Summary
Il presente protocollo evidenzia l'applicazione della tecnica western blotting per studiare le funzioni e le attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2. Il protocollo descrive lo studio della fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi Thr906/1007 tramite western blotting. Inoltre, ulteriori metodi per confermare l'attività di KCC2 sono brevemente evidenziati in questo testo.
Abstract
I cotrasportatori di cloruro di potassio 2 (KCC2) sono un membro della famiglia dei trasportatori di soluti 12 (SLC12) dei cotrasportatori catione-cloruro (CCC), che si trovano esclusivamente nel neurone ed è essenziale per il corretto funzionamento dell'omeostasi della Cl- e di conseguenza l'inibizione funzionale GABAergica. Il fallimento nella corretta regolazione di KCC2 è deleterio ed è stato associato alla prevalenza di diverse malattie neurologiche, tra cui l'epilessia. Sono stati compiuti notevoli progressi per quanto riguarda la comprensione dei meccanismi coinvolti nella regolamentazione del KCC2, accreditato allo sviluppo di tecniche che consentano ai ricercatori di studiarne le funzioni e le attività; tramite indagini dirette (valutazione della fosforilazione dei siti regolatori delle chinasi) o indirette (osservazione e monitoraggio dell'attività GABA). Qui, il protocollo evidenzia come studiare la fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi - Thr906 e Thr1007 - utilizzando la tecnica del western blotting. Esistono altri metodi classici utilizzati per misurare direttamente l'attività di KCC2, come lo ione rubidio e il saggio di assorbimento degli ioni tallio. Ulteriori tecniche come patch-clamp-elettrofisiologia sono utilizzate per misurare l'attività GABA; quindi, riflettendo indirettamente KCC2 attivato e/o inattivato come informato dalla valutazione dell'omeostasi intracellulare degli ioni cloruro. Alcune di queste tecniche aggiuntive saranno brevemente discusse in questo manoscritto.
Introduction
I cotrasportatori di cloruro di potassio 2 (KCC2) sono un membro della famiglia dei trasportatori di soluti 12 (SLC12) dei cotrasportatori catione-cloruro-cloruro (CCC), che si trovano esclusivamente nel neurone ed è essenziale per il corretto funzionamento dell'omeostasi della Cl- e di conseguenza l'inibizione funzionale GABAergica 1,2,3,4. Il mantenimento di una bassa concentrazione intraneuronale di Cl- ([Cl-]i) a 4-6 mM da parte di KCC2 facilita l'iperpolarizzazione dell'acido γ-aminobutirrico (GABA)/glicina e l'inibizione sinaptica nel cervello e nel midollo spinale5. Il fallimento nella corretta regolazione di KCC2 è stato associato alla prevalenza di diverse malattie neurologiche, tra cui l'epilessia4. Inoltre, la diminuzione dell'estrusione di Cl− mediata da KCC2 e le alterate correnti iperpolarizzanti GABAA e/o mediate dal recettore della glicina sono state implicate nell'epilessia, nel dolore neuropatico e nella spasticità 6,7. Il KCC2 neuronale è modulato negativamente attraverso la fosforilazione di residui regolatori chiave all'interno del suo dominio intracellulare C-terminaledal complesso di segnalazione della chinasi 1 senza lisina (WNK)-STE20/SPS1 correlato alla prolina/alanina (SPAK)/Oxidative stress-responsive (OSR), che facilita il mantenimento dell'attività depolarizzata del GABA nei neuroni immaturi 2,8,9 . Il WNK-SPAK/OSR1 fosforila i residui di treonina 906 e 1007 (Thr906/Thr1007) e successivamente sottoregola l'espressione genica dell'mRNA di KCC2, portando ad un conseguente deterioramento della sua funzione fisiologica 8,10. Ancora più importante, tuttavia, è già un dato di fatto che il complesso chinasico WNK-SPAK/OSR1 è noto per fosforilare e inibire l'espressione di KCC2 1,2,4,11,12, e che l'inibizione delle vie di segnalazione del complesso chinasico al fosforilato Thr906/Thr1007 è stata collegata con l'aumentata espressione del gene mRNA KCC2 13,14,15 . È importante notare che la regolazione dell'espressione neuronale dei cotrasportatori KCC2 e Na+-K+-2Cl- 1 (NKCC1) attraverso la fosforilazione proteica funziona in concomitanza e in pattern inversi 1,4,16.
Sono stati compiuti progressi consistenti e considerevoli per quanto riguarda la comprensione dei meccanismi coinvolti nella regolazione del KCC2, accreditato allo sviluppo di tecniche che consentano ai ricercatori di studiarne le funzioni e le attività; tramite indagini dirette (valutazione della fosforilazione dei siti regolatori delle chinasi) o indirette (osservazione e monitoraggio dell'attività GABA). Il protocollo qui presentato evidenzia l'applicazione di tecniche di western blotting per studiare le funzioni e le attività del co-trasportatore neuronale K+-Cl- KCC2 studiando la fosforilazione del cotrasportatore nei siti regolatori delle chinasi Thr906/1007.
Western blot è un metodo utilizzato per rilevare specifiche proteine di interesse da un campione di tessuto o cellula. Questo metodo separa prima le proteine per dimensione attraverso l'elettroforesi. Le proteine vengono quindi trasferite elettroforeticamente su un supporto solido (di solito una membrana) prima che la proteina bersaglio venga marcata utilizzando un anticorpo specifico. Gli anticorpi sono coniugati a diversi tag o anticorpi coniugati con fluorofori che vengono rilevati utilizzando metodi colorimetrici, chemiluminescenza o fluorescenza. Ciò consente di rilevare una specifica proteina bersaglio da una miscela di proteine. Questa tecnica è stata utilizzata per caratterizzare i siti fosfospecifici di KCCs1 ed è stata utilizzata per identificare inibitori delle chinasi che inibiscono la fosforilazione di KCC3 Thr991/Thr104817. Seguendo questo protocollo, si può rilevare specificamente KCC2 totale e fosforilato da lisati cellulari/tissutali. In linea di principio, la rilevazione di anticorpi coniugati con proteine mediante questa tecnica è altamente strumentale in quanto aiuta a migliorare la comprensione delle attività cooperative nei fosfo-siti di KCC2, che fa luce sui meccanismi molecolari coinvolti nelle loro regolazioni fisiologiche. L'analisi quantitativa dell'espressione proteica totale è rappresentativa della funzione e dell'attività di KCC2. Esistono altri metodi classici utilizzati per misurare direttamente l'attività di KCC2, come lo ione rubidio e il saggio di assorbimento degli ioni tallio. Ulteriori tecniche come patch-clamp-elettrofisiologia sono utilizzate per misurare l'attività GABA; quindi, riflettendo indirettamente KCC2 attivato e/o inattivato come informato dalla valutazione dell'omeostasi intracellulare degli ioni cloruro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Il protocollo descrive il metodo western blotting per rilevare specifiche proteine di interesse.
1. Coltura cellulare e trasfezione
- Riscaldare tutti i reagenti nel bagno di perline (37 °C) prima della procedura di coltura cellulare. Preparare terreno di coltura, Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero bovino fetale, l'1% ciascuno di 2mM L-glutammina, 100x aminoacido non essenziale, 100 mM di piruvato di sodio e 100 unità / mL di penicillina-streptomicina.
- Scongelare completamente le cellule KCC2b del rene embrionale umano KCC2b (HEK293rnKCC2b)18 nel bagno di perline (37 °C). Trasferire le cellule dal tubo crioviale in una provetta da centrifuga contenente 5 ml di materiale fresco. Ruotare la cella a 1200 ×g per 3-5 minuti.
- Utilizzare una pipetta aspiratore (fissata a una pompa per vuoto) per aspirare il surnatante e aggiungere 10 ml di fluido fresco per risospendere le cellule. Trasferire la sospensione cellulare su un piatto piatto da 10 cm.
- Mettere il piatto nell'incubatore e lasciarlo crescere per 48 ore a 37 °С in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 . Monitorare il periodo di incubazione per garantire una crescita cellulare sana. Dividere ulteriormente le cellule quando hanno raggiunto oltre il 90% di confluenza dopo il periodo di incubazione.
- Aspirare il vecchio mezzo dalla capsula delle cellule e sciacquare delicatamente le cellule con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS). Aggiungere 2 ml di tripsina e incubare per circa 1-2 minuti a temperatura ambiente.
- Utilizzare 2 ml di supporto completo per lavare delicatamente le cellule tripsinizzate nel piatto. Aggiungere 9 ml di supporti freschi ai nuovi piatti e aggiungere 1 mL di soluzione dal vecchio piatto a ciascuno di quelli nuovi. Trasferire nuovamente i piatti a cellule divise nell'incubatore per 48 ore per raggiungere ≥ confluenza del 90%.
- Trattare le cellule con dimetilsolfossido (DMSO) come controllo, 8 μM di staurosporina o 0,5 mM di N-etilmaleimmide (NEM) per 15 minuti prima di raccogliere le cellule nel tampone di lisi.
2. Preparazione di lisati cellulari e carico di campioni
- Aspirare il supporto sul piatto di coltura (dalle procedure di trasfezione). Posizionare la coltura cellulare su ghiaccio e lavare le cellule con PBS ghiacciato.
- Aspirare il PBS, quindi aggiungere 1,0 mL di tampone di lisi ghiacciato contenente 50 mM di tris-HCl (pH 7,5), 1 mM di glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N′,N′-tetraacetico (EGTA), 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 50 mM di fluoruro di sodio, 5 mM di pirofosfato di sodio, 10 mM di sodio-β-glicerofosfato, 1 mM di ortovanadato di sodio, 1% (p/v) Triton X-100, 0,27 M di saccarosio, 1 mM di benzamina, 0,1% (v/v) di 2-mercaptoetanolo e 2 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) al piatto.
NOTA: Il volume del tampone di lisi durante la raccolta cellulare varia a seconda delle dimensioni del piatto, ad esempio, 1 ml di tampone di lisi è adatto per 1 x 107 celle / piatto da 100 mm / 150 cm 2 pallone, mentre 0,5 ml è adatto per 5 x 106 celle / piatto da 60 mm / 75 cm2 pallone. - Utilizzare un raschietto a celle di plastica fredda per raschiare le cellule dal fondo del piatto, quindi utilizzare delicatamente una pipetta per trasferire la sospensione cellulare in un tubo di micro-centrifuga già sul ghiaccio. Agitare costantemente il tubo per 30 minuti a 4 °C.
- Far girare i lisati cellulari in una centrifuga fredda (4 °C) a 16.000 x g per 20 minuti, rimuovere delicatamente il tubo dalla centrifuga e metterlo su ghiaccio. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco pre-raffreddato e scartare il pellet.
NOTA: Potrebbe essere necessario variare la forza di centrifugazione e il tempo a seconda del tipo di cella. Tuttavia, le linee guida generali incoraggiano la centrifugazione a 16.000 x g per 20 minuti. Tuttavia, questo deve essere determinato per ogni esperimento. Ad esempio, le cellule delicate come i leucociti hanno bisogno di una velocità di centrifugazione molto leggera.
3. Preparazione di immunoprecipitanti da lisati cellulari
- Pipettare 300 μL di proteina-G-sepharose in una provetta da microcentrifuga. Ruotare la soluzione a 500 x g per 2 minuti ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 500 μL di PBS e vortice bene la soluzione. Ruotare la soluzione a 500 x g per 2 minuti ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio.
- Mescolare 1 mg di anticorpi anti-KCC2 Thr906 e anti-KCC2 Thr1007 con 200 μL di perle di proteina G-sepharose e portare il volume a 500 μL con PBS. Agitare su una piattaforma vibrante o ruota rotante per 2 ore a 4 °C. Lavare 2x con PBS.
- Effettuare la quantificazione proteica sui lisati cellulari interi e aggiungere 1 mg di lisato cellulare alle perle lavate. Incubare delicatamente in un rotatore end-to-end per 2 ore a 4 °C. Girare le perle e lavarle 3 volte con PBS contenente 150 mM di cloruro di sodio (NaCl).
- Lavare gli immunoprecipitanti (perline) 3x con 200 μL di PBS. Risospendere il pellet finale in 100 μL di tampone campione 1x litio dodecilsolfato (LDS).
- Agitare i tubi in uno shaker a rotore a temperatura ambiente per 5 minuti e incubarli in un blocco riscaldante a 75 °C per 10 minuti. Centrifugare il campione di carico a 11.000 x g per 2 minuti e utilizzare il surnatante per il caricamento del gel.
4. Esecuzione della macchia occidentale
- Montare l'apparecchio di colata e versare il gel separatore all'8% preparato al momento (vedere Tabella 1 per la ricetta/preparazione) per gettare il gel lasciando circa 2 cm di spazio dalla parte superiore del vetro di colata. Aggiungere 200 μL di isopropanolo assoluto alla configurazione e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 60 minuti.
NOTA: La ricetta del gel di poliacrilammide per l'elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) dipende dalla dimensione della proteina di interesse (Tabella 2). Quindi, prendere nota della dimensione della proteina prima di determinare la percentuale di gel desiderata. - Utilizzare una pipetta per rimuovere l'isopropanolo e sciacquare accuratamente il gel con circa 200 μL di acqua distillata. Aggiungere il gel impilabile al 6% appena preparato (vedere Tabella 1 per la ricetta/preparazione) per riempire lo spazio di circa 2 cm sulla configurazione del getto. Inserire delicatamente nel pettine e lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Fissare il gel fuso nel serbatoio dell'elettroforesi.
- Sciogliere 30,3 g di Tris base, 144,1 g di glicina e 10 g di SDS in 1000 ml di acqua distillata per preparare 10x tampone di trasferimento. Preparare 1x tampone di funzionamento aggiungendo 10 ml di SDS al 10% e 100 ml di tampone di trasferimento 10x a 890 ml di acqua distillata.
- Versare 1x buffer di corsa nel serbatoio. Caricare 5 μL di marcatore di peso molecolare nel primo pozzetto e una quantità uguale di proteine in ciascun pozzetto del gel SDS-PAGE (tra 18-30 μL, a seconda della dimensione del pettine utilizzato). Riempire i pozzetti vuoti con 1x LDS e far funzionare il gel per circa 90-120 minuti a 120 V.
- Sciogliere 58,2 g di Tris base e 29,3 g di glicina in 1000 ml di acqua distillata per preparare 10x tampone di trasferimento. Attivare la membrana nitrocellulosa con 1x tampone di trasferimento contenente il 20% di metanolo. Risciacquare il gel e la membrana con il tampone di trasferimento e distribuirli delicatamente sulla pila di preparazione.
NOTA: Non è necessario regolare il pH dei tamponi di corsa e di trasferimento in quanto dovrebbero essere al pH ottimale richiesto. Inoltre, è consigliabile preparare questi tamponi e conservarli a temperatura ambiente prima dell'esperimento per risparmiare tempo. - Disporre il sandwich da trasferire in questo ordine: elettrodo negativo (cornice nera/fine) - schiuma sandwich - carta da filtro - gel SDS-PAGE risciacquato - membrana nitrocellulosa risciacquata - carta da filtro - schiuma sandwich - elettrodo positivo (cornice rossa). Impilare il sandwich assemblato nel serbatoio di trasferimento e funzionare a 90 V per 90 minuti o 30 V per 360 minuti.
5. Colorazione anticorpale e sviluppo dell'immagine
- Rimuovere la membrana e lasciarla asciugare. Bloccare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un tampone bloccante a base di latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata Tris contenente lo 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
- Incubare le membrane con opportune diluizioni dell'anticorpo primario 8,15,19 e della beta-actina (controllo del carico) in tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Lavare la membrana in tre lavaggi da 1x TBS-T per 5 minuti ciascuno.
NOTA: L'incubazione della membrana separata con controlli di carico come gli anticorpi beta-actina, alfa-tubulina o gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi serve a normalizzare gli altri risultati di western blotting durante la successiva quantificazione. La diluizione raccomandata per ciascun anticorpo primario è disponibile nel manuale del produttore. - Incubare la membrana lavata con anticorpo secondario diluito 5000 volte in tampone bloccante per 60 minuti a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare la membrana 3x in 1x TBS-T per 5 minuti ciascuno.
NOTA: Si raccomanda vivamente che l'anticorpo secondario sia generato contro la specie in cui viene allevato l'anticorpo primario. Ad esempio, se l'anticorpo primario del KCC2 totale è l'anti-KCC2 del topo, è necessario utilizzare l'anticorpo secondario per l'antitopo. - Posizionare la membrana lavata sulla scheda di imaging. Mescolare volumi uguali di ciascun reagente a chemiluminescenza potenziata (ECL) e distribuire delicatamente la soluzione miscelata sulla membrana per sviluppare segnali.
6. Acquisizione di immagini mediante un sistema di imaging e quantificazione dei dati
- Trasferire la scheda di imaging nello scomparto appropriato del sistema di imaging per l'imaging. Aprire il software di imaging sul computer per l'elaborazione delle immagini.
- Sulla barra degli strumenti, fare clic su Nuovo protocollo e scegliere Canale singolo. Fare clic su Seleziona nella finestra di dialogo di imaging/applicazione gel, scorrere fino a Traccia e selezionare Chemi Hi Sensitivity o Chemi Hi Resolution. Quindi fare clic su Signal Accumulation Setup per impostare la durata e il numero di immagini da acquisire.
- Fare clic su Position Gel in Impostazione protocollo e regolare il gel nel sistema di imaging, se necessario. Fare clic su Esegui protocollo per acquisire le immagini.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse su una delle immagini acquisite nella casella del catalogo immagini per salvare le immagini sul computer. Passare all'immagine desiderata e fare clic su Seleziona immagine e Continua nella finestra di dialogo Esegui.
- Fare clic sull'icona Trasformazione immagine per regolare il contrasto e la saturazione di pixel dell'immagine . Fare clic sull'icona Screenshot sulla barra degli strumenti generale per salvare l'immagine sul computer a seconda del formato di immagine desiderato.
- Misurare le densità di banda utilizzando il software ImageJ e analizzarle utilizzando opportuni strumenti statistici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Qui, il risultato rappresentativo presentato in Figura 1 ha studiato l'impatto di staurosporina e NEM sulla fosforilazione mediata da WNK-SPAK/OSR1 di KCC2 e NKCC1 in linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente KCC2b (HEKrnKCC2b)18 utilizzando la tecnica western blotting. Dettagli completi sui risultati rappresentativi sono discussi in Zhang et al.15. Simile al NEM, la staurosporina è un ampio inibitore della chinasi che può migliorare l'attività di trasporto di KCC2 e inibire l'attività di NKCC115,20. Il trattamento delle cellule HEK293 con staurosporina e NEM ha causato una diminuzione della fosforilazione nei siti bersaglio SPAK - Thr233 situato nel dominio della chinasi T-loop e nel sito di fosforilazione S-loop Ser373 di hsSPAK. Pertanto, entrambi i composti hanno ridotto i livelli di fosforilazione dei suddetti siti fosfo-SPAK. Inoltre, la staurosporina ha ridotto la fosforilazione di Ser940 in HEKrnKCC2b, ma NEM ha aumentato significativamente la sua fosforilazione. Inoltre, la staurosporina diminuisce la fosforilazione nel sito Thr505, mentre NEM ha causato un leggero, ma insignificante aumento della fosforilazione nello stesso sito. Gli effetti differenziali di entrambi i composti sulla fosforilazione della protein chinasi C (PKC) nel sito Thr505 e KCC2b nel sito Ser940 sono ben correlati. Il risultato rappresentativo ha anche mostrato che entrambi gli agenti hanno alterato l'espressione di rnKCC2b totale, hsNKCC1 o hsSPAK. Il NEM (ma non il trattamento con staurosporina) ha causato un aumento significativo dell'espressione della quantità totale di KCC2, mentre l'espressione di NKCC1 totale e SPAK non è stata modificata in modo significativo quando trattati con entrambi i composti. Inoltre, i due composti hanno causato una diminuzione della fosforilazione di SPAK nei siti Thr233 e Ser373, e questo è correlato con la fosforilazione abbreviata dei siti Thr906/Thr1007 e Thr203/207/212 rispettivamente in rnKCC2b e hsNKCC1. Inoltre, staurosporina e NEM hanno ridotto e aumentato la fosforilazione di PKC nel sito Ser940 in rnKCC2b, rispettivamente, che è correlata con la riduzione e l'incremento della fosforilazione di PKC-δ nel sito Thr505 dopo il trattamento con staurosporina e NEM, rispettivamente (Figura 1).
Figura 1: Analisi quantitative dei siti fosfo-di rn KCC2b e hsNKCC1 dopo trattamento con staurosporina e NEM in cellule HEK rn KCC2b. (A) Le cellule HEK rnKCC2b stabilmente trasfettate sono state trattate con DMSO (controllo), staurosporina da 8 μM o 0,5 mM NEM per 15 minuti. I lisati cellulari sono stati raccolti e sottoposti a immunoprecipitazione (IP) e immunoblot (IB) con anticorpi indicati. Abbreviazioni: D = KCC2 dimerico; M = KCC2 monomerico. (B) Quantificazione immunoblot di cellule KCC2b HEKrn stabilmente trasfettate. Le intensità di banda sono state quantificate con il software ImageJ. p < 0,001; **p < 0,01; Test di Wilcoxon-Mann Whitney (n = 6). Questa cifra è stata modificata da Zhang et al.15. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| 8 ml di gel separatore all'8% | 5 ml di Gel impilante al 6% | ||
| Materiali necessari | Volume (μL) | Materiali necessari | Volume (μL) |
| Distillato H2O | 4200 | Distillato H2O | 2900 |
| 40% Acrilammide | 1600 | 40% Acrilammide | 750 |
| 1,5 M Tris pH 8,8 | 2000 | 0,5 M Tris pH 6,8 | 1250 |
| 10% SDS | 80 | 10% SDS | 50 |
| 10% APS | 80 | 10% APS | 50 |
| TEMED | 8 | TEMED | 5 |
| Fare il gel separatore: | |
| 1) | Inizia con 4,2 ml di ddH2O |
| 2) | Aggiungere 1,6 ml di soluzione di acrilammide/bis-acrilammide al 40% |
| 3) | Aggiungere 2 ml di 1,5 M Tris pH 8,8 e mescolare |
| 4) | Miscelazione in 80 μL di SDS al 10% |
| 5) | Quando è pronto per l'uso, aggiungere 8 μL di TEMED e mescolare |
| 6) | Aggiungere 80 μL di APS* al 10% e miscelare |
| Fare il gel impilabile: | |
| 1) | Iniziare con 2,9 ml di ddH2O |
| 2) | Aggiungere 0,75 mL di soluzione di acrilammide/bis-acrilammide al 40% |
| 3) | Aggiungere 1,25 ml di 0,5 M Tris pH 6,8 e mescolare |
| 4) | Miscelare in 50 μL di SDS al 10% |
| 5) | Quando è pronto per l'uso, aggiungere 5 μL di TEMED e mescolare |
| 6) | Aggiungere 50 μL di APS al 10%* e miscelare |
| SDS = sodio dodecilsolfato | |
| APS = ammonio per solfato | |
| TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-tetrametiletilendiammina | |
| *Dopo l'aggiunta di APS, la soluzione deve essere immediatamente versata nell'apparecchio di colata perché la soluzione polimerizza in pochi minuti. Quindi, è consigliabile preparare le soluzioni di gel di separazione e impilamento proprio quando le soluzioni sono necessarie. | |
Tabella 1: Ricetta per preparare la miscela di gel di poliacrilammide (soluzioni di gel di separazione e impilamento).
| Percentuale di gel (%) | Dimensione delle proteine (kDa) |
| Fino a 20 | 4 a 40 |
| 15 | Da 12 a 45 anni |
| 12.5 | Da 10 a 70 |
| 10 | Da 15 a 100 |
| 8 | Da 50 a 200 |
| 4 a 6 | > 200 |
Tabella 2: Percentuale di gel SDS-PAGE consigliata per proteine di diverse dimensioni
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Molti metodi sono stati utilizzati per misurare le attività di SLC12 delle CCC che sono espresse nei neuroni, tra cui KCC2. Molte di queste tecniche hanno dimostrato di migliorare le conoscenze scientifiche sull'analisi della rilevanza funzionale di questi trasportatori e dei loro modelli struttura-funzione in diverse mutazioni correlate alla malattia. Criticamente, ci sono vantaggi e avvertimenti per i vari metodi21. Tuttavia, il protocollo spiegato sopra, ha delineato come valutare la fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi, Thr906 e Thr1007, utilizzando western blot, che può essere utile nello studio delle funzioni e delle attività di KCC2.
La regolazione di KCC2 avviene attraverso la fosforilazione e la defosforilazione a livelli chiave residui di serina/treonina1. Il Western blotting è una tecnica efficiente che può essere utilizzata per studiare la fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi a Thr906 e Thr1007. In linea di principio, i cambiamenti nella fosforilazione di KCC2 sono rilevati utilizzando anticorpi fosfo-specifici diretti contro i fosfo-peptidi dei campioni immunoblot / proteine di interesse. Western blot è un metodo utilizzato per rilevare la proteina specifica di interesse da un campione di tessuto o cellula. Questo metodo separa prima le proteine per dimensione attraverso l'elettroforesi. Le proteine vengono quindi trasferite elettroforeticamente su un supporto solido (di solito una membrana) prima che la proteina bersaglio venga marcata utilizzando un anticorpo specifico. Gli anticorpi sono coniugati a diversi tag o anticorpi coniugati con fluorofori che vengono rilevati utilizzando metodi colorimetrici, chemiluminescenza o fluorescenza. Ciò consente di rilevare una specifica proteina bersaglio da una miscela di proteine. Questa tecnica è stata utilizzata per caratterizzare i siti fosfospecifici di KCC2 2,8 ed è stata utilizzata per identificare inibitori di KCC2 che antagonizzano la fosforilazione15 di KCC2 Thr906/Thr1007. Le linee HEK293 sono state utilizzate per diversi esperimenti a causa del loro vantaggio negli esperimenti di biologia molecolare. Sono veloci da riprodurre, facili da mantenere e altamente efficienti per la trasfezione e la produzione di proteine22. Tuttavia, alcune opinioni sostengono che potrebbe non essere il candidato più adatto per condurre esperimenti di neurobiologia perché non è una cellula proveniente dal cervello, e quindi la sua specificità fisiologica può essere discutibile nella ricerca neuroscientifica. Tuttavia, lavori precedenti hanno dimostrato che risultati simili sono stati osservati nell'espressione di KCC2 nelle cellule HEK293 e nei tessuti/cellule neuronali reali 15,23. Quindi, la rilevanza di HEK293 nella ricerca neuroscientifica non può essere scartata a titolo definitivo.
Negli studi che comportano l'analisi dell'espressione proteica mediante la tecnica del western blotting, si deve prestare particolare attenzione alla scelta della composizione del tampone di lisi, alla natura (tipo e concentrazione) del detergente da utilizzare24 e agli inibitori della proteasi. La composizione del tampone deve essere ottimizzata per adattarsi alla proteina bersaglio per facilitare i suoi processi di solubilizzazione ed estrazione e per consentire la sua facile rilevazione da parte del western blot25. Il detergente delicato a bassa concentrazione è solitamente richiesto per le proteine solubili, mentre le proteine di membrana possono richiedere condizioni detergenti più forti. Tuttavia, detergenti forti possono interrompere le interazioni e i complessi possono andare persi. Entrambi i tipi e le concentrazioni dei detergenti possono influenzare la natura e l'attività della proteina, quindi è necessario attenersi a una gamma limitata / tollerata di concentrazioni per questi detergenti. L'aggiunta di inibitori della proteasi eviterà che la proteina bersaglio venga degradata dalle proteine endogene e la temperatura di lavoro ottimale raccomandata è di 4 °C per ridurre efficacemente i tassi proteolitici. A volte, nel tentativo di ottenere segnali immunoblot di alta qualità per gli anticorpi che danno scarsi segnali immunoblot, l'immunoprecipitazione (IP) viene effettuata come esperimento a monte per il western blotting. Questa tecnica è vantaggiosa perché facilita l'interazione tra gli antigeni e i loro rispettivi anticorpi nella loro conformazione nativa che precede la loro conseguente separazione e quantificazione26. Pertanto, la PI può migliorare la qualità dei risultati delle procedure di blotting occidentali. Prima dell'applicazione della tecnica IP, è importante valutare la presenza e l'efficienza di espressione delle proteine partner co-immunoprecipitate nel lisato analizzando l'intero lisato cellulare o le frazioni di input mediante western blotting. Inoltre, è necessaria una conoscenza preliminare del peso molecolare della proteina da studiare prima di preparare la percentuale desiderata di soluzioni di gel per l'elettroforesi SDS-PAGE, poiché la dimensione della proteina influisce sull'effetto setacciante della matrice gel.
Tuttavia, la rilevazione di anticorpi coniugati con proteine mediante questa tecnica è altamente strumentale in quanto aiuta a migliorare la comprensione delle attività cooperative nei siti fosfo-di KCC2 che possono fornire informazioni sulla fosforilazione del cotrasportatore e sull'integrità della via di segnalazione che può regolare i cotrasportatori, per una previsione affidabile dell'attività del cotrasportatore. Tuttavia, è importante notare che la tecnica western blot è in grado di produrre solo dati semi-quantitativi, il che significa che la tecnica evidenzia solo la valutazione relativa delle espressioni proteiche ma non la quantificazione assoluta. Ciò è accreditato alle discrepanze nei tassi di carico e trasferimento del campione in corsie separate, che sono diverse sui singoli blots. Anche il segnale rilevato generato non è lineare e non riflette l'intervallo di concentrazione dei campioni27. Inoltre, lo stato di fosforilazione potrebbe non essere un fattore affidabile per la segnalazione dell'attività proteica in quanto interventi come inibitori, mutazioni e interazioni proteiche con il suo ambiente possono influenzare direttamente l'attività proteica senza modificare il suo livello di fosforilazione28,29,30. Pertanto, può essere più vantaggioso utilizzare anticorpi fosfo-specifici per integrare altri metodi biochimici.
Come accennato in precedenza, ci sono altri metodi classici utilizzati per misurare direttamente l'attività KCC2. La valutazione di KCC2 attraverso la misurazione del flusso radioattivo di 86Rb+ attraverso la membrana di preparati cellulari omogenei è un approccio popolare. Questo metodo utilizza radioisotopi attivi come traccianti facendoli passare attraverso canali ionici. In breve, le cellule di interesse vengono incubate in soluzioni prive di cationi per inibire KCC2 endogeno, seguite da incubazione con inibitori specifici come ouabain, e quindi con mezzo di assorbimento contenente l'inibitore e 86Rb+. I contatori di scintillazione liquida sono utilizzati per misurare/tracciare le attività successive alla lisi cellulare. Tuttavia, questo metodo è robusto, altamente sensibile e selettivo ed è meno soggetto a disturbi. Tuttavia, le sue applicazioni non si estendono ai tessuti con più tipi di cellule come colture cerebrali o neuronali. Inoltre, questa tecnica limita i cambiamenti nella risoluzione della concentrazione di ioni a livello subcellulare. Inoltre, esistono problemi di sicurezza riguardanti la potenziale tossicità e il rischio per la salute derivanti dal lavorare con radioisotopi a breve emivita (18,65 giorni) caratterizzati da elevate emissioni di energia (max 1,77 MeV; max 1,08 MeV)31. Ciò potrebbe suggerire in modo massiccio un'inadeguatezza per gli studi sulle cellule neuronali in cui di solito è richiesto un numero elevato di cellule. Questi problemi hanno portato allo sviluppo del saggio di efflusso non radioattivo 85Rb+ da parte di Terstappen 1999, come alternativa al radioattivo 86Rb+ per la determinazione dei flussi ionici. L'approccio non radioattivo ha notevolmente esiliato i saggi radioattivi 86Rb+ per l'analisi dei canali cationici K+ e non selettivi nell'industria farmaceutica31. Il saggio di efflusso non radioattivo di 85Rb+ comporta due processi principali, il primo è la coltura cellulare e la manipolazione e il secondo è la determinazione del rubidio tracciante mediante spettroscopia di assorbimento atomico (AAS). Questo metodo è facile da usare, tuttavia, richiede una serie di esperimenti di convalida del saggio e soffre di scarsa risoluzione temporale32. Tuttavia, il saggio di efflusso non radioattivo di 85Rb+ si è progressivamente dimostrato una tecnica affidabile per la valutazione dei KCC e degli NKCC33.
Il saggio di flusso di tallio (TI+) utilizza TI+ come ione surrogato di K+ a causa della sua elevata affinità di legame con il sito K+ su KCC2 e NKCC2. L'afflusso di TI+ nelle cellule potrebbe essere rilevato utilizzando un colorante fluorescente sensibile al tallio come la cumarina benzotiazolica e la fluozin-2. Una volta trasportato dal canale, TI+ può associarsi al colorante BTC/fluozin-2 causando un cambiamento fluorescente che può essere rilevato dal lettore di piastre di imaging fluorometrico31. I coloranti indicatori TI+ entrano nelle cellule come esteri acetossimetilici che vengono poi scissi dalle esterasi citoplasmatiche per rilasciare le forme fluorogeniche attive. Per attivare i KCC, le cellule vengono stimolate con una miscela di K+ e Tl+ in presenza o assenza di composti in esame (ad esempio, inibitori KCC2). Il tallio entra e si lega al colorante di fluorescenza. L'aumento del segnale fluorescente è proporzionale all'afflusso di Tl+ nella cella specificamente attraverso il cotrasportatore, e rappresenta quindi una misura funzionale dell'attività del cotrasportatore. Questo metodo è stato anche ben applicato nella misurazione dell'attività di KCC2 e NKCC2 in vari tipi di colture cellulari, ad esempio, studi sulla linea cellulare HEK293 che esprime stabilmente KCC234 umano. Sul lato del demerito, esiste una varietà di potenziali linee di percorsi fuori bersaglio che potrebbero interferire con l'afflusso di TI +, ad esempio, Na+/K+ ATPasi nelle cellule HEK293 potrebbe causare un tasso di successo falso positivo o falso negativo più elevato35. Inoltre, come per altri saggi di flusso, l'implementazione di tale approccio nelle cellule neuronali rimane limitata a causa della scarsa sopravvivenza delle cellule neuronali dopo più fasi di lavaggio. L'espressione neuronale di più canali K+ e trasportatori può anche impedire la valutazione accurata dei flussi K+ specifici di KCC2. Questa tecnica presenta limitazioni per lo studio dei canali in piccoli compartimenti neuronali come dendriti e spine dendritiche, e gli assoni dovuti alla mancanza di risoluzione spaziale accoppiata con una bassa risoluzione temporale.
Ulteriori tecniche come patch-clamp-elettrofisiologia sono utilizzate per misurare l'attività GABA; quindi, riflettendo indirettamente KCC2 attivato e/o inattivato come informato dalla valutazione dell'omeostasi intracellulare degli ioni cloruro. Generalmente, le misurazioni elettrofisiologiche della funzione di SLC12 si basano sul principio che i recettori GABA A (GABAAR) sono permeabili al cloruro36. KCC2 è fondamentale nella modulazione dell'inibizione GABAergica. In particolare, l'attività di estrusione [Cl-]i di KCC2 è alla base dell'iperpolarizzazione del GABAAR6. Le registrazioni intracellulari forniscono informazioni cruciali attraverso l'estrapolazione della capacità di estrusione di cloruro di KCC2 dall'inversione del potenziale delle correnti mediate da R GABAA(EGABA). Un EGABA iperpolarizzato indica un [Cl-]i inferiore e quindi un aumento dell'attività di KCC2. La tecnica patch-clamp della gramicidina in elettrofisiologia è un approccio gold standard per misurare l'attività del GABA. Alcuni studi precedentemente pubblicati hanno impiegato la registrazione patch-clamp della gramicidina per studiare le funzioni e le attività di KCC2 per valutare/monitorare l'omeostasi [Cl-]i si sono effettivamente dimostrati efficaci 8,9,37,38,39,40 . Durante una registrazione di patch clamp per gramicidina, viene creato un sigillo ermetico sulla superficie della cellula / tessuto utilizzando un elettrodo di vetro con un cerotto relativo per registrare l'attività intracellulare dei canali ionici in riferimento a un altro elettrodo in un bagno che circonda la cellula / tessuto. Questa tecnica può essere eseguita misurando la quantità di corrente che attraversa la membrana di una cella a una tensione fissa nella modalità tension-clamp o registrando la quantità di tensione che si muove attraverso la membrana a una corrente fissa nella modalità di morsetto di corrente36. Possono essere applicate diverse varianti della tecnica di base che dipendono in gran parte dalla domanda di ricerca. La tecnica non crea una registrazione di patch a cellule intere simili a pori relativamente grandi, ma l'antibiotico che forma i pori (gramicidina) contenuto nella soluzione dell'elettrodo viene utilizzato per formare piccoli pori nella membrana36. In particolare, l'aggiunta di gramicidina crea pori cationico-selettivi nella membrana, che mostrano una permeabilità anionica insignificante. I protocolli di rampa di tensione sono un'alternativa efficace e affidabile alla registrazione della corrente a una tensione costante. Le relazioni corrente/tensione ottenute con i protocolli di rampa di tensione sembrano dare una migliore registrazione delle correnti di membrana mediate da GABAAR. In questo protocollo, viene applicata una tensione costantemente variabile ma monitorata (ad una velocità costante) e la corrente viene costantemente misurata simultaneamente36,41. Durante questo protocollo, l'applicazione di impulsi di tensione (di solito in direzione iperpolarizzante) viene utilizzata per attivare la corrente di perdita a seguito di risposte ohmiche. Tipicamente, le correnti di membrana mediate da GABAAR sono calcolate dalla corrente di dispersione (cioè i potenziali di inversione delle correnti agoniste sottratte dalla perdita)36. Le associazioni corrente-tensione ottenute da questo protocollo aiutano a fornire una migliore comprensione di dove si verificano i cambiamenti nelle concentrazioni di ioni durante uno scenario sperimentale che coinvolge i canali del recettore GABAA. Yelhekar et al.41 hanno utilizzato un modello computazionale per dimostrare che le conclusioni sulle concentrazioni di ioni stabili dal metodo di interpolazione potrebbero non essere giustificabili perché il potenziale di inversione stimato dal metodo potrebbe essere errato.
La resistenza media utilizzata per la maggior parte delle registrazioni è di 5 MΩ. Le pipette con resistenza inferiore di 3-4 MΩ possono comportare una resistenza in serie inferiore, preferibile per le registrazioni di morsetti di tensione. Tuttavia, la punta della pipetta sarà relativamente più larga per pipette a resistenza più elevata e, di conseguenza, rappresenta una sfida sotto forma di difficoltà nella formazione della tenuta e nella stabilità36,42. Pertanto, è necessario monitorare la formazione di GΩ per ottenere registrazioni con una notevole riduzione del livello di dati rumorosi generati. La robustezza di questa tecnica per studiare la funzione e le attività di KCC2 come giudicato dalla sua idoneità e affidabilità nella misurazione dell'attività GABA è stata confermata da diversi studi. Studi precedenti hanno dimostrato che [Cl-]i rimane stabile usando questa tecnica misurando le risposte di GABAARs (che sono in grado di eliminare la conduttanza del cloruro) ai rispettivi agonisti. Implicitamente, l'accesso elettrico continuo viene fornito con poca o nessuna modifica della concentrazione intracellulare di cloruro43,44. Inoltre, questa tecnica facilita l'elusione dei cambiamenti artificiali nel potenziale di membrana e nell'E GABA durante l'attivazione delGABA AR (che apre la conduttanza del cloruro e del bicarbonato)45. Quanto sopra fornisce a questa tecnica un vantaggio rispetto ad altri tipi di registrazioni elettrofisiologiche. Tuttavia, i limiti di questa tecnica includono quanto segue: (1) possono verificarsi frequenti rumori di registrazione a causa della punta dell'elettrodo che occupa parte della membrana che può ridurre la risoluzione corrente, e (2) la perforazione della membrana con gramicidina di solito richiede un periodo di tempo relativamente più lungo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094) e da una borsa di studio per il dottorato del Commonwealth.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
References
- de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
- Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
- Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
- Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
- Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
- Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
- Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
- Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
- Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
- Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
- Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
- AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
- Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
- Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
- Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
- Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
- Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
- Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
- Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
- Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
- Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
- Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
- Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
- Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
- Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
- Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
- Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
- Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
- Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
- Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
- Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
- Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
- Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
- Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
- Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
- Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
- Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
- Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
- Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).
