Introduction
参与血栓的发展和抗血栓药物的有效性的评价机制的研究需要很好地建立实验动物模型。大型动物模型是第一个被使用，因为它们提供大血管更类似于人类比啮齿类1。然而，成本高，需要较大的设施和操纵他们的困难是基因主要缺点它们的使用和大型动物，现在仅限于后期临床前研究，一旦对啮齿动物的初步试验给出结论性的结果2。用转基因和基因敲除株和它们的小尺寸，最大限度地减少所需的体内测试抗血栓药物的量广泛的可用性，小鼠主要用于血栓形成研究。因此，已经开发了在小鼠中3几种型号血栓形成性疾病的。
许多老牌血栓模型扰乱intim层的血管壁，然后由子内皮细胞外基质到血流诱导血块4的形成的曝光。血栓可能导致胶原的曝光这触发血小板活化和/或从组织因子的曝光其激活凝血级联5。然后几种技术被用来实现初始血管损伤。 Pierangeli 等人开发了一种机械破碎模型上的股静脉6一个显微工具。 Kikushi 等人描述了一种模型，该模型包括在相片反应性化合物（玫瑰红），其积聚在血管内皮细胞随后用绿光（540纳米）7感兴趣的血管壁的特定激励的脂质双层的施用。这次受伤也可以通过短高强度的脉冲激光照射诱发8。另一种技术首先对大鼠的颈动脉既定包括在氯化铁的局部施用（的FeCl 3）9。在这种情况下，从通过的FeCl 3产生自由基的容器剥蚀结果导致内皮细胞10的脂质过氧化和破坏。的损伤引起几个粘附分子触发血小板粘附和聚集以及白细胞募集的表达。它已经证明，白细胞，特别是嗜中性粒细胞，在血液凝固级联导致血栓形成11的活化中发挥至关重要的作用。这种方法非常适合于重现凝血级联;研究者必须牢记的是，在该小鼠模型中，血栓形成通常诱导健康血管而血栓在人类中是主要发生在患病如 。动脉粥样硬化的血管。
因为此模型是非常简单的实现，也是有效的小鼠，它现在是最常用血栓形成模式l对于小动物体内研究。此外，这种技术提供了以诱导在各种血管血栓形成的可能性。靶血管可以是动脉或大直径（颈动脉，股腔静脉）或小直径（肠系膜，提睾肌）12-14脉。最近，也有人用在大脑中动脉近端制定行程15的模型。血栓形成可以直接血小板和白细胞的荧光标记后通过活体显微镜观察或通过测量血流量减少与温度探针或多普勒探针12,16,17监测。几个参数，如阻断时间，血栓形成时间或血栓大小然后可以进行调查。容器之间的生理差异中获得的血栓显著变化调查结果。因此，调查人员根据他们想measu参数通常选择目标船只重新和/或疾病的设置，他们希望调查。通常，在颈动脉的模型是更相关的动脉粥样硬化与心肌梗死或中风而上腔静脉的研究更相关于深静脉血栓形成研究研究。不同的容器的访问也决定用来衡量血栓增长的方法。例如，肠系膜血管很容易就可以访问使得该模型适合于活体显微镜观察和血栓形成的动力学的研究。颈动脉是不太容易，但做大，使血流量的测量，并提供研究血栓闭塞一个很好的模式。
氯化铁诱发血栓模型在这病理的认识提供了巨大的进步。它已被用于在许多研究集中于血管性血友病因子在血栓形成18,19的作用。结合遗传MODIfication技术中，已经允许参与血栓形成病症的许多特定基因的鉴定。拉姆拉尼等 。例如已经表明，一敲在JAK2 V617F基因都与一个加速形成不稳定凝块20的相关联。 Zhang 等人调查了该P2Y12血小板受体的生理含义，并表明转基因小鼠过度表达特别这种受体在血小板只，显示了更快速，稳定的血栓形成的肠系膜动脉的FeCl 3 21受伤。的组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）的纤维蛋白降解过程中的关键作用也进行了研究在该方法22。此外，该模型还提供了测试的许多新颖的药物的血纤维蛋白溶解能力在体内的简单且精确的方式。例如，Wang 等人已经用这种模型对于第靶向激活的血小板23的新型重组纤溶酶原激活电子临床验证。这种方法也使治疗性蛋白蜱，吸血蝙蝠，和蚊子的唾液或蛇与目标24-27的特定标识的毒液中分离的验证。这些实施例说明了氯化铁模型的多功能性。在这篇文章中，我们专注于两种方法，研究在两个不同的容器类型三氯化铁诱发血栓形成;肠系膜血管和颈动脉。
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Protocol
所有涉及的动物实验均批准了阿尔弗雷德医学研究和教育专用区动物伦理委员会（E /二千○十五分之一千五百三十四/ B）。全身麻醉下进行所有的手术操作和动物没有在任何阶段经历痛苦。描述的所有实验都是非恢复。
1.准备
- 切细带的滤纸（1毫米×2mm）的。
- 新鲜制备2溶液的4％氯化铁（重量/体积）和6％（重量/体积）稀释到去离子水中。制备罗丹明6G溶液0.3％在PBS中，通过0.22微米的过滤。
- 从切包装注射器的白色塑料小片（5毫摩×1厘米）。
2.肠系膜小动脉血栓形成活体显微镜观察
- 权衡10-12周大的雄性C57BL / 6野生型小鼠和用氯胺酮虽然腹腔注射的混合物（100毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）相应麻醉。通过响应于趾，尾和/或皮肤捏，从角膜和眼睑捏反应性，并且不存在晶须运动监测麻醉深度。如果需要的话，注射第二剂量的氯胺酮（50毫克/千克），以保持动物麻醉。取适量涂抹于眼睛兽医药膏，以防止干燥，而在麻醉下。鼠标放置在一个小的培养皿放置在一个加热垫调节至37℃。
注意：虽然IP注射可导致疼痛的动物，这种不适的持续时间将是最小的（小于3秒）。与注射相关的疼痛和不适会通过使用有经验和能力的人员和适当的针头大小（25克）的最小化。下面所有的程序，使用安乐死氯胺酮和甲苯噻嗪颈椎脱位过量所有的动物。 - 在皮肤进行约3厘米的腹部正中切口，并仔细切腹膜。
- 将鼠标上的宠物的侧里的菜，轻轻exteriorize它的肠子小心地肠系膜与2棉花棒把合适的容器到培养皿的表面。一个微妙的雨刷干正常。
注意：要限制的肠系膜血管的移动，罂粟碱可用于抑制肠道蠕动。 - 浸泡的小鼠尾巴中温水以扩张血管和注入30微升若丹明6G（0.3％）的尾静脉鼠标用29克注射器标记白细胞和血小板。
- 放置在培养皿倒置显微镜下，专注于使用明场通道选择的动脉。
- 浸泡的滤纸的带用6％（重量/体积）的铁（III），氯化并应用滤纸上用两个镊子动脉;第一个以保持滤纸，第二个要轻轻按下它到感兴趣的区域。以下滤纸的沉积观察血栓形成在第一10秒。
注：这是很通讯上可破坏包围微血管和滤纸的沉积和轻轻压力的精度，因此重要的是限制这个问题。 - 观察血栓形成由荧光显微镜（TRITC通道：峰激发557纳米，峰值发射576纳米），通过滤纸。观察循环白细胞和血小板已经采取了罗丹明6G和他们聚集到血栓因此，很容易辨认。
- 曝光1分钟至铁（III），氯化后取滤纸关闭，并继续监测血栓的形成。洗用PBS的容器中。
- 观察并记录动态形成突出了血小板和白细胞与罗丹明6G的标签血栓。捕获的图像，并测量血栓的大小。本文中所呈现的图像被用倒置显微镜活体获得，虽然客观4X，在TRITC荧光通道。
- Following所有的程序，使用安乐死氯胺酮和甲苯噻嗪颈椎脱位过量的动物。
3.颈动脉血栓形成评估的血流速度测定
- 权衡10-12周龄雄性C57B1 / 6老鼠和氯胺酮（100毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）虽然腹腔注射的混合物相应地麻醉。取适量涂抹于眼睛兽医药膏，以防止干燥，而在麻醉下。
- 固定鼠标使用胶带上腿在手术显微镜下，在加热垫上调节至37℃。
- 做一个小枕头了一个擦，并用胶带鼠标的头下稍微垫高头部。使用一个线程循环用钳子拉下来吻（使用上牙）。这将会使颈动脉的区域，便于使用。
- 执行皮肤的小5毫米深的切口正下方的颚，下至胸骨。
- 解剖足协SCIA和隔离左或右颈总动脉分叉以上的片段。
- 精心引进之间的动脉和神经把它们分开镊子。请勿打扰运行接近动脉的神经并避免接触过多的颈动脉，因为它可能造成损害的容器中。隔离的至少5mm动脉的一个部分。
- 干燥动脉的区域正确地与雨刷避免任何液体干扰的FeCl 3。
- 把下颈使氯化铁的分离部分的白色小塑料片在周围组织不浸泡。为了这个目的，使用第二钳子以使片至第一个再慢慢滑动动脉下的塑料纸。
- 浸泡一片滤纸，用4％（重量/体积）或6％（重量/体积）氯化铁，并把它的所有动脉周围。
- 3分钟后曝光，取下滤纸，冲洗用PBS和干燥区瓦特第i个雨刷。
- 放置在容器周围的多普勒流量探针在受伤部位和开始记录的变化的流动。成年小鼠的健康颈，流程通常为约1毫升/分钟。注意！探针与氯化铁接触会损坏探针所以应避免任何接触。在本文中所呈现的数据被用一个跨音速系统公司流量计，TS420血管周围模块配备有纳米多普勒流量探针0.5的PBS获得。
注：氯化铁的浓度可以修改的血栓形成导致不同的闭塞倍的动力学。因此，暴露于6％（重量/体积）氯化铁给出更快的闭塞比暴露于4％（重量/体积）的氯化铁。 - 下面所有的程序，用氯胺酮和甲苯噻嗪的颈椎脱位过量安乐死的所有动物，仔细清洁多普勒探头。
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Representative Results
荧光活体显微镜观察肠系膜将揭示罗丹明6G的积累标记的血小板和白细胞沿着血管壁由三氯化铁3人受伤。渐进形成局部血栓在200μm的肠系膜血管（ 图1）进行监测。血栓慢慢出现，显然是暴露的第一分钟到氯化铁后可识别（ 图1，T = 60秒）。 40秒的去除浸泡的FeCl 3滤纸之后，血栓形成迅速的进展，并且最后存在于所观察到的整个容器部分的壁（ 图1，T = 100秒）。
图1：血栓生长上的肠系膜血管观察由荧光活体显微镜拍摄图像，在15秒，60秒和浸有6％（重量/体积）的FeCl 3溶液中的滤纸的沉积后100秒。滤纸60秒暴露后取出。白细胞和血小板通过预喷射若丹明6G的被标记（0.5％重量/体积）。红色箭头表示血小板/白细胞聚集。比例尺200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
帧内颈动脉血栓是由浸泡在的FeCl 3溶液周围的分离的颈动脉的滤纸的应用和损伤的下游记录有一个多普勒流量探针（ 图2）的血流变化引起的。约110毫升总恒定血流/分钟测量在非受损的颈动脉中。后容器的3分钟的曝光与浸泡在4％（重量/体积）的FeCl 3溶液中的滤纸上，一个闭塞性血栓是邻btained为13分钟，并在曝光开始后的30秒的阻塞时间。后3分钟的曝光与浸泡在6％的滤纸（重量/体积）的FeCl 3，用9分钟，在曝光开始后的30秒的阻断时间，获得一个闭塞性血栓。
图2.血流通过的FeCl 3损伤。血流后的颈动脉的代表性录音是衡量一个多普勒流量探针置于颈动脉浸泡，用4％（重量/体积）或6％（滤纸的正下游重量/体积）的FeCl 3。将滤纸暴露3分钟之后移除。作为对照血流通过测量健康颈动脉获得。
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Discussion
氯化铁诱发血栓模型是一个很好的研究工具。如该研究中，这是非常容易实现，并且与活体显微镜或多普勒流量计结合使用时，它提供了血栓形成一个良好的实时监控。调整时间曝光和的FeCl 3的浓度，它也提供了，以产生非闭塞性或闭塞性血栓的可能性。
但是，这种方法也有一定的局限性。在颈动脉中，主要的缺点是，虽然阻塞时间可以有效地被修改，则该模型的再现性仍太弱精确控制血栓大小和生长速率10。一些研究小组已经制作了模型28,29的标准化。 Owens 等人 。建议可靠和可再现的阻断时间可以与实践，并通过降低所有的变化因素，例如年龄获得在小鼠中，小鼠的遗传背景，所用的麻醉，该技术为氯化铁的论述和氯化铁溶液28的浓度。多普勒探头本身也具有一定的背景信号存在可影响闭塞的确定一定的局限性。血流也可以通过不稳定的血栓的形成改变。
关于肠系膜血管中，再现性可能受该变化超过颈动脉和脂肪的存在可能降低了损伤的程度的容器的尺寸。据报道，得到的血栓根据血管壁损伤其可以抑制内皮脱落或也影响介质层30的平滑肌细胞的大小不同。激光照射模型构成的三氯化铁模型提供了一个更好的再现性的良好替代8。然而，它仅限于那些足够透明，以使激光的穿透小血管。应当还注意到，在该模型中，内皮细胞的氯化铁后应用被破坏，因此，它不适合于对内皮细胞的作用的研究。然而，有可能通过钙离子载体来代替氯化铁以获得弱损伤，限制在内皮31的活化。
这种模式的另一个限制是，它不适合于研究疾病的长期演进。为了满足这一要求，Boulaftali 等人已开发了背皮褶室这使同一血栓的监测数周32。这种技术尤其适合根据本血栓到期审查的溶栓药物的影响。在这项研究中，凝块老化发现损害Tissu酒店的重组形式的裂解作用Ë纤溶酶原激活剂，这是目前溶栓药物供人类使用的黄金标准。
尽管有一些缺点，必须采取在考虑， 氯化铁模型是有关人类血栓形成的研究。所得到的血栓的组合物已在组织切片和血小板，纤维蛋白和红血细胞中的内颈动脉血栓33已经确定存在进行了分析。此外，由于动脉粥样硬化病症被假定为通过脂蛋白组织过氧化引发，诱导血管损伤，虽然一个氧化还原反应的的FeCl 3模型更可能模仿人类疾病的病理生理学不是机械，光化学或激光致34伤。
血栓形成虽然氯化铁也被描述为既抗凝和抗血小板药物敏感。肝素和氯吡格雷比如已经代表orted延长形成在颈动脉29血栓闭塞时间。水蛭素的重组形式的政府已经显著延长血栓形成时间上的肠系膜微血管17。因此，氯化铁模型提供在血栓形成优良的见解，是新的溶栓，抗凝和抗血小板药物的临床前验证一个高度相关的工具。
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Acknowledgments
作者要感谢来自喜悦姚明和卡伦博士Alt键的技术支持，以及资金从NHMRC和NHF。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40% (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
- Leadley, R. J., Chi, L., Rebello, S. S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. J Pharmacol Toxicol Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Johnson, G. J., Griggs, T. R., Badimon, L. The utility of animal models in the preclinical study of interventions to prevent human coronary artery restenosis: analysis and recommendations. On behalf of the Subcommittee on Animal, Cellular and Molecular Models of Thrombosis and Haemostasis of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost. 81 (5), 835-843 (1999).
- Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P.
- Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100 (7), 979-991 (2007).
- Furie, B., Furie, B. C.
- Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H., Anderson, G., Harris, E. N. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74 (5), 1361-1367 (1995).
- Kikuchi, S., Umemura, K., Kondo, K., Saniabadi, A. R., Nakashima, M. Photochemically induced endothelial injury in the mouse as a screening model for inhibitors of vascular intimal thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18 (7), 1069-1078 (1998).
- Rosen, E. D., Raymond, S., et al. Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi. Am J Pathol. 158, 1613-1622 (2001).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60 (4), 269-280 (1990).
- Eckly, A., Hechler, B., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9 (4), 779-789 (2011).
- Darbousset, R., et al. Involvement of neutrophils in thrombus formation in living mice. Pathol Biol (Paris). 62 (1), 1-9 (2014).
- Denis, C., Methia, N., et al. A mouse model of severe von Willebrand disease: defects in hemostasis and thrombosis). Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (16), 9524-9529 (1998).
- Wang, X., Hagemeyer, C. E., et al. Novel single-chain antibody-targeted microbubbles for molecular ultrasound imaging of thrombosis: validation of a unique noninvasive method for rapid and sensitive detection of thrombi and monitoring of success or failure of thrombolysis in mice. Circulation. 125 (25), 3117-3126 (2012).
- Wang, X., Smith, P. L., Hsu, M. -Y., Ogletree, M. L., Schumacher, W. A. Murine model of ferric chloride-induced vena cava thrombosis: evidence for effect of potato carboxypeptidase inhibitor. J Thromb Haemost. 4 (2), 403-410 (2006).
- Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (6), 1452-1460 (2011).
- Jirousková, M., Chereshnev, I., Väänänen, H., Degen, J. L., Coller, B. S. Antibody blockade or mutation of the fibrinogen gamma-chain C-terminus is more effective in inhibiting murine arterial thrombus formation than complete absence of fibrinogen. Blood. 103 (6), 1995-2002 (2004).
- Dubois, C., Panicot-Dubois, L., Merrill-Skoloff, G., Furie, B., Furie, B. C. Glycoprotein VI-dependent and -independent pathways of thrombus formation in vivo. Blood. 107 (10), 3902-3906 (2006).
- Navarrete, A. -M., Casari, C., et al. A murine model to characterize the antithrombotic effect of molecules targeting human von Willebrand factor. Blood. 120 (13), 2723-2732 (2012).
- Rayes, J., Hollestelle, M. J., et al. Mutation and ADAMTS13-dependent modulation of disease severity in a mouse model for von Willebrand disease type 2B. Blood. 115 (23), 4870-4877 (2010).
- Lamrani, L., Lacout, C., et al. Hemostatic disorders in a JAK2V617F-driven mouse model of myeloproliferative neoplasm. Blood. 124 (7), 1136-1145 (2014).
- Zhang, Y., Ye, J., et al. Increased platelet activation and thrombosis in transgenic mice expressing constitutively active P2Y12. J Thromb Haemost. 10 (10), 2149-2157 (2012).
- Schäfer, K., Konstantinides, S., et al. Different mechanisms of increased luminal stenosis after arterial injury in mice deficient for urokinase- or tissue-type plasminogen activator. Circulation. 106 (14), 1847-1852 (2002).
- Wang, X., Palasubramaniam, J., et al. Towards effective and safe thrombolysis and thromboprophylaxis: preclinical testing of a novel antibody-targeted recombinant plasminogen activator directed against activated platelets. Circ Res. 114 (7), 1083-1093 (2014).
- Decrem, Y., et al. Ir-CPI, a coagulation contact phase inhibitor from the tick Ixodes ricinus, inhibits thrombus formation without impairing hemostasis. J Exp Med. 206 (11), 2381-2395 (2009).
- Ma, D., et al. Desmolaris, a novel factor XIa anticoagulant from the salivary gland of the vampire bat (Desmodus rotundus) inhibits inflammation and thrombosis in vivo. Blood. 122 (25), 4094-4106 (2013).
- Lei, X., et al. Anfibatide, a novel GPIb complex antagonist, inhibits platelet adhesion and thrombus formation in vitro and in vivo in murine models of thrombosis. Thromb Haemost. 111 (2), 279-289 (2014).
- Waisberg, M., et al. Plasmodium falciparum infection induces expression of a mosquito salivary protein (Agaphelin) that targets neutrophil function and inhibits thrombosis without impairing hemostasis. PLoS Pathog. 10 (9), e1004338 (2014).
- Owens, A. P., Lu, Y., Whinna, H. C., Gachet, C., Fay, W. P., Mackman, N. Towards a standardization of the murine ferric chloride-induced carotid arterial thrombosis model. J Thromb Haemost. 9 (9), 1862-1863 (2011).
- Wang, X., Xu, L. An optimized murine model of ferric chloride-induced arterial thrombosis for thrombosis research. Thromb Res. 115 (1-2), 95-100 (2005).
- Tseng, M. T., Dozier, A., Haribabu, B., Graham, U. M. Transendothelial migration of ferric ion in FeCl3 injured murine common carotid artery. Thromb Res. 118 (2), 275-280 (2006).
- Bonnard, T., et al. Leukocyte mimetic polysaccharide microparticles tracked in vivo on activated endothelium and in abdominal aortic aneurysm. Acta Biomater. 10 (8), 3535-3545 (2014).
- Boulaftali, Y., Lamrani, L., et al. The mouse dorsal skinfold chamber as a model for the study of thrombolysis by intravital microscopy. Thromb Haemost. 107 (5), 962-971 (2012).
- Konstantinides, S., Schäfer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103 (4), 576-583 (2001).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1 (1), 50-55 (2013).
