Abstract
Under bakteriemi Streptococcus pneumoniae kan translokera över kärlendotelet i hjärtmuskeln och bildar diskreta bakteriefyllda mikroskopiska lesioner (små sår) som är anmärkningsvärt på grund av frånvaron av infiltrerande immunceller. På grund av deras frigivning av kardiotoxiska produkter, S. pneumoniae inom små sår tros bidra till hjärtsvikt som ofta observeras under DUNDRA invasiv pneumokocksjukdom hos vuxna. Häri demonstreras ett protokoll för experimentell mus infektion som leder till reproducerbara hjärt microlesion bildning inom 30 timmar. Undervisningen ges på microlesion identifiering i hematoxylin & eosin färgade hjärtsektioner och de morfologiska skillnaderna mellan tidiga och sena små sår är markerade. Undervisningen ges på ett protokoll för verifiering av S. pneumoniae inom små sår med hjälp av antikroppar mot pneumokock kapselpolysackarid ochimmunfluorescensmikroskopi. Sist är ett protokoll för antibiotika ingripande som räddar infekterade möss och för kartläggning och bedömning av ärrbildning i hjärtat på konvalescent möss tillhandahålls. Tillsammans kommer dessa protokoll lätta utredningen av de molekylära mekanismerna bakom pneumokocker hjärt invasion, cardiomyocyte död, hjärt ombyggnad till följd av exponering för S. pneumoniae, och immunsvaret på pneumokocker i hjärtat.
Introduction
Sjukhusvistelse för vuxna för samhällsförvärvad pneumoni (CAP) bär en dokumenterad risk för skadliga hjärthändelser som bidrar till dödligheten 1-4. I en färsk undersökning från Corrales-Medina et al. Hjärtkomplikationer befanns vara associerad med och / eller svarar för 27% av lunginflammation associerade dödsfallen 3. Streptococcus pneumoniae (pneumokocker), den vanligaste orsaken till CAP och sepsis 5, har direkt samband med ogynnsamma hjärthändelser i så många som 19% av upptagna vuxna patienter 6. Negativa hjärt händelser i samband med lunginflammation inkluderar nya eller förvärrats hjärtsvikt, arytmier och hjärtinfarkt i fallande frekvens 6.
I en nyligen PLoS Pathogens artikel av Brown et al., S. pneumoniae befanns vara i stånd att translokering genom hjärt kärlendotel, inträde i myocardium, och bildandet av diskreta icke variga mikroskopiska lesioner (små sår) fyllda med bakterier i kamrarna under invasiv pneumokocksjukdom (IPS) 7. Bevis på hjärt microlesion bildning observerades i hjärtprover från icke-mänskliga primater och individer som hade gett efter för pneumokockinfektion. Likaså experimentellt infekterade möss reproducerbart utvecklat hjärt små sår. Hos möss var microlesion storlek och antal positivt korrelerad med varaktighet och svårighetsgrad av bakteriemi, nivåer av kardiellt troponin i serum, och avvikande hjärtats elektrofysiologi. Bakteriell translokation in i hjärtat befanns inträffa genom samma mekanismer som ansvarar för translokation av pneumokock över blod-hjärnbarriären och utveckling av pneumokockmeningit, dvs, kolinbindande protein A förmedlad invasion av vaskulära endotelceller i en Lamininreceptor och Platelet aktiverande faktor-receptorberoende sätt 8. Microlesion formation krävs också pneumokock porbildande toxin pneumolysin som hittades döda cardiomyocytes 7.
Pneumococcal hjärt små sår är distinkta från purulent mjukvävnad och hjärt abscesser som orsakas av andra grampositiva bakterier inklusive Staphylococcus aureus. Dessa kännetecknas av en enda härdar av bakterier omgivna av neutrofiler och fibrinavsättning 9,10. Små sår som bildas av S. pneumoniae är mindre i storlek, fördelade över en drabbad hjärta, och saknar immun cellinfiltrat. Under de tidiga stadierna av infektion, små sår orsakad av S. pneumoniae visas som områden med skadad eller inflammerad vävnad som påminner om de patologiska tecken på kardiomyopati. Vissa monocyter kan observeras under denna tid, men deras närvaro är kortlivad och lesioner snabbt blivit nekrotisk i utseende och fylld med bakterier samtidigt fortsätter att grow i storlek tills djurets död eller antimikrobiell ingripande. Viktigt inom 3 dagar av antibiotika ingripande, är ymnig immuncellinfiltration observerades vid den förra lesionsstället och detta åtföljs av robust kollagenavsättning. Liknande hjärt ombyggnad har rapporterats förekomma efter infarkt tillsammans med bestående konsekvenser för hjärtfunktion 11-15. Således små sår är en potentiell förklaring till de negativa hjärthändelser som inträffar under IPD och möjligen den ökade förekomsten av hjärtrelaterade dödligheten i konvalescent individer som har överlevt sjukdomen episoden.
Häri finns instruktioner ges på den experimentella musmodell av IPD och hjärt lesionsbildning och visualisering av hjärt små sår på tidiga och sena stadier av infektion. Protokollet för detektion av kollagen nedfall hos djur som har räddats av antimikrobiell ingripande demonstreras. Målet med denna artikel är att facilitate forskning av andra utredare på denna viktiga och nya pneumokock patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Samtliga mus experiment granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittéer vid The University of Texas Health Science Center på San Antonio (protokoll # 13032-34-01C). Djuromsorg och experimentella protokoll vidhäftade offentlig rätt 89-544 (djurskyddslagen) och dess ändringar, Public Health Services riktlinjer, och Guide för skötsel och användning av försöksdjur (US Department of Health & Human Services).
1. Infektion
- Erhåll BALB / c-möss av båda könen i åldrarna från 10 till 12 veckors ålder.
OBS: S. pneumoniae serotyp 4 stam TIGR4 är en virulent kliniskt isolat som har sekvens 16. - Grow TIGR4 i Todd-Hewitt-buljong vid 37 ° C i 5% CO 2 tills den når en optisk densitet (OD) 620 av 0,5 (motsvarande 1,0 x 10 8 kolonibildande enheter [CFU] / ml). Pellets pneumokock kulturen genom centrifugering under 10 min vid 3, 500 xg och avlägsna supernatanten med hjälp av en vakuumledning. Suspendera och späd bakterier med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutkoncentration av 1,0 x 10 4 CFU / ml.
- Använda en induktionskammare, söva möss med 2,5% förångas isofluran i syre. Bekräfta sövda tillståndet genom försiktig tå nypa med trubbiga pincett.
- Håll sövda musen genom sin nackskinnet och upprätt med en hand, injicera varje mus intraperitonealt (ip) med 100 pl av S. pneumoniae suspension med användning av en spruta med en 27 till 30 gauge-nål (motsvarande en provokationsdos av 1,0 x 10 3 CFU). Placera musen tillbaka i sin bur. Möss vakna vanligtvis 30-40 sek efter injektion.
- Låt infektionen fortsätta i åtminstone 24 (tidigt) eller 30 (avancerad) hr.
- Euthanize mössen genom CO 2 kvävning. Utför halsdislokation att säkerställa musen har avlidit. Eutanasi bekräftas ytterligare av borttagningav hjärtat i steg 1.6.
- Desinficera svansen med en alkoholservett och klipp en 2-3 mm sektion. Samla 2 pl blod och seriellt späda blodet 10-faldigt i PBS innehållande natrium heparin en U / ml fem gånger. Plate serieutspädningar på en tryptisk soja blodagarplatta och inkubera över natten vid 37 ° C i 5% CO 2. Nästa dag extrapolera från koloni räknas nivån av bakteriemi.
- Immobilisera musen i ryggläge på en kirurgisk plattform. Spraya bröstet med 70% etanol och klappa torrt. Använda kirurgisk sax och pincett öppna brösthålan, avlägsna bröstkorgen, och transekt membranet att exponera hjärtat och lungorna. Använda sax klippa blodkärlen kopplade till hjärtat och försiktigt skära hjärtat med omsorg för att undvika blåmärken med pincett.
- Skölj hjärtat med PBS och sedan placera in vävnadsprover insamlings kassetter sådana att koronala sektioner skulle erhållas vid vävnadssnittning. För paraffininbäddning, place kassetterna i 10% buffrad formalinlösning och nästa dag skicka för paraffininbäddning.
- Alternativt flash frysa använder OCT-förening inom en cryomold som har placerats på torris.
2. Visualisering av hjärtskador och Pneumokocker inom lesioner
- Skär ner paraffininbäddade hjärtsektioner så att de 4 hjärtats kamrar är synliga i varje avsnitt vävnad. Skär diabilder på tjocklek på 5 pm.
- Avparaffinera och fläck glider med hematoxylin och eosin (H & E) med hjälp av standardmetoder 17.
- Visa H & E färgade hjärt sektioner med hjälp av en ljusmikroskop vid låg (100X, 200X) och hög (olja nedsänkning: 400X, 1,000X) förstoringar. Karaktärisera hjärtan för närvaron av små sår i myokardiet. Här, förvärvar H & E bilder med hjälp av en Zeiss Axioskop 2 mikroskop utrustat med ett 100X 1.3 numerisk apertur Plan-Neofluar mål.
OBS: På stadier tidigt hjärt lesions diskrimineras av sin differential färgade utseende och i vissa fall närvaron av immunceller (monocyter och granulocyter) vad verkar vara monocyter. I avancerade lesioner, särskilt de som ses vid 30 tim, immunceller är frånvarande och stora vacuole liknande lesioner observeras i deras ställe. Det är viktigt att notera att medan immuncellinflödet under de tidiga stadierna av hjärt lesionutveckling kan ske är det inte verkar vara ett krav.
3. immunfluorescensmikroskopi för Pneumokocker inom små sår
- Avsnitt hjärta i cryomolds med mikrotom till en tjocklek av 5 ^ m och placera sektionerna på positivt laddade objektglas. Tillåt frysta hjärt sektioner tina och lufttorka. Fix sektioner för 10 min i 10% neutral buffrad formalin (pH 6,8-7,2 vid 25 ° C).
- Tvätta glasen (3x) i PBS under 5 min, permeabilisering för 15 min i 0,2% Triton X-100 i PBS, tvätta sedan igen i PBS.
- Blockvävnads avs på på objektglas med 10% getserum i PBS under 1 timme.
- Skölj objektglasen med PBS, lock och inkubera hjärtsektioner med kanin anti-serotyp 4 pneumokocker antiserum vid en: 1000 i PBS med 10% getserum under 2 timmar vid 37 ° C.
OBS: För negativa kontroller utredare bör använda naiva kaninantiserum - Efter tvättning med PBS, lock och inkubera sektioner med 10% getserum-PBS med get-anti-kanin-FITC-konjugerad antikropp vid 1: 2000 i 30 minuter vid 37 ° C.
- Efter tillverkarens anvisningar, använd DAPI (4 ', 6- diamidino-2-fenylindol) vid 5 mg / ml för visualisering av eukaryota cellkärnor. Tvätta och montera vävnadssnitt med FluorSave.
- Förvärva fluorescerande bilder med hjälp av ett konfokalmikroskop system på både låg och hög förstoring. Justera numeriska bländar följaktligen att få optimala resultat. Här, förvärva fluorescerande bilder med hjälp av en konfokala system med en 60X 1,42 numerisk objektiv bländare.
- Börja med möss infekterade ip med 1,0 x 10 3 CFU TIGR4 såsom tidigare angivits i steg 1.
- Med början vid 30 h efter infektion, administrera farmaceutisk grad ampicillin ip (80 mg / kg kroppsvikt) i 100 pl saltlösning varje 12 h under 36 h. Samla hjärtan på önskad tidpunkt och förfarande som beskrivs i steg 1,6 för paraffininbäddning och vävnad, snittning.
5. Collagen Deposition Detection
- Använda xylen och graderade alkohol tvättar med avjoniserat vatten, Avparaffinera och hydrat vävnadssnitt med hjälp av standardmetoder 17. Behandla sektioner med vattenhaltig 0,2% fosfomolybdensyra för 5 minuter och skölj med avjoniserat vatten under 5 minuter.
- Fläcken sektioner med 0,1% Sirius Red i pikrinsyra för 2 h vid rumstemperatur.
- Tvätta avsnitt i 0,01 N klorvätesyra under 3 min och skölj med användning 70% etanol under 1 min.
- Dehydrate sektionerna med hjälp av identiska men motsatt ordning tvättar till det som beskrivs i 5.1, torkar hjärt sektioner öka och graderade koncentrationer av etanol då xylen.
- Mount vävnadssnitt med en monteringslösning för mikroskopisk utvärdering.
- För att identifiera områden av kollagen nedfall, undersöka färgade sektioner för områden med djup läsning färgning under lågt och hög förstoring med hjälp av en ljusmikroskop vävnad. Varje område inom kamrarna i hjärtat som är röd är ett område där kollagen har deponerats. Områden utan denna röda fläck är områden av frisk vävnad som saknar koUagendeposition. Häri förvärvar Picro Sirius Red färgade bilder med hjälp av ett mikroskop utrustat med en 20X 0,5 numerisk objektiv bländare.
OBS: Atrium fläckar röda i friska vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visualisering av små sår från H & E
Hjärt små sår observerades i ventriklar H & E färgade hjärtsektioner från möss med IPD följande deras ip utmaning med TIGR4. Figur 1 visar ökningen i storlek av dessa lesioner mellan 24 och 30 h efter infektion (HPI), med större antal hematoxylin -stained (dvs, lila-blå) pneumokocker synliga inom lesionen. Små sår kännetecknades av en vacuole liknande morfologi, tätare eosin (röd) färgning av hjärtmuskelceller i cellerna omedelbart intill lesionsstället, diplokocker inom lesioner, och en allmän brist på immunceller. Hälften av skadorna var ungefär intill synliga blodkärl. Mellan 24 och 30 HPI små sår blev fler och betydligt större. Vid 30 hpi extracellulära bakterier ofta kunde ses streaming från en skada mellan celler.
Visualizatipå S. pneumoniae Använda immunfluorescensmikroskopi
Att visualisera och bekräftar att S. pneumoniae verkligen var inom lesioner, var immunofluorescerande färgning för serotyp 4 kapselpolysackarid som produceras av TIGR4 (Figur 2) som används. Bilder som tagits visade förekomst av tätt packade och täta aggregat av S. pneumoniae inom microlesion sajter.
Bevis på Cardiac ärrbildning
Picro Sirius Röd färgning utfördes på hjärtsektioner från möss som hade räddats med ampicillin och oinfekterade kontroller. I antibiotika räddade tillfrisknat möss, fanns det en dramatisk ökning i närvaro och intensitet Picro Sirius Röda fläcken med band streaming från vad som verkar vara gamla lesioner platser i ventriklarna (Figur 3). Däremot var ventriklarna i kontrollsektioner ofärgade indikerar att koUagendeposition var frånvarande (Ej visad).
Tillsammans dessa resultat visa förmåga att visualisera hjärt små sår i möss med svår IPD och för att få tillgång resulte ärrbildning i kamrarna använder vanliga histologiska förfaranden. Viktigt är hjärt små sår alltid kopplat till höga titrar av S. pneumoniae och tid som behövs för att mediera deras bildning.
Figur 1: Upptäckt av små sår i H & E färgade hjärtsektioner Bilderna (1,000X) av hjärt små sår som observerats vid 24 hor och 30 timmar efter infektion.. Svart skala barer motsvarar 10 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
filer / ftp_upload / 52.590 / 52590fig2.jpg "/>
Figur 2: Immunofluorescerande upptäckt av S. pneumoniae inom hjärt små sår. immunfluorescensmikroskopi använder antikropp mot serotyp 4 kapselpolysackarid (grön) bekräftade förekomsten av S. pneumoniae inom hjärt små sår. Kärnorna färgades blå med DAPI. Vit skala bar motsvarar 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Collagen deponering vid en tidigare hjärt microlesion webbplats i en konvalescent mus Representant bild (200X) som visar en Picro Sirius Röd färgade hjärt microlesion i ventrikeln av en mus 5 dagar efter antibiotika ingripande i.vasive pneumokocksjukdom. Rött indikerar koUagendeposition. Svart skal motsvara 20 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport, att en mycket reproducerbar metod inducerar S. pneumoniae -medierad hjärt små sår hos möss under IPD och tekniker för deras visualisering demonstreras. Möss infekterade med en dos av bakterier som överträffar immunsystemets tröskel för klarering, vilket leder till hög kvalitet bakteriemi, liknande det som sker under mänsklig sepsis, och leder till eventuell bakteriell transloka i hjärtmuskeln. För ännu okänd anledning, S. pneumoniae i hjärtat kan replikera avskräckas av värdens immunsvar. Detta är föremål för pågående utredning och denna publikation kan underlätta andra utredare i deras ansträngningar att delta.
H & E färgning tillåter microlesion visualisering med standard ljusmikroskop eftersom kardiomyocyter fläck rosa till rött, medan hjärt små sår och bakterierna inom fläck blå till Deep Purple. Detta skarp kontrast möjliggör enkel detectipå de små sår vid senare stadier av infektion när de skador är större. För att kontrollera förekomsten av S. pneumoniae inom hjärt små sår, var immunfluorescensmikroskopi med användning antiserum mot serotyp 4 kapselpolysackarid som bärs av TIGR4 utförs. Viktigt det specifika anti-kapsel antikropp som ska användas beror på serotyp av pneumokocker stam som används för experimentell utmaning. Alternativt kan utredarna också använda kommersiellt tillgängliga monoklonala antikroppar mot pneumolysin, det porbildande toxin av S. pneumoniae, eller att detektera komponenter av pneumokock cellväggen (dvs TEPC-15). Även om dessa antikroppar detekterar pneumokocker i hjärtat tyder tidigare erfarenheter att antikroppar mot kapselpolysackarid ge den mest övertygande bilder 7.
S. pneumoniae medierad hjärt microlesion bildningen kräver samverkan avpneumokock adhesinet Kolin bindande protein A med värdprotein Lamininreceptor för bakteriell vidhäftning till vaskulära endotelceller och interaktion av bakteriecellväggen fosforylkolin med värdblodplättsaktiverande faktor-receptom för bakteriell transmigration genom cellen 7,8. Därför är det viktigt att notera att microlesion bildningen är tätt kopplat till smitt börda och tid, vilket ökar frekvensen och varaktigheten av dessa interaktioner och ger tid för bakterierna att replikera och synliga skador utvecklas. Vi har tidigare konstaterat att ett ip smittsam dos som är större än 1,0 x 10 3 CFU S. pneumoniae-stammen TIGR4 resulterar i alltför snabb död av musen och som ett resultat dålig lesionsbildning. Nedanför denna smittdosen spontana clearance sker i vissa möss och andra fördröjd debut av svår sjukdom observeras. Men för möss utmanade med 1,0 x 10 3 CFU TIGR4 mellan 24 och 36 timmar,lesioner snabbt ackumuleras i antal och växer i storlek kontinuerligt tills musen blir döende. Således behöver den smittdosen av infekterande stammen som ska titreras att replikera en liknande tillstånd av sjukdom med ett döende tillstånd utvecklas i inte mindre än 30 HPI. Viktigt har vi upprepade gånger observerat hjärt lesioner i möss som infekterats intranasal med 1,0 x 10 7 CFU och intratrakealt med 1,0 x 10 5 CFU TIGR4. Efter dessa utmaning vägar utveckling av svår sjukdom inträffade vid senare tidpunkter. Vi observerade också microlesion bildning med andra virulenta stammar av S. pneumoniae, såsom serotyp 2 isolat D39, om än i olika frekvenser. Sålunda lesioner är inte ett resultat av ip infektion rutt eller specifika för TIGR4, men i stället bunden till varaktigheten och svårighetsgraden av sjukdomen episod. Häri rekommenderar vi att infektera möss ip eftersom denna utmaning väg erbjuder den högsta graden av reproducerbarhet. Om en difftekniker när stam av S. pneumoniae används eller en annan smittsam väg önskas, utredare bör sträva efter bakteriemi vid nivåer> 10 5 CFU ml blod i minst 24 timmar.
Antimicrobial ingripande möjliggör studier av händelser som inträffar under konvalescens, modellerings en människa i intensivvårdsavdelning inställning. Det är värt att notera att inte alla möss överlever trots antimikrobiell behandling och bekräftade bakteriell clearance. Utredarna bör förvänta överlevnad mellan 50-60% och som sådan bör justera kohorten storleken i enlighet därmed att hantera förlusten av djur. Regelbunden kontroll av djur efter 24 tim rekommenderas att säkerställa att Institutional godkända djurprotokoll. Picro Sirius Red-färgning är en enkel och vanlig teknik som används för att visualisera kollageninlagring. Häri är det visat hur denna fläck kan användas för att undersöka hjärt remodellering i ventriklarna av hjärtat efter en traumatisk infectious episod. Picro Sirius Röd valdes framför andra vanligen använda tekniker för att visualisera koUagendeposition, såsom "Massons Trichrome Stain", på grund av den skarpa kontrasten det erbjuds mellan den avsatta kollagen och omgivande vävnad. Detta har visat sig vara oerhört användbart vid bedömningen av omfattningen av hjärtinfarkt koUagendeposition efter antibiotika på ett kvantitativt sätt med hjälp av program som ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Neogen | 7161A | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek (Sakura Finetek) | 4583 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (Acros) | 9002-93-1 | |
| Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| anti-serotype 4 pneumococcus antiserum | Statens Serum Institut | 16747 | |
| goat anti-rabbit FITC conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-096-144 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluorsave | Millipore | 345789 | |
| Permount | Fisher Scientific | S70104 | |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | |
| phosphomolybdic acid 0.2% | Electron Microscopy Sciences | 26357-01 | |
| 0.1% Sirius Red in picric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-02 | |
| 0.01 N hydrochloric acid | Electron Microscopy Sciences | 26357-03 | |
| Tissue Tack Microscope Slides | Polysciences, Inc | 24216 | |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | unspeciified | Standard |
References
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality. Circulation. 125, 773-781 (2012).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes. Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies. PLoS Med. 8, e1001048 (2011).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin. Proc. 89, 60-68 (2014).
- Kumar, S., et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection. Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).
- Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events. Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).
- Brown, A. O., et al. Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function. PLoS Pathogens. In press, (2014).
- Orihuela, C. J., et al. Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models. The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).
- Flick, M. J., et al. Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia. Blood. 121, 1783-1794 (2013).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).
- Arenal, A., et al. Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).
- Deneke, T., et al. Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).
- Bakker, J. M., et al. Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation. Circulation. 77, 589-606 (1988).
- Verma, A., et al. Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).
- Wu, K. C. Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI. Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293, 498-506 (2001).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
