수 노출 꼬리 끝에서 rongeurs는 척추관의 좌우 측면에 extradurally 삽입된다. (B)는 각각의 작은 컷 SI에 박판으로 만들어진다척추와 얇은 판의 드 신중하게 척수를 노출 벗겨된다. (C) 후궁 절제술 후 노출 된 자궁 경부 척수. 흉부 척추 단면의 (D) 도식은 척수와 후궁 절제술을 위해 만든 상처의 위치를 표시 (묘사 ) 빨간색 점선. 라미와 극돌기 (음영 지역)을 제거한다. (E) 척수가 1cm 세그먼트로 횡 방향으로 절단한다. (F) 위에있는 수막, 백질, 그리고 회색 물질의 대부분이 조심스럽게 microscissors를 사용하여 제거한다. (G ) 다진 뇌실 주위 조직. (해부 뇌실 주위 백질 영역을 보여주는 점선으로 룩솔 빠른 파란색과 hemotoxylin과 에오신으로 염색 쥐 척수의 H) 가로 섹션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
쥐 척수 NSPCs가 자유 부동 현탁 배양에서 재배 할 때 그림 2. 성인 쥐 척수 NSPCs. (A) 통로 (3)으로는, 다수의 neurosphere를 볼 수 있습니다. (B) neurosphere를이 위상 밝은과 neurosphere를 돌출 microspikes (화살표 ) 높은 배율 분명하다. (C) 해리 neurosphere를 (통로 (3), 4 일), EFH 매체에 마트 리겔 코팅 우물에 도금 된 고정 및 면역 염색과 핵 (파란색)를 시각화하는 훽스트으로 대조된다은. (사료된다 면역 염색과 같이), 및 (d) 주로 명시 네 스틴. EFH 조건에서, 성인 쥐 척수 NSPCs는 증식 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3. 성인의 척수 NSPCs. (A) 초기 배양 플라스크에 도금, 성인의 척수 NSPCs 잘 성장하지 않습니다. 세포와 파편의 쇼 집계 (십삼일 도금 후) EFH 매체의 기본 자유 부동 문화. (B) 대조적으로는, EFH에 차 자기편의 문화에서, NSPCs은 후 십칠일에 표시, 마트 리겔 기판 (화살표)에 부착 한 이십육일에 ((체외 26 일 참조) 사료된다 면역 염색과 같이 시험 관내 41 일째 도금, 및 (C). (D) EFH 매체에서는 성인 인간 척수 NSPCs은 증식, 주로 익스프레스 (E) 네 스틴 시험관) 시험관 66 일 표시 (도시) 및 (f) Sox2이. 핵은 훽스트 (파란색)으로 대조된다./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
쥐의 척수 조직 관리의 해부 동안 추궁 절제술을 수행하는 동안 척수 손상되지 않도록주의해야한다. 이것은 척수 세그먼트 그대로 때 뇌실 조직을 분리하기 쉽다. 조직 세그먼트 완전히 해부 완충액에 침지되어야하고 덮는 수막과 백질은 microscissors와 스트립 길이로 절단 할 수있다. 또한, 미세 조직 집게 멀리 백질을 벗겨하는 데 사용할 수 있습니다.
NSPCs위한 분리 과정을 위해, 우리는 쥐와 인간 척수 조직을 해리 기계적 분쇄 결합-EDTA 파파인 해리 방법을 사용 하였다. 이전에 출생 쥐의 대뇌 피질의 뉴런 (11)의 해리와 같이 다른 단백질 분해 효소에 비해, 파파인은, 덜 손상하지만 효과적이다. 우리는 종종 태아 조직에서 사용 만 기계적 분쇄와 그 해리는, 성인의 조직과 같은 효과가 없습니다 발견했다. 일 후전자 효소 분해, 기계적 분쇄 나머지 조직의 조각을 해체하는 것이 중요하다. 흐린 세포 현탁액의 결과에는 그대로 남아 조직편 없다 있도록 피펫 반복 셀 분산액로 연화 수행되어야한다. 그러나, 연화 세포 현탁액 및 얻어진 세포 사멸의 버블 링을 피하기 위해 너무 강하게 수행되어서는 안된다.
원래 2 한 바와 같이 계대 들어 쥐 neurosphere를, 기계 분쇄시킴으로써 단일 세포 현탁액 내로 해리된다. 그러나, neurosphere를는 또한 세포 표면 수용체를 손상 시키거나 긴 노출 효소 12 간략한 같이 구 형성을 방해하지 않을 트립신 EDTA와 같은 효소 적 방법을 사용하여 분해 될 수있다.
배양 NSPCs에 neurosphere 분석을 사용하는데 장점이있다. 비교적 간단하고 재현성이 있으며, 신경 줄기 CEL의 급속한 팽창을 허용LS 2,12. 그러나, neurosphere를 주로보다 제한된과 줄기 세포의 수가 적은있는 전구 세포로 구성된 이종이다. 이러한 셀 밀도 및 계대 기술과 같은 여러 가지 요인 배양 표현형에 영향을 미칠 수 있고, neurosphere를 또한 선조 세포 (13)로부터 형성 할 수있다. neurosphere를 매우 운동성이 있습니다, 심지어 낮은 세포 밀도 (14)의 조건으로 융합 할 수 있습니다. 따라서, 배양 neurosphere를 수가 줄기 세포의 수를 나타내지 않는다. 전구 세포로부터 신경 줄기 세포를 구별하기 위해, 하나의 셀 (15, 16)을 형성하는 검정 신경 콜로니를 사용한다.
성인 쥐 척수 NSPCs는 EFH에 현탁 배양에 neurosphere를이 매체 보충으로 잘 성장하고 쉽게 확장 할 수 있습니다. 반면에, 우리는 성인의 척수 NSPCs가 부착 된 단일 층 (10)으로 더 나은 성장 것을 발견했다. 인간의 뇌 유래 신경 줄기 세포는 단층 컬트에서 장기간 유지 될 수있다그들의 증식 능력 (17, 18)을 촉진 분열 촉진 물질의 존재 화학적 매체에 URE. 이 프로토콜에서 설명한 바와 같이, NSPCs는 장기 이식 기증자로부터 인간 성인 척수로부터 단리 및 계대 및 접착 EGF, bFGF의 존재하에 단층 및 헤파린 10 확장 될 수있다. 세포가 빠르게 확장으로 NSPCs 여전히 육십년 (10) 우리의 최대 수명까지 기증자로부터 분리 될 수 있지만 그것은 오래된 기증자 미만에서 NSPCs를 분리하는 것이 더 쉽습니다. 우리는 매트 리겔, 피브로넥틴, 콜라겐 유형 I 및 폴리 D 라이신 / 라미닌과 같은 접착 다양한 기판을 검사하고, 인간 성인 척수 부착 NSPCs 10 효과적인 것으로 이러한 발견했다. 처음 neurosphere 및 부착 문화 모두 세포 집합체, 파편, 그리고 죽은 세포가 포함되어 있습니다. 그러나이 파편은 점진적으로 계대 배양 및 증식 NSPCs에 대한 요소 강화로 Neurobasal 매체가 선택하는 성장 제거. 또한 파편과 미엘린 오염 조심 해부 및 척수 조직 세그먼트에서 백질의 제거와 함께 감소 될 수있다. 또한 수초를 제거하기 전에 도금에 스트레이너를 통해 생성 된 세포 현탁액을 필터링.
오래된 문화에서 존재가 핵형 이상에 대한 위험이 증가하고 있지만 우리는 약 10 유로를 포함하는 적어도 9개월에 대한 부착 단일 층으로 배양 성인의 척수 NSPCs 있습니다. 우리는 4 개월 동안 배양 된 인간의 NSPCs에 핵형 분석을 수행없이 염색체 이상과 정상 이배체 핵형을 발견 (데이터가 표시되지 않음). 우리는 또한 세포 증식 및 희소 돌기 아교 세포로 분화하는 능력은 문화에 증가 시간 감소 것을 발견했다. 예를 들어, O4 양성 세포의 상대적 비율은 문화 (10) 4 개월에 0.01 %로 문화 1 개월 1.3 %에서 감소했다. 쥐와 인간의 NSPCs 모두 표준 동결을 충족하여 냉동 보존 의무가 있습니다hods 및 표현형 프로필에 유의 한 차이를 보여주지.
문화 능성 NSPCs의 분리 및 확장 성인 신경 줄기 세포 분화에 다양한 요소의 시험을 포함하여 여러 가지 생체 응용 프로그램에 있습니다. NSPCs의 수가 증가는 시험 관내에서 생성 및 척수 손상, 뇌졸중, 및 생체 내에서 이들의 신경 줄기 세포의 수복 응답을 검사하는 신경 퇴행성 질환의 동물 모델에 이식 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).
