Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

חקר הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2 באמצעות כתם מערבי

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64179
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש את היישום של טכניקת כתם מערבית כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2. הפרוטוקול מתאר את חקירת הזרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז Thr906/1007 באמצעות כתם מערבי. כמו כן, שיטות נוספות לאישור פעילות KCC2 מודגשות בקצרה בטקסט זה.

Abstract

אשלגן כלורי cotransporters 2 (KCC2) הוא חבר במשפחת נשאים מומסים 12 (SLC12) של קטיון-כלוריד-cotransporters (CCCs), הנמצא באופן בלעדי בנוירון והוא חיוני לתפקוד תקין של Cl- הומאוסטזיס וכתוצאה מכך עיכוב GABAergic פונקציונלי. כישלון בוויסות תקין של KCC2 הוא מזיק ונקשר לשכיחות של מספר מחלות נוירולוגיות, כולל אפילפסיה. חלה התקדמות ניכרת בכל הנוגע להבנת המנגנונים המעורבים ברגולציה של KCC2, המוסמכים לפיתוח טכניקות המאפשרות לחוקרים לחקור את תפקידיו ופעילויותיו; או באמצעות חקירות ישירות (הערכת פוספורילציה באתרים רגולטוריים של קינאז) או בעקיפין (תצפית וניטור פעילות GABA). כאן, הפרוטוקול מדגיש כיצד לחקור זרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז - Thr906 ו- Thr1007 - באמצעות טכניקת כתם מערבית. ישנן שיטות קלאסיות אחרות המשמשות למדידה ישירה של פעילות KCC2, כגון יון רובידיום ובדיקת ספיגת יוני תליום. טכניקות נוספות כגון טלאי-מהדק-אלקטרופיזיולוגיה משמשות למדידת פעילות GABA; לפיכך, משקף בעקיפין KCC2 מופעל ו / או מומת כפי שנודע על ידי הערכה של הומאוסטזיס יון כלוריד תוך תאי. כמה מהטכניקות הנוספות הללו יידונו בקצרה בכתב יד זה.

Introduction

אשלגן כלורי cotransporters 2 (KCC2) הוא חבר במשפחת נשאים מומסים 12 (SLC12) של קטיון-כלוריד-cotransporters (CCCs), הנמצא באופן בלעדי בנוירון והוא חיוני לתפקוד תקין של Cl- הומאוסטזיס וכתוצאה מכך עיכוב GABAergicתפקודי 1,2,3,4. שמירה על ריכוז Cl תוך-עצבי נמוך ([Cl-]i) ב-4-6 mM על-ידי KCC2 מקלה על γ-חומצה אמינו-בוטירית (GABA)/גליצין היפרפולריזציה ועיכוב סינפטי במוח ובחוט השדרה5. כישלון בוויסות תקין של KCC2 נקשר לשכיחות של מספר מחלות נוירולוגיות, כולל אפילפסיה4. יתר על כן, ירידה בשחול Cl− בתיווך KCC2 ופגיעה בהיפר-פולריזציה של GABAA ו/או זרמים בתיווך קולטן גליצין היו מעורבים באפילפסיה, כאב נוירופתי וספסטיות 6,7. KCC2 עצבי מווסת באופן שלילי באמצעות זרחון של שאריות רגולטוריות מרכזיות בתחום התוך-תאי של מסוף C שלו על-ידי פרולין/אלנין (SPAK)/קומפלקס קינאז חמצוני מגיב לעקה חמצונית (OSR), המאפשר שמירה על פעילות GABA דה-פולריזציה בתאי עצב לא בשלים 2,8,9 . הזרחון WNK-SPAK/OSR1 משמיט שאריות תראונין 906 ו-1007 (Thr906/Thr1007) ולאחר מכן מפחית את ביטוי הגן mRNA של KCC2, מה שמוביל להידרדרות בתפקוד הפיזיולוגי שלו 8,10. חשוב מכך, עם זאת, זו כבר עובדה שקומפלקס הקינאז WNK-SPAK/OSR1 ידוע כזרחן ומעכב ביטוי KCC2 1,2,4,11,12, וכי העיכוב של מסלולי האיתות המורכבים של קינאז לזרחן Thr906/Thr1007 נקשר לביטוי מוגבר של הגן KCC2 mRNA13,14,15 . חשוב לציין כי ויסות הביטוי העצבי KCC2 ו-Na+-K+-2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) באמצעות זרחון חלבונים פועל במקביל ובתבניות מנוגדות 1,4,16.

חלה התקדמות עקבית וניכרת בכל הנוגע להבנת המנגנונים המעורבים ברגולציה של KCC2, המוסמכים לפיתוח טכניקות המאפשרות לחוקרים לחקור את תפקידיו ופעילויותיו; או באמצעות חקירות ישירות (הערכת פוספורילציה באתרים רגולטוריים של קינאז) או בעקיפין (תצפית וניטור פעילות GABA). הפרוטוקול המוצג כאן מדגיש את היישום של טכניקות הכתמה המערביות כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של K+-Cl- טרנספורטר משותף עצבי KCC2 על ידי חקירת הזרחון של הקוטרנספורטר באתרי הרגולציה של קינאז Thr906/1007.

כתם מערבי הוא שיטה המשמשת לזיהוי חלבונים ספציפיים בעלי עניין מדגימה של רקמה או תא. שיטה זו מפרידה תחילה את החלבונים לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה. לאחר מכן החלבונים מועברים אלקטרופורטית לתמיכה מוצקה (בדרך כלל קרום) לפני שחלבון המטרה מסומן באמצעות נוגדן ספציפי. הנוגדנים מצומדים לתגים שונים או לנוגדנים מצומדים לפלואורופור המזוהים באמצעות שיטות colorimetric, chemiluminescence או פלואורסצנטיות. זה מאפשר לזהות חלבון מטרה ספציפי מתערובת של חלבונים. טכניקה זו שימשה לאפיון אתרים זרחניים של KCCs1 ושימשה לזיהוי מעכבי קינאז המעכבים זרחון KCC3 Thr991/Thr104817. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לזהות באופן ספציפי KCC2 כולל וזרחני מליסאטות תאים/רקמות. באופן עקרוני, זיהוי נוגדנים מצומדים לחלבון בטכניקה זו הוא בעל חשיבות רבה מכיוון שהוא מסייע לשפר את ההבנה של פעילויות שיתופיות באתרי הפוספו של KCC2, אשר שופך אור על המנגנונים המולקולריים המעורבים בתקנות הפיזיולוגיות שלהם. הניתוח הכמותי של ביטוי החלבון הכולל מייצג את הפונקציה והפעילות של KCC2. ישנן שיטות קלאסיות אחרות המשמשות למדידה ישירה של פעילות KCC2, כגון יון רובידיום ובדיקת ספיגת יוני תליום. טכניקות נוספות כגון טלאי-מהדק-אלקטרופיזיולוגיה משמשות למדידת פעילות GABA; לפיכך, משקף בעקיפין KCC2 מופעל ו / או מומת כפי שנודע על ידי הערכה של הומאוסטזיס יון כלוריד תוך תאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול מתאר את שיטת הכתם המערבית לאיתור חלבונים ספציפיים בעלי עניין.

1. תרבית תאים וטרנספקציה

  1. חממו את כל הריאגנטים באמבט החרוזים (37 מעלות צלזיוס) לפני הליך תרבית התאים. הכינו מדיום תרבית, מדיום נשר מעובד (DMEM) של Dulbecco, בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 1% כל אחד של 2mM L-גלוטמין, 100x חומצת אמינו לא חיונית, 100 mM נתרן פירובט ו-100 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. להפשיר ביציבות חולדה KCC2b כליה עוברית אנושית 293 תאים (HEK293rnKCC2b)18 לחלוטין באמבט החרוזים (37 מעלות צלזיוס). העבירו את התאים מהצינור הקריוביאלי לצינור צנטריפוגה המכיל 5 מ"ל של חומר טרי. סובבו את התא ב-1200 × גרם למשך 3-5 דקות.
  3. השתמשו בפיפטת אספירטור (מקובעת למשאבת ואקום) כדי לשאוף את הסופר-נטנט והוסיפו 10 מ"ל של מדיה טרייה כדי להשעות מחדש את התאים. מעבירים את מתלה התא לצלחת בגודל 10 ס"מ.
  4. מכניסים את המנה לחממה ומאפשרים לה לגדול במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO2 . עקוב אחר תקופת הדגירה כדי להבטיח צמיחת תאים בריאה. פיצול נוסף של התאים כאשר הם הגיעו למפגש של מעל 90% לאחר תקופת הדגירה.
  5. שאפו את המדיה הישנה מתוך צלחת התאים ושטפו בעדינות את התאים עם 2 מ"ל של מלח חיץ פוספט (PBS). מוסיפים 2 מ"ל של טריפסין ודוגרים במשך כ 1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. השתמש 2 מ"ל של מדיה מלאה כדי לשטוף בעדינות את התאים טריפסינים בצלחת. הוסיפו 9 מ"ל של מדיה טרייה למנות חדשות והוסיפו תמיסה של 1 מ"ל מהמנה הישנה לכל אחת מהמנות החדשות. העבירו את הכלים המפוצלים בחזרה לחממה למשך 48 שעות כדי להגיע למפגש של 90% ≥.
  7. התייחסו לתאים עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כבקרה, 8 μM staurosporine, או 0.5 mM N-ethylmaleimide (NEM) במשך 15 דקות לפני קצירת התאים בחיץ ליזה.

2. הכנת ליזטים של תאים וטעינת דגימות

  1. לשאוף את התקשורת על צלחת התרבות (מתוך נהלי transfection). מניחים את תרבית התאים על קרח ושוטפים את התאים עם PBS קר כקרח.
  2. שאפו את ה-PBS, ולאחר מכן הוסיפו 1.0 מ"ל של חיץ ליזיס קר כקרח המכיל 50 mM tris-HCl (pH 7.5), 1 mM אתילן גליקול-ביס(β-אמינואתיל אתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראאצטית (EGTA), 1 mM חומצה אתילנדיאמינטטראאצטית (EDTA), 50 mM נתרן פלואוריד, 5 mM נתרן פירופוספט, 10 mM נתרן-β-גליצרופוספט, 1 mM נתרן אורתובנאדט, 1% (w/v) טריטון X-100, 0.27 M סוכרוז, 1 mM בנזאמין, 0.1% (v/v) 2-mercaptoethanol, ו 2 mM פנילמתיל-סולפונילפלואוריד (PMSF) לתבשיל.
    הערה: נפח מאגר התזה במהלך קציר התאים משתנה בהתאם לגודל הכלים, לדוגמה, 1 מ"ל של חיץ תזה מתאים לכל 1 x 107 תאים / 100 מ"מ צלחת / 150 ס"מ 2 בקבוקון, בעוד 0.5 מ"ל מתאים לכל 5 x 106 תאים / 60 מ"מ צלחת / 75ס"מ2 בקבוקון.
  3. השתמש במגרד תאים מפלסטיק קר כדי לגרד את התאים מתחתית המנה, ולאחר מכן השתמש בעדינות בפיפטה כדי להעביר את מתלה התא לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה שכבר נמצא על קרח. כל הזמן להתסיס את הצינור במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. סובבו את התא בצנטריפוגה קרה (4 מעלות צלזיוס) בטמפרטורה של 16,000 x גרם למשך 20 דקות, הסירו את הצינור בעדינות מהצנטריפוגה והניחו אותו על קרח. אסוף את הסופרנטנט לתוך צינור טרי מקורר מראש והשלך את הכדור.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את כוח הצנטריפוגה ואת הזמן בהתאם לסוג התא. עם זאת, הנחיות כלליות מעודדות צנטריפוגה בגודל 16,000 x גרם למשך 20 דקות. עם זאת, זה חייב להיקבע עבור כל ניסוי. לדוגמה, תאים עדינים כמו לויקוציטים זקוקים למהירות צנטריפוגה קלה מאוד.

3. הכנת חומרים חיסוניים מליזאטים תאיים

  1. פיפטה 300 μL של חלבון-G-sepharose לתוך צינור microcentrifuge. סובבו את התמיסה בגודל 500 x g למשך 2 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
  2. הוסף 500 μL של PBS ומערבל את הפתרון היטב. סובבו את התמיסה בגודל 500 x g למשך 2 דקות והשליכו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה.
  3. יש לערבב 1 מ"ג של נוגדנים נגד KCC2 Thr906 ואנטי-KCC2 Thr1007 עם 200 μL של חרוזי חלבון G-sepharose ולהשלים את הנפח ל-500 μL עם PBS. יש לנער על פלטפורמה רוטטת או גלגל מסתובב למשך שעתיים ב-4°C. יש לשטוף 2x עם PBS.
  4. בצע כימות חלבון על כל התא lysates ולהוסיף 1 מ"ג של התא lysate חרוזים שטף. דגירה עדינה בסיבוב מקצה לקצה במשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס. סובבו את החרוזים ושטפו אותם 3x עם PBS המכיל 150 mM נתרן כלורי (NaCl).
  5. יש לשטוף חומרים חיסוניים (חרוזים) פי 3 עם 200 μL של PBS. יש להשעות את הכדור הסופי ב-100 μL של חיץ דגימת ליתיום דודציל סולפט (LDS) אחד.
  6. נערו את הצינורות בשייקר רוטור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ודגרו אותם בבלוק חימום בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה של דגימת ההעמסה ב 11,000 x גרם במשך 2 דקות ולהשתמש supernatant לטעינת ג'ל.

4. ביצוע הכתם המערבי

  1. מרכיבים את מנגנון היציקה ויוצקים ג'ל מפרידים טרי 8% (ראו טבלה 1 למתכון/הכנה) כדי ליצוק את הג'ל המאפשר רווח של כ-2 ס"מ מראש הזכוכית היציקה. הוסף 200 μL של איזופרופנול מוחלט להתקנה ואפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות.
    הערה: המתכון לג'ל פוליאקרילאמיד לאלקטרופורזה של נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) תלוי בגודל החלבון המעניין (טבלה 2). לפיכך, רשום את גודל החלבון לפני קביעת אחוז הג'ל הרצוי.
  2. השתמש פיפטה כדי להסיר את isopropanol בזהירות לשטוף את הג'ל עם כ 200 μL של מים מזוקקים. הוסיפו ג'ל ערימה טרי של 6% (ראו טבלה 1 למתכון/הכנה) כדי למלא את החלל שגודלו כ-2 ס"מ במערך היציקה. מכניסים בעדינות למסרק הבאר ומניחים לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. תקן את הג'ל יצוק לתוך מיכל האלקטרופורזה.
  4. יש להמיס 30.3 גרם של בסיס Tris, 144.1 גרם של גליצין ו-10 גרם של SDS ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כדי להכין חיץ העברה של פי 10. הכן מאגר פועל אחד על-ידי הוספת 10 מ"ל של 10% SDS ו-100 מ"ל של מאגר העברה של פי 10 ל-890 מ"ל של מים מזוקקים.
  5. יוצקים 1x חיץ פועל לתוך המיכל. טען 5 μL של סמן משקל מולקולרי לתוך הבאר הראשונה כמות שווה של חלבון לתוך כל באר של ג'ל SDS-PAGE (בין 18-30 μL, בהתאם לגודל המסרק בשימוש). מלאו בארות ריקות ב-LDS 1x והפעילו את הג'ל במשך כ-90-120 דקות ב-120 וולט.
  6. יש להמיס 58.2 גרם של בסיס Tris ו-29.3 גרם של גליצין ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים כדי להכין חיץ העברה של פי 10. הפעל קרום ניטרוצלולוז עם חיץ העברה 1x המכיל 20% מתנול. שטפו את הג'ל והממברנה עם חיץ ההעברה ופזרו אותם בעדינות על ערימת ההכנה.
    הערה: אין צורך להתאים את ה- pH של מאגרי הריצה וההעברה מכיוון שהם צריכים להיות ב- pH האופטימלי הנדרש. כמו כן, מומלץ להכין את המאגרים הללו ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר לפני הניסוי כדי לחסוך זמן.
  7. סדרו את הכריך להעברה בסדר זה: אלקטרודה שלילית (מסגרת שחורה/קצה) - קצף סנדוויץ' - נייר סינון - ג'ל SDS-PAGE שטוף - קרום ניטרוצלולוז שטוף - נייר סינון - קצף סנדוויץ' - אלקטרודה חיובית (מסגרת אדומה). ערמו את הכריך המורכב במיכל ההעברה והפעילו 90 וולט למשך 90 דקות או 30 וולט למשך 360 דקות.

5. צביעת נוגדנים ופיתוח תמונה

  1. הסר את הממברנה ותן לה להתייבש. יש לחסום את הממברנה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות חיץ חוסם העשוי מחלב דל שומן 5% בתמיסת מלח המכילה 0.1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. לדגום את הממברנות עם דילולים מתאימים של נוגדן ראשוני 8,15,19 ובטא-אקטין (בקרת העמסה) בחסימת חיץ למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטפו את הממברנה בשלוש שטיפות של 1x TBS-T למשך 5 דקות כל אחת.
    הערה: הדגירה של הממברנה הנפרדת עם בקרות העמסה כגון בטא-אקטין, אלפא-טובולין או גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז נוגדנים היא לנרמל את תוצאות הכתם המערבי האחרות במהלך הכימות הבא. הדילול המומלץ לכל נוגדן ראשוני זמין במדריך היצרן.
  3. לדגום את הקרום השטוף עם נוגדן משני מדולל פי 5000 בחיץ חוסם למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, לשטוף את הממברנה 3x ב 1x TBS-T במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: מומלץ מאוד להעלות את הנוגדן המשני כנגד המין שבו גדל הנוגדן הראשוני. לדוגמה, אם הנוגדן העיקרי של סך KCC2 הוא עכבר אנטי-KCC2, יש להשתמש בנוגדן המשני לאנטי-עכבר.
  4. מניחים את הממברנה השטופה על לוח ההדמיה. ערבבו נפחים שווים של כל מגיב כימילומינסנציה משופר (ECL) ופזרו בעדינות את התמיסה המעורבת על הממברנה כדי לפתח אותות.

6. רכישת תמונות באמצעות מערכת הדמיה וכימות נתונים

  1. העבר את לוח ההדמיה לתא המתאים במערכת ההדמיה להדמיה. פתח את תוכנת ההדמיה במחשב לעיבוד תמונה.
  2. בסרגל הכלים, לחץ על פרוטוקול חדש ובחר ערוץ יחיד. לחץ על בחר תחת תיבת הדו-שיח הדמיית ג'ל/יישום, גלול אל כתם ובחר כימי היי רגישות או Chemi Hi רזולוציה. לאחר מכן לחץ על הגדרת הצטברות אותות כדי להגדיר את משך הזמן ומספר התמונות לרכישה.
  3. לחץ על מקם ג'ל תחת הגדרת פרוטוקול והתאם את הג'ל במערכת ההדמיה במידת הצורך. לחץ על הפעל פרוטוקול כדי להשיג את התמונות.
  4. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אחת התמונות שנרכשו מתחת לתיבת קטלוג ההדמיה כדי לשמור את התמונות במחשב. נווט אל התמונה הרצויה ולחץ על בחר תמונה והמשך בתיבת הדו-שיח הפעלה.
  5. לחץ על סמל שינוי צורה של תמונה כדי להתאים את הניגודיות ואת רוויית הפיקסלים של התמונה. לחץ על צילום מסך סמל בסרגל הכלים הכללי כדי לשמור את התמונה במחשב בהתאם לפורמט התמונה הרצוי.
  6. מדוד את צפיפות הפסים באמצעות תוכנת ImageJ ונתח באמצעות כלים סטטיסטיים מתאימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, התוצאה המייצגת המוצגת באיור 1 חקרה את ההשפעה של סטאורוספורין ו-NEM על זרחון מתווך WNK-SPAK/OSR1 של KCC2 ו-NKCC1 בקווי תאים HEK293 המבטאים ביציבות את KCC2b (HEKrnKCC2b)18 באמצעות טכניקת הכתם המערבי. פרטים מקיפים על התוצאות המייצגות נדונים ב- Zhang et al.15. בדומה ל-NEM, סטאורוספורין הוא מעכב קינאז רחב שיכול לשפר את פעילות ההובלה של KCC2 ולעכב את פעילות NKCC1ב-15,20. הטיפול בתאי HEK293 עם סטאורוספורין ו-NEM גרם לירידה בזרחון באתרי המטרה של SPAK - Thr233 הממוקם בתחום T-loop kinase ובאתר הזרחון S-loop Ser373 של hsSPAK. לפיכך, שתי התרכובות קיצרו את רמות הזרחון של אתרי הפוספו SPAK הנ"ל. כמו כן, staurosporine הפחית את הזרחון של Ser940 ב HEKrnKCC2b, אבל NEM הגדיל באופן משמעותי את הזרחון שלה. יתר על כן, staurosporine מפחית פוספורילציה באתר Thr505, בעוד NEM גרם לעלייה קלה, אך לא משמעותית בזרחון באותו אתר. ההשפעות הדיפרנציאליות של שתי התרכובות על זרחון של חלבון קינאז C (PKC) באתר Thr505, ו- KCC2b באתר Ser940 מתואמות היטב. התוצאה המייצגת הראתה גם כי שני הסוכנים שינו את הביטוי של סך rnKCC2b, hsNKCC1 או hsSPAK. NEM (אך לא טיפול staurosporine) גרם לעלייה משמעותית בביטוי של כמות KCC2 הכוללת, בעוד שהביטוי של סך NKCC1 ו- SPAK לא השתנו באופן משמעותי כאשר טופלו בשתי התרכובות. יתר על כן, שתי התרכובות גרמו לירידה בזרחון של SPAK באתרים Thr233 ו- Ser373, וזה היה בקורלציה עם הזרחון המקוצר של אתרי Thr906/Thr1007 ו- Thr203/207/212 באתרים rnKCC2b ו- hsNKCC1, בהתאמה. בנוסף, staurosporine ו-NEM הפחיתו והגבירו את הזרחון של PKC באתר Ser940 ב-rnKCC2b, בהתאמה, אשר תאם עם ההפחתה והתוספת בזרחון של PKC-δ באתר Thr505 לאחר טיפול בסטאורוספורין וב-NEM, בהתאמה (איור 1).

Figure 1
איור 1: ניתוחים כמותיים של אתרי פוספו rn KCC2b ו-hs NKCC1 לאחר טיפול בסטאורוספורין ו-NEM בתאי HEK rn KCC2b. (A) תאי HEK rn KCC2b שעברו טרנספקציה יציבה טופלו ב-DMSO (בקרה), 8 מיקרומטר סטאורוספורין, או 0.5 mM NEM למשך 15 דקות. ליזטים של תאים נקטפו ונחשפו למשקעים חיסוניים (IP) ואימונובלוט (IB) עם נוגדנים שצוינו. קיצורים: D = דימריק KCC2; M = מונומרי KCC2. (B) כימות אימונובלוט של תאיHEK rn KCC2b שעברו טרנספקציה יציבה. עוצמות הלהקה כומתו באמצעות תוכנת ImageJ. עמ' < 0.001; **עמ' < 0.01; מבחן וילקוקסון-מאן ויטני (n = 6). נתון זה שונה מ- Zhang et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

8 מ"ל של 8% ג'ל נפרד 5 מ"ל של 6% ג'ל לערימה
החומרים הדרושים נפח (μL) החומרים הדרושים נפח (μL)
מזוקק H2O 4200 מזוקק H2O 2900
40% אקרילאמיד 1600 40% אקרילאמיד 750
1.5 מטר טריס pH 8.8 2000 0.5 מטר טריס pH 6.8 1250
10% SDS 80 10% SDS 50
10% APS 80 10% APS 50
טמד 8 טמד 5
ביצוע הג'ל המפריד:
1) התחל עם 4.2 מ"ל של ddH2O
2) הוסף 1.6 מ"ל של 40% תמיסת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד
3) מוסיפים 2 מ"ל של 1.5 M Tris pH 8.8 ומערבבים
4) יש לערבב ב-80 מיקרו-ליטר של 10% SDS
5) כאשר הוא מוכן לשימוש, יש להוסיף 8 μL של TEMED ולערבב
6) הוסף 80 מיקרון ליטר של 10% APS* וערבב
הכנת ג'ל הערימה:
1) התחל עם 2.9 מ"ל של ddH2O
2) הוסף 0.75 מ"ל של 40% תמיסת אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד
3) מוסיפים 1.25 מ"ל של 0.5 M Tris pH 6.8 ומערבבים
4) יש לערבב ב-50 מיקרו-ליטר של 10% SDS
5) כאשר הוא מוכן לשימוש, יש להוסיף 5 μL של TEMED ולערבב
6) הוסף 50 מיקרון ליטר של 10% APS* וערבב
SDS = נתרן דודציל סולפט
APS = אמוניום לסולפט
TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-טטרה-מתיל-אתילנדיאמין
*עם הוספת APS, יש לשפוך את התמיסה מיד לתוך מנגנון היציקה מכיוון שהתמיסה מתפלמסת תוך מספר דקות. לפיכך, מומלץ להכין את תמיסות הג'ל המפרידות והערימה כמעט כאשר יש צורך בפתרונות.

טבלה 1: מתכון להכנת תערובת ג'ל פוליאקרילאמיד (הפרדה וערימה של תמיסות ג'ל).

אחוז ג'ל (%) גודל חלבון (kDa)
עד 20 4 עד 40
15 12 עד 45
12.5 10 עד 70
10 15 עד 100
8 50 עד 200
4 עד 6 > 200

טבלה 2: אחוז ג'ל SDS-PAGE מומלץ לגדלים שונים של חלבונים

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות רבות שימשו למדידת הפעילות של SLC12 של CCCs המתבטאים בתאי העצב, כולל KCC2. רבות מהטכניקות הללו הוכיחו את עצמן כמשפרות את הידע המדעי על ניתוח הרלוונטיות התפקודית של מובילים אלה ודפוסי המבנה-תפקוד שלהם במוטציות שונות הקשורות למחלות. באופן קריטי, ישנם יתרונות ואזהרות לשיטות השונות21. עם זאת, הפרוטוקול שהוסבר לעיל, תיאר כיצד להעריך זרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז, Thr906 ו- Thr1007, באמצעות כתם מערבי, אשר יכול להיות מועיל בחקר הפונקציות והפעילויות של KCC2.

הוויסות של KCC2 מתרחש באמצעות זרחון ודה-פוספורילציה בשאריות סרין/תראוניןמפתח 1. כתם מערבי הוא טכניקה יעילה שניתן להשתמש בה כדי לחקור זרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז ב- Thr906 ו- Thr1007. באופן עקרוני, שינויים בזרחון של KCC2 מזוהים באמצעות נוגדנים ספציפיים לפוספו המכוונים נגד פוספו-פפטידים של דגימות אימונובלוט / חלבונים מעניינים. כתם מערבי הוא שיטה המשמשת לזיהוי החלבון הספציפי המעניין מדגימה של רקמה או תא. שיטה זו מפרידה תחילה את החלבונים לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה. לאחר מכן החלבונים מועברים אלקטרופורטית לתמיכה מוצקה (בדרך כלל קרום) לפני שחלבון המטרה מסומן באמצעות נוגדן ספציפי. הנוגדנים מצומדים לתגים שונים או לנוגדנים מצומדים לפלואורופור המזוהים באמצעות שיטות colorimetric, chemiluminescence או פלואורסצנטיות. זה מאפשר לזהות חלבון מטרה ספציפי מתערובת של חלבונים. טכניקה זו שימשה לאפיון אתרים זרחניים של KCC2 2,8 ושימשה לזיהוי מעכבים של KCC2 המהווים אנטגוניזם לזרחון KCC2 Thr906/Thr100715. קווי HEK293 היו בשימוש במספר ניסויים בשל יתרונם בניסויים בביולוגיה מולקולרית. הם מהירים לשחזור, קלים לתחזוקה ויעילים מאוד להעברה ולייצור חלבונים22. עם זאת, דעות מסוימות גורסות כי ייתכן שהוא אינו המועמד המתאים ביותר לביצוע ניסויים נוירוביולוגיים מכיוון שהוא אינו תא שמקורו במוח, ולכן הספציפיות הפיזיולוגית שלו עשויה להיות מוטלת בספק בחקר מדעי המוח. עם זאת, עבודות קודמות הראו כי תוצאות דומות נצפות בביטוי של KCC2 בתאי HEK293 ורקמות / תאים עצביים בפועל15,23. לפיכך, הרלוונטיות של HEK293 במחקר במדעי המוח לא ניתן להשליך על הסף.

במחקרים הכוללים ניתוח של ביטוי חלבונים על ידי טכניקת כתם מערבית, יש לתת תשומת לב ספציפית לבחירת הרכב חיץ התזה, לאופי (סוג וריכוז) של חומר הניקוי לשימוש24, ולמעכבי הפרוטאז. הרכב החיץ חייב להיות מותאם לחלבון המטרה כדי להקל על תהליכי הסילוק והמיצוי שלו, ולאפשר את איתורו הקל על ידי כתםמערבי 25. דטרגנט עדין בריכוז נמוך נדרש בדרך כלל לחלבונים מסיסים, בעוד שחלבוני ממברנה עשויים לדרוש תנאי דטרגנט חזקים יותר. עם זאת, דטרגנטים חזקים עלולים לשבש אינטראקציות וקומפלקסים עלולים ללכת לאיבוד. שני הסוגים והריכוזים של חומרי הניקוי עשויים להשפיע על אופיו ופעילותו של החלבון, ולכן יש צורך להיצמד לטווח ריכוזים מוגבל/נסבל עבור דטרגנטים אלה. תוספת של מעכב פרוטאז תמנע מחלבון המטרה להתפרק על ידי חלבונים אנדוגניים, וטמפרטורת העבודה המומלצת האופטימלית היא 4 מעלות צלזיוס כדי להפחית ביעילות את שיעורי הפרוטאוליטים. לפעמים, בניסיון להשיג אותות אימונובלוט באיכות גבוהה עבור נוגדנים הנותנים אותות אימונובלוט גרועים, מיצוי חיסוני (IP) מתבצע כניסוי במעלה הזרם להכתמה מערבית. טכניקה זו היא יתרון משום שהיא מאפשרת את האינטראקציה בין אנטיגנים לבין הנוגדנים שלהם בהתאמה הטבעית שלהם לפני ההפרדה והכימות הנובעים מהם26. לפיכך, IP עשוי לשפר את איכות הפלטים מהליכי הכתם המערביים. לפני היישום של טכניקת ה- IP, חשוב להעריך את הנוכחות והיעילות של הביטוי של חלבוני השותף co-immunoprecipitated בליזאט על ידי ניתוח כל התא lysate או שברים קלט על ידי כתם מערבי. יתר על כן, יש צורך בידע מוקדם על המשקל המולקולרי של החלבון שיש לחקור לפני הכנת תמיסות הג'ל הרצויות לאלקטרופורזה SDS-PAGE, שכן גודל החלבון משפיע על אפקט הניפוי של מטריצת הג'ל.

עם זאת, זיהוי נוגדנים מצומדים לחלבון בטכניקה זו הוא בעל חשיבות רבה מכיוון שהוא מסייע לשפר את ההבנה של פעילויות שיתופיות באתרי הפוספו של KCC2 אשר עשויות לספק מידע על זרחון הקוטרנספורטר ועל שלמות מסלול האיתות שעשוי לווסת את הקוטרנספורטרים, לחיזוי אמין של פעילות הקוטרנספורטר. עם זאת, חשוב לציין כי טכניקת הכתם המערבי מסוגלת לייצר רק נתונים כמותיים למחצה, מה שאומר שהטכניקה רק מדגישה את ההערכה היחסית של ביטויי חלבונים אך לא כימות מוחלט. זה מוכר לפערים בשיעורי הטעינה וההעברה של המדגם בנתיבים נפרדים, השונים על כתמים בודדים. גם האות שזוהה אינו ליניארי ואינו משקף את טווח הריכוז של דגימות27. חוץ מזה, ייתכן שסטטוס הזרחון אינו גורם אמין לדיווח על פעילות חלבונים, שכן התערבויות כגון מעכבים, מוטציות ואינטראקציות של חלבונים עם סביבתו יכולות להשפיע ישירות על פעילות החלבון מבלי לשנות את רמת הזרחוןשלו 28,29,30. לכן, ייתכן שיהיה מועיל יותר להשתמש בנוגדנים ספציפיים לפוספו כדי להשלים שיטות ביוכימיות אחרות.

כאמור, ישנן שיטות קלאסיות אחרות המשמשות למדידה ישירה של פעילות KCC2. ההערכה של KCC2 באמצעות מדידת שטף רדיואקטיבי 86Rb+ דרך הממברנה של תכשירי תאים הומוגניים היא גישה פופולרית. שיטה זו משתמשת ברדיואיזוטופים פעילים כעוקבים על ידי העברתם דרך תעלות יוניות. בקצרה, התאים המעניינים דוגרים בתמיסות נטולות קטיונים כדי לעכב KCC2 אנדוגני, לאחר מכן דגירה עם מעכבים ספציפיים כגון ouabain, ולאחר מכן עם מדיום ספיגה המכיל את המעכב ו 86Rb+. מוני סינטילציה נוזליים משמשים למדידה/מעקב אחר פעילויות המשך לתזה של תאים. עם זאת, שיטה זו היא חזקה, רגישה מאוד וסלקטיבית ופחות מועדת להפרעות. עם זאת, היישומים שלו אינם מתרחבים לרקמות עם סוגי תאים מרובים כמו תרביות מוח או נוירונים. יתר על כן, טכניקה זו מגבילה שינויים ברזולוציה של ריכוז יונים ברמה התת-תאית. יתר על כן, קיימות בעיות בטיחות בנוגע לרעילות הפוטנציאלית ולסכנה הבריאותית הכרוכה בעבודה עם רדיואיזוטופים קצרים בעלי זמן מחצית חיים (18.65 ימים) המאופיינים בפליטת אנרגיה גבוהה (מקסימום 1.77 MeV; מקסימום 1.08 MeV)31. זה יכול להצביע באופן מסיבי על חוסר התאמה למחקרים בתאים עצביים שבהם נדרש בדרך כלל מספר גבוה של תאים. בעיות אלה מובילות לפיתוח מבחן 85Rb+ efflux הלא רדיואקטיבי על ידי Terstappen 1999, כחלופה לרדיואקטיבי 86Rb+ לקביעת שטפי יונים. הגישה הלא-רדיואקטיבית הגלתה מאוד את מבחני 86Rb+ הרדיואקטיביים לניתוח של K+ ותעלות קטיון לא סלקטיביות בתעשיית התרופות31. בדיקת efflux לא רדיואקטיבית 85Rb+ כוללת שני תהליכים עיקריים, הראשון הוא תרבית תאים ומניפולציה והשני הוא קביעת הרובידיום העוקב על ידי ספקטרוסקופיית קליטה אטומית (AAS). שיטה זו קלה לשימוש, אם כי, היא דורשת מספר ניסויי אימות בדיקה וסובלת מרזולוציה זמנית ירודה32. אף על פי כן, בדיקת efflux לא רדיואקטיבית 85Rb+ הוכיחה בהדרגה כטכניקה אמינה להערכת KCCs ו- NKCCs33.

בדיקת שטף התליום (TI+) משתמשת ב-TI+ כיון פונדקאי עבור K+ בשל זיקתה הגבוהה לאתר K+ ב-KCC2 וב-NKCC2. ניתן לזהות זרימה של TI+ לתאים באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש לתליום, כגון בנזותיאזול קומרין ופלוזין-2. לאחר העברתו על ידי הערוץ, TI+ עשוי לשייך לצבע BTC/fluozin-2 ולגרום לשינוי פלואורסצנטי שניתן לזהותו על ידי קורא לוחות הדמיה פלואורומטרי31. צבעי חיווי TI+ נכנסים לתאים כאסטרים של אצטוקסימתיל אשר לאחר מכן נבקעים על ידי אסטראזות ציטופלסמיות כדי לשחרר את הצורות הפלואורוגניות הפעילות. כדי להפעיל את ה-KCCs, התאים מגורה עם תערובת של K+ ו-Tl+ בנוכחות או בהיעדר תרכובות בדיקה (למשל, מעכבי KCC2). תליום נכנס ונקשר לצבע הפלואורסצנטי. העלייה באות הפלואורסצנטי פרופורציונלית לזרימה של Tl+ לתא באופן ספציפי דרך הקוטרנספורטר, ולכן מייצגת מדידה פונקציונלית של פעילות הקוטרנספורטר. שיטה זו יושמה היטב גם במדידת פעילות KCC2 ו- NKCC2 בסוגים שונים של תרביות תאים, לדוגמה, מחקרים על קו התאים HEK293 המבטאים ביציבות KCC234 אנושי. בקצה דמריט, יש מגוון של מסלולים פוטנציאליים מחוץ למטרה שעלולים להפריע לזרם TI+ , לדוגמה, Na+/K+ ATPase בתאי HEK293 עלול לגרום לשיעור פגיעה גבוה יותר של false positive או false negative35. יתר על כן, כמו במבחני שטף אחרים, יישום גישה כזו בתאי עצב נותר מוגבל בשל הישרדותם הלקויה של תאי עצב לאחר שלבי שטיפה מרובים. הביטוי העצבי של מספר ערוצי K+ וטרנספורטר יכול גם לעכב את ההערכה המדויקת של שטפי K+ ספציפיים ל-KCC2. טכניקה זו מציבה מגבלות לחקר תעלות בתא עצבי קטן כגון דנדריטים וקוצים דנדריטיים, והאקסונים נובעים מהיעדר רזולוציה מרחבית בשילוב עם רזולוציה טמפורלית נמוכה.

טכניקות נוספות כגון טלאי-מהדק-אלקטרופיזיולוגיה משמשות למדידת פעילות GABA; לפיכך, משקף בעקיפין KCC2 מופעל ו / או מומת כפי שנודע על ידי הערכה של הומאוסטזיס יון כלוריד תוך תאי. באופן כללי, מדידות אלקטרופיזיולוגיות של פונקציית SLC12 מסתמכות על העיקרון שקולטני GABA A (GABAAR) חדירים לכלוריד36. KCC2 הוא המפתח לאפנון של עיכוב GABAergic. במיוחד, פעילות ההבלטה [Cl-]i של KCC2 עומדת בבסיס ההיפר-פולריזציה של GABAAR6. הקלטות תוך-תאיות מספקות תובנות מכריעות באמצעות אקסטרפולציה של יכולת הבלטה של כלוריד של KCC2 מההיפוך בפוטנציאל של זרמים מתווכים GABAAR (E GABA). E GABA היפרפולרי מציין נמוך יותר [Cl-]i ולכן עלייה בפעילות של KCC2. טכניקת מהדק טלאי גראמידין באלקטרופיזיולוגיה היא גישה סטנדרטית למדידת פעילות GABA. כמה מחקרים שפורסמו בעבר השתמשו בהקלטת מהדק טלאי גרמיקדין כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של KCC2 כדי להעריך / לפקח על [Cl-] i הומאוסטזיס אכן הוכיחו הצלחה 8,9,37,38,39,40 . במהלך הקלטה של מהדק טלאי גרמידין, נוצר אטימה הדוקה על פני התא/רקמה באמצעות אלקטרודת זכוכית עם טלאי יחסי כדי לתעד את הפעילות התוך-תאית של תעלות יונים בהתייחס לאלקטרודה אחרת באמבטיה המקיפה את התא/רקמה. טכניקה זו יכולה להתבצע על ידי מדידת כמות הזרם החוצה את קרום התא במתח קבוע במצב מהדק מתח או על ידי רישום כמות המתח הנעה על פני הממברנה בזרם קבוע במצב מהדק זרם36. ניתן ליישם מספר וריאציות של הטכניקה הבסיסית אשר תלויות במידה רבה בשאלת המחקר. הטכניקה אינה יוצרת רישום גדול יחסית של טלאי תאים שלמים דמויי נקבוביות, אלא את האנטיביוטיקה יוצרת הנקבוביות (גרמיצ'ידין) הכלולה בתמיסת האלקטרודה המשמשת ליצירת נקבוביות קטנות בממברנה36. במיוחד, תוספת של gramicidin יוצר נקבוביות סלקטיביות קטיון בממברנה, אשר מפגינים חדירות אניון לא משמעותית. פרוטוקולי רמפת מתח הם חלופה יעילה ואמינה להקלטת הזרם במתח קבוע. נראה כי יחסי הזרם/מתח המתקבלים עם פרוטוקולי רמפת מתח נותנים רישום טוב יותר של זרמי ממברנה בתיווך GABAAR. בפרוטוקול זה מופעל מתח משתנה ללא הרף אך מנוטר (בקצב קבוע) והזרם נמדד כל הזמן בו זמנית36,41. במהלך פרוטוקול זה, היישום של פולסים מתח (בדרך כלל בכיוון hyperpolarizing) משמש להפעלת זרם הדליפה כתוצאה מתגובות אוהמיות. בדרך כלל, זרמי הממברנה בתיווך GABAAR מחושבים מזרם הדליפה (כלומר, פוטנציאל ההיפוך של זרמי האגוניסט המופחתים בדליפה)36. שיוכי מתח הזרם המתקבלים מפרוטוקול זה מסייעים לספק הבנה טובה יותר של המקום שבו השינויים מתרחשים בריכוזי יונים במהלך תרחיש ניסיוני הכולל תעלות קולטן GABAA. Yelhekar et al.41 השתמשו במודל חישובי כדי להראות כי מסקנות על ריכוזי יונים יציבים משיטת האינטרפולציה עשויות שלא להיות מוצדקות מכיוון שפוטנציאל ההיפוך המשוער מהשיטה עשוי להיות שגוי.

ההתנגדות הממוצעת המשמשת ברוב ההקלטות היא 5 MΩ. פיפטות עם התנגדות נמוכה יותר של 3-4 MΩ עלולות לגרום להתנגדות סדרתית נמוכה יותר העדיפה להקלטות מהדק מתח. עם זאת, קצה הפיפטה יהיה רחב יותר באופן דומה עבור פיפטות עמידות גבוהות יותר, וכתוצאה מכך, הוא מהווה אתגר בדמות קושי ביצירת אטמים ויציבות36,42. לפיכך, יש צורך לפקח על היווצרות GΩ כדי לקבל הקלטות עם ירידה ניכרת ברמת הנתונים הרועשים שנוצרו. החוסן של טכניקה זו כדי לחקור את הפונקציה והפעילויות של KCC2 כפי שנקבע על ידי התאמתו ואמינותו במדידת פעילות GABA אושרה על ידי מספר מחקרים. מחקרים קודמים הראו כי [Cl-] i נשאר יציב באמצעות טכניקה זו על ידי מדידת התגובות של GABAARs (אשר מסוגלים לשער מוליכות כלוריד) לאגוניסטים שלהם. במשתמע, גישה חשמלית רציפה מגיעה עם שינוי מועט, אם בכלל, של ריכוז הכלוריד התוך-תאי43,44. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת עקיפה של שינויים מלאכותיים בפוטנציאל הממברנה וב- EGABA במהלך הפעלתGABA AR (הפותחת מוליכות כלוריד וביקרבונט)45. הנ"ל מספק לטכניקה זו יתרון לפני סוגים אחרים של הקלטות אלקטרופיזיולוגיה. עם זאת, המגבלות של טכניקה זו כוללות את הדברים הבאים: (1) רעשי הקלטה תכופים עלולים להתרחש עקב קצה האלקטרודה התופסת חלק מהממברנה אשר עלול להפחית את הרזולוציה הנוכחית, ו-(2) ניקוב הממברנה עם גרמיקדין בדרך כלל לוקח זמן רב יחסית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי החברה המלכותית בבריטניה (מענק מס' IEC\NSFC\201094), ומלגת דוקטורט של חבר העמים הבריטי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

Tags

ביוכימיה גיליון 190
חקר הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2 באמצעות כתם מערבי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F.,… More

Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter