Abstract
期间菌血症肺炎链球菌可在血管内皮转运进入心肌和形成离散菌填充微观病变（microlesions）是显着的，由于缺乏浸润免疫细胞。由于其释放心脏毒性的产品，S.肺炎 microlesions内被认为有助于向心脏衰竭是在成人中雷酸侵袭性肺炎球菌疾病中经常观察到。在此证明一个协议，用于实验的小鼠感染，导致30小时内可重复的心脏microlesion形成。设在microlesion鉴定苏木精 - 伊红染色心脏切片和早期和晚期microlesions之间的形态区别的指令被突出显示。设置在一个协议，用于验证S的指令肺炎使用抗肺炎球菌荚膜多糖和microlesions内免疫荧光显微镜。最后，提供了一种协议，用于抗生素干预拯救感染小鼠和用于检测和瘢痕形成在恢复期小鼠的心脏评估。一起，这些协议将促进肺炎球菌心脏侵袭，心肌细胞死亡，心脏重塑底层的暴露至S.的结果的分子机制的研究肺炎 ，以及在心脏的肺炎球菌的免疫应答。
Introduction
成人社区获得性肺炎（CAP）住院进行了心脏不良事件，有助于死亡率1-4文件化的风险。在最近的一项研究科拉莱斯-Medina 等人 ，发现心脏并发症要关联有和/或负责肺炎相关死亡3的27％。 肺炎链球菌 （肺炎球菌），CAP和败血症5的最常见原因，已直接与多达19％的人承认的成人患者6心脏不良事件相关。与肺炎相关的不良心脏事件包括为了降低频率6的新的或恶化充血性心脏衰竭，心律失常和心肌梗死。
在最近的一个公共科学图书馆病原布朗等人的文章。，肺炎链球菌 ，发现通过心脏血管内皮，进入myocardiu是能够易位米，并形成独立非化脓性病变显微镜（microlesions）侵袭性肺炎球菌疾病（IPD）7时充满细菌侧脑室。观察心脏样本中心脏microlesion形成的证据来自非人类灵长类动物和个人谁曾死于肺炎球菌感染。同样，实验感染小鼠重复开发的心脏microlesions。在小鼠中，microlesion大小和数量呈正的持续时间和菌血症，心肌肌钙蛋白血清水平的严重程度，以及异常心脏电相关。细菌易位入心脏，发现发生通过负责跨越血-脑屏障和肺炎球菌性脑膜炎的发展， 也就是 ，胆碱结合蛋白A介导的血管内皮细胞的浸润在层粘连蛋白受体和血小板的肺炎球菌的易位相同的机制-activating因子受体依赖性8。 Microles离子的形成还需要肺炎球菌成孔毒素肺炎球菌被发现杀死心肌7。
肺炎球菌心脏microlesions是从由其他革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌所引起的化脓性软组织和心脏脓肿鲜明。这些特点是由细菌中性粒细胞和纤维蛋白沉积9,10包围的单一病灶。 Microlesions由S.形成肺炎在尺寸，在整个受影响的心脏分布更小，且缺乏免疫细胞浸润。在感染的早期阶段，microlesions引起由S.肺炎表现为受损或发炎的组织让人想起心肌病的病理征象领域。一些单核细胞可能在此期间观察到，但是他们的存在是短暂的，病变迅速成为坏死在外观，充满了细菌，同时继续GR流的大小，直到动物或抗微生物干预的死亡。重要的是，内抗生素干预后3天，大量的免疫细胞浸润被观察到前者病变部位，这是伴随着强劲的胶原沉积。类似心脏重塑已报道发生对心脏功能11-15持久后果沿着以下梗死。因此，microlesions是心脏相关死亡率的恢复期个体的发病率增加谁生存了疾病发作期间的IPD和可能发生的不良心脏事件的潜在的解释。
这里，指令被设置在IPD与心肌损伤形成和心肌microlesions可视化的实验小鼠模型中，在感染的早期和晚期阶段。已保存的抗菌干预动物的协议检测胶原沉积的证明。本文的目的是至facilitate在这一重要和新颖的肺炎病理其他研究者的研究。
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Protocol
注：所有小鼠实验进行了审查，并在得克萨斯健康科学中心大学圣安东尼奥（协议＃13032-34-01C）批准的机构动物护理和使用委员会。动物保健和遵守公法89-544（动物福利法）及其修正案，公共卫生服务的指导方针，以及指南实验动物的护理和使用（健康与人类服务部）的实验方案。
1.感染
- 获得10-12周龄岁之间的男性和女性的BALB / c小鼠。
注：S.血清型肺炎 4个应变TIGR4是已测序的16剧毒临床分离。 - 生长TIGR4中的Todd-Hewitt肉汤，在37℃在5％CO 2，直到达到一个光学密度（OD）0.5 620（对应于1.0×10 8菌落形成单位[CFU] / ml）中。颗粒通过离心肺炎球菌培养，在3 10分钟，500×g离心并除去使用真空线上清液。暂停和稀的细菌，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）以1.0×10 4 CFU / ml的终浓度。
- 使用感应室，麻醉小鼠在氧气2.5％异氟烷气化。轻轻捏脚趾用生硬的镊子确认麻醉状态。
- 由它的浮渣保持了麻醉的小鼠和直立用一只手，注入每只小鼠腹膜内（IP）用100μl的S的使用注射器用27-30号针（对应于1.0×10 3 CFU一个挑战剂量） 肺炎悬浮液。将鼠标放回笼子。小鼠通常唤醒注射后30-40秒。
- 允许感染进行至少24（早期）或30（高级）小时。
- 安乐死小鼠CO 2窒息。执行颈椎脱位，确保鼠标已经死亡。安乐死是通过去除进一步证实在1.6步的心脏。
- 消毒用酒精棉签尾部操起一个2-3毫米的部分。收集2微升的血液和连续稀释血液的10倍PBS含肝素钠1 U / ml的五倍。在胰蛋白大豆血琼脂平板上平板系列稀释并在5％CO 2，从菌落第二天外推计算菌血症水平孵育过夜，在37℃。
- 固定鼠标在上一个外科平台仰卧位置。喷雾胸部用70％乙醇和拍干。用手术剪刀和镊子打开胸腔，取出肋骨，和横切隔膜暴露心脏和肺部。用剪刀剪连接到心脏的血管，轻轻摘除心脏小心，避免用钳子青紫。
- 冲洗PBS的心脏，然后放入组织标本收集磁带，这样冠状切片将组织切片中获得。对于石蜡包埋，解放军CE在10％缓冲的甲醛溶液和第二天卡匣发送用于石蜡包埋。
- 可替代地使用cryomold已放置在干冰上内OCT化合物闪光冻结。
2.可视化心脏病变及病变范围内的肺炎球菌
- 减少石蜡包埋的心脏部分，使4室的心脏在每个组织切片可见。切载玻片在5微米厚。
- Deparaffinize和染色的幻灯片使用标准方法17苏木和伊红（H＆E）。
- 视图，H＆E染色使用光学显微镜在低（100X，200X）和高（油浸：400X，1,000X）心脏切片的放大倍数。表征心中microlesions在心肌的存在。在这里，获得使用蔡司Axioskop 2显微镜配备了100X 1.3数值孔径计划，NEOFLUAR客观H＆E影像。
注：在早期心脏升esions由它们的差是有色的外观和在某些情况下的免疫细胞（单核细胞和粒细胞）什么似乎是单核细胞的存在区别。在先进的病变，尤其是在看到30小时，免疫细胞缺失和大空泡状病变在他们的地方观察。要注意的是，虽然在心肌病变发展的早期阶段的免疫细胞流入可发生不似乎是一个要求是很重要的。
3.免疫荧光显微镜的范围内Microlesions肺炎球菌
- 部分心脏中cryomolds用切片机以厚度为5微米，代替部分上带正电荷的载玻片上。让心脏冰冻切片解冻和空气干燥。定为10分钟，在10％的中性缓冲的福尔马林部分（pH为6.8-7.2，在25℃）。
- 在PBS中5分钟洗载玻片（3×），透化在0.2％的Triton X-100的PBS中15分钟，然后在PBS中再次洗涤。
- 块组织secti对载玻片用1小时在PBS中的10％山羊血清。
- 漂洗载玻片用PBS，盖孵育心脏切片用兔抗血清型4肺炎球菌血清在1：在37℃下在PBS 1000，用10％山羊血清2小时。
注：对于阴性对照调查人员应使用天真兔抗血清 - 之后用PBS洗涤，盖孵育，用10％山羊血清的PBS中的部分用山羊抗兔FITC缀合的抗体以1：在37℃2000 30分钟。
- 按照制造商的指示，用DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）以5mg / ml的真核细胞核可视化。清洗和安装组织切片与FluorSave。
- 使用共聚焦显微镜系统在低和高放大倍数取得的荧光图像。调节的数值孔径相应的，以获得最佳的效果。这里，使用共聚焦系统，具有60X 1.42数值孔径物镜获取荧光图像。
- 小鼠感染IP用1.0×10 3 CFU TIGR4的开始如先前在步骤1中所示。
- 在30小时后的感染开始，施用在100μl盐水药用级氨苄青霉素IP（80毫克/公斤体重），每12小时36小时。如在用于石蜡包埋和组织，切片步骤1.6中所述收集心在期望的时间点和处理。
5.胶原沉积检测
- 使用二甲苯和分级醇洗涤与使用标准方法17去离子水，deparaffinize和水合物的组织切片。治疗用含水0.2％磷酸部分为5分钟，并用去离子水冲洗5分钟。
- 染色切片用0.1％天狼星红在苦味酸2小时，在室温下进行。
- 在0.01N盐酸3分钟洗部分和漂洗用70％乙醇1分钟。
- Dehydra使用相同的TE成功的部分，但是为了反洗到5.1概括的，脱水增加心脏部分，分级乙醇浓度再二甲苯。
- 摩组织切片与微观评估的安装解决方案。
- 以确定胶原沉积的区域中，检查染色组织切片的深读染色使用光学显微镜在低和高放大倍数的区域。这是红色心脏的心室中的任何区域是胶原蛋白已存入的区域。如果没有这个红染色领域是健康组织的网站缺乏胶原沉积。此处，获取使用装有20X 0.5数值孔径物镜的显微镜中苦天狼红染色的图像。
注：该庭污渍红健康组织。
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Representative Results
Microlesions由H＆E可视化
心脏microlesions观察到的H＆E染色小鼠与IPD下面的IP挑战，TIGR4心脏部分心室。 图1说明了增加24和30小时后感染（HPI），与这些病变的大小更多的苏木染色的（ 即 ，紫蓝色）肺炎病灶内可见。 Microlesions的特点是一个液泡样形态，更密集的曙红（红色）染色紧邻病灶部位的心肌细胞中的，病灶内双球菌，和一般缺乏免疫细胞。大约一半的病变邻近可见血管。在24和30 HPI microlesions变得更加纷繁大得多。在30 HPI外细菌常可见到从细胞之间的病变流。
Visualizati在S.肺炎使用免疫荧光显微镜
可视化和确认S.肺炎确实病灶内，使用免疫荧光染色为是受TIGR4产生血清型4荚膜多糖（ 图2）。拍摄图像显示的S.紧凑且致密聚集体的存在下microlesion网站内的肺炎 。
心脏疤痕的证据
中苦天狼星红染色心脏切片进行从已经获救氨苄青霉素和未感染的控制小鼠。在抗生素救出恢复期小鼠中，有一个在中苦天狼红染色的存在和强度与带从什么似乎是在心室（图3）前病变部位的流的显着增加。与此相反，在控制部分脑室被不染色，表明胶原沉积缺席 （未示出）。
一起，这些结果表明，以可视化的小鼠心脏microlesions重症IPD与访问中使用标准组织学程序心室所得瘢痕形成的能力。重要的是，心脏microlesions都不约而同地联系 到S.高滴度肺炎和时间需要调解的形成。
图1：在检测H＆E染色切片心脏的microlesions 24 HOR和30小时后观察到感染心脏microlesions的代表图像（1,000倍）。黑色比例尺对应于10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2：免疫荧光检测S.肺炎心脏microlesions内。使用抗体抗血清4型荚膜多糖（绿色）免疫荧光显微镜证实S.存在肺炎心脏microlesions内。细胞核染色蓝色DAPI。白色比例尺相当于20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：胶原蛋白沉积在心脏前microlesion站点在恢复期小鼠代表图像（200X）表示中苦天狼红染色的心肌microlesion在小鼠的心室中抗生素干预后5天。侵袭性肺炎球菌疾病。红色表示胶原沉积。黑色比例尺对应于20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这份报告中，高度重复的方法诱导S.肺炎介导的小鼠心脏microlesions IPD期间和技术的可视化展示。小鼠感染剂量的细菌，优于通关免疫系统的门槛，导致高档菌血症，类似这人类败血症期间发生，并导致最终的细菌移位到心肌。对于未知的原因，S.肺炎的心脏是能够通过宿主的免疫反应来复制偏向虎山行。这是正在进行的调查的主题，本出版物可以促进其他研究者在他们的努力参与。
H＆E染色允许使用标准光学显微镜，因为心肌细胞染色粉红色microlesion可视化，而心脏microlesions并在染色蓝到深紫色的细菌。这种鲜明的对比可方便检测系统，效在microlesions在感染后期的当病变都较大。为了验证S的存在肺炎心脏microlesions内，进行用抗血清血清型4荚膜多糖免疫荧光显微镜是受TIGR4携带。重要的是，特异的抗荚膜抗体应该使用依赖于肺炎球菌菌株是用于实验性攻击的血清型。可替代地，研究者还可以使用市售的单克隆抗体针对肺炎球菌，S的成孔毒素肺炎，或肺炎球菌细胞壁的该检测元件（ 即 ，TEPC-15）。尽管这些抗体检测心脏内的肺炎球菌，过去的经验表明，抗荚膜多糖提供最引人注目的图像7。
肺炎链球菌介导的心脏microlesion形成需要的相互作用肺炎球菌粘附素胆碱通过细胞7,8-结合蛋白A和宿主蛋白层粘连蛋白受体，细菌粘附到血管内皮细胞和细菌细胞壁磷酰胆碱与主机血小板活化因子受体细菌轮回相互作用。因此，重要的是要注意，microlesion形成紧密相连传染性负担和时间，这增加了这些交互的频率和持续时间，并允许时间为细菌复制和可见病变发展。我们先前已经决定，S的一个ip感染剂量大于1.0×10 3 CFU 肺炎应变TIGR4导致小鼠的太迅速死亡，结果差的病变的形成。下面这个感染剂量自发清除发生在一些小鼠和其他严重的疾病的迟发性观察。然而，对于挑战与1.0×10 3至24 CFU TIGR4，36小时小鼠，病变迅速积聚在数量和规模的扩大不断，直到鼠标变成奄奄一息。因此，需要的感染菌株的感染剂量被滴定到复制疾病的类似状态下与垂死状态显影在不低于30 HPI。重要的是，我们已多次观察心肌病变形成在被感染鼻用1.0×10 7 CFU和气管内有1.0×10 5 CFU TIGR4的小鼠。下面这些挑战的路线发展严重的疾病发生在稍后的时间点。我们也观察到了S.其他毒株microlesion形成肺炎 ，如血清型2菌株D39，尽管在不同的频率。因此，病变不是IP感染途径或特定于TIGR4的结果，而是依赖于持续时间的疾病发作和严重程度。在此，我们建议感染小鼠的IP，因为这个挑战的路线提供了最高程度的重现性。如果差异的S. erent株肺炎 ，要么采用不同的感染途径是期望的，研究者的目标应当是菌血症在水平> 10 5 CFU毫升血液至少24小时。
抗菌干预允许疗养期间发生的事件，造型，在重症监护室的设置人的研究。值得注意的是，并不是所有的小鼠存活，尽管抗微生物处理，并证实细菌清除。研究者应该期望在50-60％之间，因此应相应地调整队列的大小，处理动物的损失存活率。强烈建议24小时后动物的定期监测，以确保符合机构批准的动物协议。中苦天狼红染色是用于可视化的胶原沉积一个简单的标准技术。在这里，它演示了如何这种染色可用于检查心脏的心室心肌重塑以下创伤infectiou肥皂剧情。中苦天狼红被选择比其它常用的技术来可视化胶原的沉积，如“马松三色染色”，因为形成鲜明对比的是所提供的沉积的胶原蛋白和周围组织之间。这已被证明评估心肌胶原沉积的程度时使用的软件，如ImageJ的下列抗生素以定量的方式是相当有用的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
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