दो फोटॉन लेजर प्रेरित तंत्रिका चोट: ड्रोसोफिला लार्वा में एक्सोन अध: पतन और उत्थान का निरीक्षण करने के लिए एक विधि

- एक ग्लास कवर स्लिप के नीचे एक साफ, एनेस्थेटाइज्ड लार्वा को अपने सिर के साथ ऊपर से बढ़ते हुए शुरू करें। इसके बाद, लार्वा को रोल करने के लिए कवर स्लिप को धीरे-धीरे धकेलकर रुचि के क्षेत्र का पर्दाफाश करें और अपनी स्थिति को समायोजित करें। लार्वा तंत्रिका कोशिकाओं का पता लगाने के लिए कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करें। चोट के लिए साइट के रूप में लक्षित तंत्रिका कोशिकाओं में से एक पर एक विशिष्ट अक्षतंतरी की पहचान करें।

फिर लक्ष्य अक्षतंतरा को नुकसान पहुंचाने के लिए इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली उच्च शक्ति पर दो फोटॉन लेजर के लिए बेनकाब करें। दो फोटॉन लेजर का उपयोग आसपास के ऊतकों को न्यूनतम क्षति के साथ जीवित ऊतक के भीतर नुकसान को भेदने और ठीक से स्थानीयकृत करने की क्षमता के कारण किया जाता है।

लक्ष्य न्यूरॉन को नुकसान होने पर लेजर एक्सपोजर को तुरंत रोकें, जिसके परिणामस्वरूप एक्सोटॉमी, या अक्षतंवर को तोड़ दिया जाता है। अंत में, घायल न्यूरॉन को वांछित समय बिंदुओं पर इसके पतन और बाद में उत्थान देखने के लिए छवि।

उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम माइक्रोस्कोपी के लिए एक लार्वा माउंट करेंगे, लार्वा संवेदी न्यूरॉन्स को नुकसान पहुंचाएंगे, और तंत्रिका उत्थान को ट्रैक करेंगे।

- लार्वा को एनेस्थेटाइज करने के साथ शुरू करें। एक धुएं के हुड में 60 मिलीमीटर ग्लास डिश को 15 सेंटीमीटर प्लास्टिक पेट्री डिश में रखें। इसके बाद टिश्यू पेपर के टुकड़े को फोल्ड करें और ग्लास डिश में रखें। डायथिल ईथर के जुड़ने के बाद अंगूर की आगर प्लेट को टिश्यू पर रखें।

इसके बाद, एक गिलास स्लाइड पर केंद्र में हेलोकार्बन 27 तेल की एक बूंद रखें, और चारों कोनों में से प्रत्येक पर वैक्यूम तेल का एक स्थान रखें। फिर एक लार्वा को आगर प्लेट पर स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें और लार्वा को एनेस्थेटाइज करने के लिए ग्लास डिश को कवर करें। जैसे ही लावा आगे बढ़ना बंद हो जाता है, ध्यान से इसे अपने सिर के साथ हेलोकार्बन तेल में स्थानांतरित कर दें। फिर स्लाइड पर एक कवर स्लिप रखें और इसे धीरे से दबाएं जब तक कि यह लार्वा को छू न जाए।

इसके बाद, कवर स्लिप को स्लाइड करने के लिए कोमल बल का उपयोग करें ताकि कोशिकाओं को रोल किया जा सके जहां दो फोटॉन लेजर उन्हें सबसे आसानी से मारेगा । यह स्थान इस बात के आधार पर भिन्न होगा कि न्यूरॉन्स को क्या निशाना बनाया जा रहा है । अब दो फोटॉन माइक्रोस्कोप स्टेज पर असेंबली को सुरक्षित करें और 40x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके ब्याज की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें ।

सॉफ्टवेयर में, स्कैनिंग मोड पर स्विच करें और सेव किए गए प्रोटोकॉल को लोड करें। सुनिश्चित करें कि पिनहोल सभी तरह से खोला गया है। फिर, लाइव मोड में, ब्याज के क्षेत्र की एक अच्छी छवि प्राप्त करें।

इसके बाद लाइव स्कैन बंद कर दें ताकि क्रॉप बटन उपलब्ध हो जाए। क्रॉप फंक्शन का इस्तेमाल करते हुए टारगेट एरिया को सिर्फ इंजरी की संभावित साइट पर फोकस करने के लिए स्कैन विंडो को एडजस्ट करें। - इसके बाद एक नई इमेजिंग विंडो खोलें। - अब स्कैन स्पीड कम करें और लेजर की तीव्रता बढ़ाएं। - इसके बाद लगातार बटन को स्टार्ट करने और रोकना शुरू करें। ध्यान से देखें जैसे ही फ्लोरेसेंस में भारी बढ़ोतरी होती है, स्कैन खत्म करें।

इसके बाद, मूल इमेजिंग विंडो पर वापस स्विच करें और लाइव मोड का चयन करें, और उस क्षेत्र को ढूंढें जिसे ध्यान को समायोजित करके लक्षित किया गया था।

- सफल चोट का एक अच्छा संकेत चोट स्थल पर एक छोटे से गड्ढा, अंगूठी जैसी संरचना, या स्थानीयकृत मलबे की उपस्थिति है। यदि लेजर शक्ति बहुत अधिक थी, तो एक बड़ा क्षतिग्रस्त क्षेत्र दिखाई देगा, जो घातक हो सकता है।

- अब सावधानी से कवर स्लिप निकालें, और घायल लार्वा को खमीर पेस्ट के साथ एक नई प्लेट पर स्थानांतरित करें। प्लेट को प्रोपियोनिक एसिड से लथपथ ऊतक के साथ 60 मिलीमीटर डिश में रखें। फिर प्लेट को तापमान को बढ़ाने के लिए वापस करें।

लार्वा के बाद इमेजिंग के लिए, सहेजे गए कॉन्फोकल सेटअप का उपयोग करें और 25x उद्देश्य के साथ जेड स्टैक छवियों को एकत्र करें। सामान्यीकरण बिंदु को शामिल करना सुनिश्चित करें ताकि पुनर्जनन की मात्रा निर्धारित की जा सके।