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Biochemistry

ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64179
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

本プロトコルは、ニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の適用を強調しています。このプロトコルは、ウェスタンブロッティング による キナーゼ調節部位Thr906/1007でのKCC2リン酸化の調査について説明しています。また、KCC2活性を確認するための追加の方法は、このテキストで簡単に強調されています。

Abstract

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl- 恒常性の適切な機能とその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です。KCC2の適切な調節の失敗は有害であり、てんかんを含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関してはかなりの進歩があり、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定されています。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここでは、キナーゼ調節部位(Thr906およびThr1007)でのKCC2リン酸化をウェスタンブロッティング技術を使用して調べる方法を強調しています。ルビジウムイオンやタリウムイオン取り込みアッセイなど、KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法があります。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。これらの追加のテクニックのいくつかについては、この原稿で簡単に説明します。

Introduction

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl-恒常性の適切な機能、およびその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です1,2,3,4。KCC2による4-6 mMの低神経内Cl-濃度([Cl-]i)の維持は、脳および脊髄におけるγ-アミノ酪酸(GABA)/グリシンの過分極およびシナプス阻害を促進する5。KCC2の適切な調節の失敗は、てんかん4を含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。さらに、KCC2を介したCl-押し出しの減少、および過分極GABAAおよび/またはグリシン受容体媒介電流の障害は、てんかん、神経因性疼痛、および痙縮に関係しています6,7。ニューロンKCC2は、リジンなし(WNK)-STE20/SPS1関連プロリン/アラニンリッチ(SPAK)/酸化ストレス応答性(OSR)キナーゼシグナル伝達複合体1によるC末端細胞内ドメイン内の主要な調節残基のリン酸化を介して負に調節され、未熟ニューロンにおける脱分極GABA活性の維持を促進します2,8,9.WNK-SPAK/OSR1は、スレオニン残基906および1007(Thr906/Thr1007)をリン酸化し、続いてKCC2のmRNA遺伝子発現を下方制御し、その結果、その生理学的機能を低下させます8,10。しかし、さらに重要なことに、WNK-SPAK/OSR1キナーゼ複合体がKCC2発現をリン酸化および阻害することが知られており1,2,4,11,12、およびThr906/Thr1007をリン酸化するキナーゼ複合体シグナル伝達経路の阻害がKCC2 mRNA遺伝子の発現増加と関連していることはすでに事実です13,14,15。.タンパク質リン酸化を介したニューロンKCC2およびNa+-K+-2Cl-共輸送体1(NKCC1)発現の調節は、同時に、逆のパターンで機能することに注意することが重要です1,4,16。

KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関しては、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定された、一貫したかなりの進歩がありました。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここで紹介するプロトコルは、キナーゼ調節部位Thr906/1007での共輸送体のリン酸化を調べることにより、ニューロンK+-Cl- 共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の応用を強調しています。

ウェスタンブロットは、組織または細胞のサンプルから目的の特定のタンパク質を検出するために使用される方法です。この方法では、まず電気泳動によってタンパク質をサイズ別に分離します。次に、タンパク質を固体支持体(通常はメンブレン)に電気泳動で転写してから、特異的抗体を使用して標的タンパク質をマーキングします。抗体は、比色法、化学発光法、または蛍光法のいずれかを使用して検出されるさまざまなタグまたは蛍光色素標識抗体に結合されます。これにより、タンパク質の混合物から特定の標的タンパク質を検出することができます。この技術は、KCC1 のリン酸化特異的部位を特徴付けるために使用されており、KCC3 Thr991/Thr1048リン酸化を阻害するキナーゼ阻害剤を同定するために使用されています17。このプロトコルに従うことにより、細胞/組織溶解物から総リン酸化KCC2を特異的に検出することができます。原理的には、本手法によるタンパク質結合抗体の検出は、KCC2のリン酸化部位における協同活性の理解に役立ち、その生理制御に関わる分子機構の解明に大いに役立ちます。全タンパク質発現の定量分析は、KCC2の機能と活性を代表するものです。KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法、例えばルビジウムイオンおよびタリウムイオン取り込みアッセイがある。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。

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Protocol

注:このプロトコルでは、目的の特定のタンパク質を検出するためのウェスタンブロッティング法について説明しています。

1. 細胞培養とトランスフェクション

  1. 細胞培養手順の前に、すべての試薬をビーズバス(37°C)で温めます。10%ウシ胎児血清、各1%2mM L-グルタミン1%、非必須アミノ酸100x、ピルビン酸ナトリウム100 mM、およびペニシリン-ストレプトマイシン100単位を添加した培養培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を準備します。
  2. ヒト胚性腎臓293細胞(HEK293rnKCC2b)18 をビーズバス(37°C)中で安定にトランスフェクトしたラットKCC2bを完全に解凍する。細胞をクライオバイアルチューブから5 mLの新鮮な培地を含む遠沈管に移します。セルを1200 ×gで3〜5分間回転させます。
  3. アスピレーターピペット(真空ポンプに固定)を使用して上清を吸引し、10 mLの新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を10cmのディッシュプレートに移す。
  4. 皿をインキュベーターに入れ、加湿した5%CO2 雰囲気中で37°Cで48時間増殖させます。健康な細胞増殖を確実にするために潜伏期間を監視します。インキュベーション期間後に90%以上のコンフルエントに達した細胞をさらに分割します。
  5. 細胞皿から古い培地を吸引し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかに洗い流します。2 mLのトリプシンを加え、室温で約1〜2分間インキュベートします。
  6. 2 mLの完全培地を使用して、ディッシュ内のトリプシン処理細胞を穏やかに洗浄します。9 mLの新鮮な培地を新しい皿に加え、古い皿から1 mLの溶液を新しい皿のそれぞれに加えます。スプリットセルディッシュをインキュベーターに48時間戻し、90%のコンフルエンシーを達成≥。
  7. 細胞を溶解バッファーで回収する前に、コントロールとしてジメチルスルホキシド(DMSO)、8 μMスタウロスポリン、または0.5 mM N-エチルマレイミド(NEM)のいずれかで15分間処理します。

2. 細胞ライセートの調製とサンプルのローディング

  1. 培養皿上の培地を吸引します(トランスフェクション手順から)。細胞培養物を氷上に置き、氷冷したPBSで細胞を洗浄します。
  2. PBSを吸引し、50 mMトリス塩酸塩(pH 7.5)、1 mMエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸(EGTA)、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、50 mMフッ化ナトリウム、5 mMピロリン酸ナトリウム、10 mMナトリウム-β-グリセロリン酸、1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、1%(w / v)トリトンX-100、0.27 Mスクロースを含む1 mLの氷冷溶解バッファーを加えます。 1 mMベンザミン、0.1%(v / v)2-メルカプトエタノール、および2 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)をディッシュに。
    注:細胞回収時の溶解バッファーの容量はディッシュのサイズによって異なりますが、例えば、1 x 107 セル/100 mmディッシュ/150 cm2 フラスコあたり1 mLの溶解バッファーが適しており、5 x 106 セル/60 mmディッシュ/75 cm2 フラスコあたり0.5 mLが適しています。
  3. 冷たいプラスチック製のセルスクレーパーを使用して皿の底から細胞をこすり落とし、次にピペットを静かに使用して、細胞懸濁液をすでに氷上にあるマイクロ遠心チューブに移します。チューブを4°Cで30分間絶えず攪拌します。
  4. 細胞溶解物を16,000 x g の冷たい遠心分離機(4°C)で20分間回転させ、チューブを遠心分離機からそっと取り出して氷上に置きます。上清を予冷した新鮮なチューブに集め、ペレットを廃棄します。
    注:細胞の種類によっては、遠心分離力と時間を変える必要がある場合があります。ただし、一般的なガイドラインでは、16,000 x g で20分間遠心分離することを推奨しています。ただし、これは実験ごとに決定する必要があります。たとえば、白血球のような繊細な細胞には、非常に軽い遠心分離速度が必要です。

3. 細胞溶解液からの免疫沈降剤の調製

  1. 300 μLのタンパク質-G-セファロースをマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。溶液を500 x g で2分間回転させ、上清を廃棄します。
  2. 500 μLのPBSを加え、溶液をよくボルテックスします。溶液を500 x g で2分間回転させ、上清を廃棄します。この手順を繰り返します。
  3. 1 mgの抗KCC2 Thr906および抗KCC2 Thr1007抗体を200 μLのタンパク質G-セファロースビーズと混合し、PBSで500 μLの容量に構成します。振動プラットフォームまたは回転ホイールで4°Cで2時間振とうします。 PBSで2回洗浄します。
  4. 細胞ライセート全体に対してタンパク質定量を行い、洗浄したビーズに1 mgの細胞ライセートを加えます。エンドツーエンドのローテーターで4°Cで2時間穏やかにインキュベートします。 ビーズをスピンダウンし、150 mM塩化ナトリウム(NaCl)を含むPBSで3回洗浄します。
  5. 免疫沈降剤(ビーズ)を200 μLのPBSで3回洗浄します。最終ペレットを100 μLの1xドデシル硫酸リチウム(LDS)サンプルバッファーに再懸濁します。
  6. チューブをローターシェーカーで室温で5分間振とうし、75°Cの加熱ブロックで10分間インキュベートします。ローディングサンプルを11,000 x g で2分間遠心分離し、上清をゲルローディングに使用します。

4. ウェスタンブロットの実行

  1. キャスティング装置を組み立て、新しく調製した8%分離ゲル(レシピ/準備については 表1 を参照)を注ぎ、キャスティンググラスの上部から約2cmのスペースを確保してゲルをキャストします。200 μLの無水イソプロパノールをセットアップに加え、室温で60分間放置します。
    注:ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)のポリアクリルアミドゲルレシピは、目的のタンパク質のサイズによって異なります(表2)。したがって、目的のゲルパーセンテージを決定する前に、タンパク質のサイズをメモしてください。
  2. ピペットを使用してイソプロパノールを除去し、約200μLの蒸留水でゲルを注意深くすすぎます。新しく準備した6%スタッキングジェル(レシピ/準備については 表1 を参照)を追加して、キャスティングセットアップの約2cmのスペースを埋めます。ウェルコームにそっとはめ込み、室温で30分間放置します。
  3. キャストしたゲルを電気泳動タンクに固定します。
  4. トリス塩基30.3 g、グリシン144.1 g、SDS10 gを蒸留水1000 mLに溶解し、10xトランスファーバッファーを調製します。10 mLの10%SDSと100 mLの10xトランスファーバッファーを890 mLの蒸留水に加えて、1xランニングバッファーを調製します。
  5. 1xランニングバッファーをタンクに注ぎます。5 μLの分子量マーカーを最初のウェルにロードし、等量のタンパク質をSDS-PAGEゲルの各ウェルにロードします(使用するコームサイズに応じて18〜30 μL)。空のウェルを1x LDSで満たし、120 Vで約90〜120分間ゲルを実行します。
  6. 58.2 gのトリス塩基と29.3 gのグリシンを1000 mLの蒸留水に溶解し、10xトランスファーバッファーを調製します。20%メタノールを含む1xトランスファーバッファーでニトロセルロースメンブレンを活性化します。ゲルとメンブレンをトランスファーバッファーですすぎ、準備スタックに静かに広げます。
    注:ランニングバッファーとトランスファーバッファーのpHは、必要な最適なpHにする必要があるため、調整する必要はありません。また、時間を節約するために、実験の前にこれらのバッファーを準備して室温で保存することをお勧めします。
  7. 転写するサンドイッチを、負極(黒枠/端)-サンドイッチフォーム-ろ紙-すすぎSDS-PAGEゲル-すすぎニトロセルロースメンブレン-ろ紙-サンドイッチフォーム-正極(赤枠)の順に並べます。組み立てたサンドイッチをトランスファータンクに積み重ね、90Vで90分間、または30Vで360分間運転します。

5. 抗体染色と画像現像

  1. 膜を取り外して乾かします。0.1%の1x Tween 20(1x TBS-T)を含むトリス緩衝生理食塩水中の5%スキムミルクから作られたブロッキングバッファーを使用して、室温で1時間メンブレンをブロックします。
  2. 一次抗体8,15,19およびβ-アクチン(ローディングコントロール)の適切な希釈液を用いてメンブレンをブロッキングバッファー中で室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 1x TBS-Tの3回の洗浄でメンブレンをそれぞれ5分間洗浄します。
    注:β-アクチン、α-チューブリン、またはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ抗体などのローディングコントロールを使用した個別のメンブレンのインキュベーションは、その後の定量中に他のウェスタンブロッティング結果を正規化することです。各一次抗体の推奨希釈率は、メーカーのマニュアルに記載されています。
  3. 洗浄したメンブレンをブロッキングバッファーで5000倍に希釈した二次抗体とともに室温で60分間インキュベートします。再度、メンブレンを1x TBS-Tでそれぞれ5分間3回洗浄します。
    注:二次抗体は、一次抗体が産生される種に対して産生させることを強くお勧めします。例えば、総KCC2の一次抗体がマウス抗KCC2である場合、抗マウスの二次抗体を使用する必要があります。
  4. 洗浄したメンブレンをイメージングボードに置きます。各増強化学発光(ECL)試薬を等量混合し、混合溶液をメンブレン上に穏やかに広げてシグナルを発生させます。

6. イメージングシステムによる画像取得とデータ定量化

  1. イメージングボードをイメージングシステムの適切なコンパートメントに移してイメージングします。画像処理のためにコンピュータ上のイメージングソフトウェアを開きます。
  2. ツール バーで、[新しいプロトコル] をクリックし、[シングル チャネル] を選択します。ゲルイメージング/アプリケーションダイアログボックスで選択をクリックし、ブロットまでスクロールして、ケミハイ感度またはケミハイ解像度のいずれかを選択します。次に、[信号蓄積設定]をクリックして、取得する画像の持続時間と数を設定します。
  3. プロトコル設定の下にある Position Gel をクリックし、必要に応じてイメージングシステムでゲルを調整します。[ プロトコルの実行 ] をクリックしてイメージを取得します。
  4. イメージングカタログボックスの下にある集録画像の1つを右クリックして、画像をコンピュータに保存します。目的の画像に移動し、[実行]ダイアログボックスの[ 画像の選択と続行 ]をクリックします。
  5. 画像変換アイコンをクリックして、画像のコントラストとピクセル彩度を調整します。一般ツールバーのスクリーンショットアイコンをクリックして、目的の画像形式に応じて画像をコンピューターに保存します。
  6. ImageJソフトウェアを使用してバンド密度を測定し、適切な統計ツールを使用して分析します。

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Representative Results

ここでは、図1に示す代表的な結果を、ウェスタンブロッティング技術を用いて、KCC2b(HEK rnKCC2b)18を安定発現するHEK293細胞株におけるWNK-SPAK/OSR1を介したKCC2およびNKCC1のリン酸化に対するスタウロスポリンおよびNEMの影響を調査した。代表的な結果に関する包括的な詳細は、Zhang et al.15で議論されている。NEMと同様に、スタウロスポリンは、KCC2輸送活性を増強し、NKCC1活性を阻害することができる広範なキナーゼ阻害剤である15,20。HEK293細胞をスタウロスポリンおよびNEMで処理すると、SPAK標的部位(Tループキナーゼドメインに位置するThr233およびhsSPAKのSループリン酸化部位Ser373)でのリン酸化が低下しました。したがって、両方の化合物は、前述のSPAKホスホサイトのリン酸化レベルを短縮しました。また、スタウロスポリンはHEKrnKCC2bのSer940のリン酸化を低下させたが、NEMはそのリン酸化を有意に増加させた。さらに、スタウロスポリンはThr505部位でのリン酸化を減少させるが、NEMは同じ部位でのリン酸化のわずかな、しかしわずかな増加を引き起こした。Thr505部位のプロテインキナーゼC(PKC)とSer940部位のKCC2bのリン酸化に対する両化合物の異なる効果はよく相関しています。代表的な結果はまた、両方の薬剤が総rnKCC2b、hsNKCC1、またはhsSPAKの発現を変化させることを示しました。NEM(スタウロスポリン処理ではない)は、総KCC2量の発現の有意な増加を引き起こしたが、総NKCC1およびSPAKの発現は、両方の化合物で処理した場合、有意に変化しなかった。さらに、この2つの化合物は、Thr233およびSer373サイトでSPAKのリン酸化の低下を引き起こし、これはrnKCC2bおよびhsNKCC1のThr906/Thr1007およびThr203/207/212サイトの短縮リン酸化と相関しました。さらに、スタウロスポリンおよびNEMは、rnKCC2bのSer940部位でのPKCのリン酸化をそれぞれ減少および増加させ、これはそれぞれスタウロスポリンおよびNEM処理時のThr505部位でのPKC-δのリン酸化の減少および増加と相関した(図1)。

Figure 1
図1:HEK rn KCC2b細胞におけるスタウロスポリンおよびNEM処理時のrn KCC2bおよびhsNKCC1ホスホ部位の定量的分析。 (A)安定にトランスフェクトされたHEK rnKCC2b細胞をDMSO(コントロール)、8 μMスタウロスポリン、または0.5 mM NEMで15分間処理しました。細胞ライセートを回収し、指示された抗体を用いて免疫沈降(IP)およびイムノブロット(IB)に供した。略語:D =二量体KCC2;M =単量体KCC2。(B)安定にトランスフェクトされたHEKrnKCC2b細胞のイムノブロット定量。バンド強度は、ImageJソフトウェアで定量化しました。p < 0.001;**p < 0.01;ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定(n = 6)。この図はZhangら15から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

8 mLの8%分離ゲル 5 mL 6% スタッキングジェル
必要な材料 容量(μL) 必要な材料 容量(μL)
蒸留H2O 4200 蒸留H2O 2900
40% アクリルアミド 1600 40% アクリルアミド 750
1.5 M トリス pH 8.8 2000 0.5 M トリス pH 6.8 1250
10% SDS 80 10% SDS 50
10% APS 80 10% APS 50
テメッド 8 テメッド 5
分離ゲルを作る:
1) 4.2 mLのddH2Oから始めます
2) 1.6 mLの40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液を追加します
3) 2 mLの1.5 MトリスpH 8.8を加えて混合します
4) 80 μL の 10% SDS を混合する
5) 使用する準備ができたら、8 μLのTEMEDを加えて混合します
6) 80 μLの10%APS*を加えて混合します
スタッキングゲルを作る:
1) 2.9 mLのddH2Oから始めます
2) 0.75 mLの40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液を追加します
3) 0.5 M トリス pH 6.8 を 1.25 mL 加え、混合します。
4) 50 μLの10%SDSを混合する
5) 使用する準備ができたら、5 μLのTEMEDを加えて混合します
6) 50 μLの10%APS*を加えて混合します
SDS = ドデシル硫酸ナトリウム
APS = 硫酸アンモニウム
TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-テトラメチルエチレンジアミン
※APSを添加したら、数分以内に重合するため、すぐにキャスト装置に注ぐ必要があります。したがって、溶液が必要なときにちょうど分離および積み重ねるゲル溶液を調製することをお勧めします。

表 1: ポリアクリルアミドゲルミックスを作るためのレシピ(ゲル溶液の分離と積み重ね)。

ゲルの割合(%) タンパク質サイズ(キロダクDa)
20まで 4から40
15 12から45
12.5 10から70
10 15から100
8 50から200
4 から 6 >200

表 2: さまざまなサイズのタンパク質に対する推奨SDS-PAGEゲルパーセンテージ

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Discussion

KCC2を含むニューロンで発現されるCCCのSLC12の活性を測定するために多くの方法が用いられてきた。これらの技術の多くは、これらのトランスポーターの機能的関連性と、さまざまな疾患関連変異におけるそれらの構造機能パターンの分析に関する科学的知識を強化することが証明されています。重要なことに、さまざまな方法21には利点と注意点があります。しかし、上記のプロトコルでは、KCC2の機能と活性の研究に役立つウェスタンブロットを使用して、キナーゼ調節部位であるThr906およびThr1007でのKCC2リン酸化を評価する方法を概説しています。

KCC2の調節は、重要なセリン/スレオニン残基1でのリン酸化および脱リン酸化によって起こります。ウェスタンブロッティングは、Thr906およびThr1007のキナーゼ調節部位におけるKCC2リン酸化を調べるために使用できる効率的な技術です。原則として、KCC2のリン酸化の変化は、目的のイムノブロットサンプル/タンパク質のリン酸化ペプチドに対するリン酸化特異的抗体を使用して検出されます。ウェスタンブロットは、組織または細胞のサンプルから目的の特定のタンパク質を検出するために使用される方法です。この方法では、まず電気泳動によってタンパク質をサイズ別に分離します。次に、タンパク質を固体支持体(通常はメンブレン)に電気泳動で転写してから、特異的抗体を使用して標的タンパク質をマーキングします。抗体は、比色法、化学発光法、または蛍光法のいずれかを使用して検出されるさまざまなタグまたは蛍光色素標識抗体に結合されます。これにより、タンパク質の混合物から特定の標的タンパク質を検出することができます。この技術は、KCC2 2,8のリン酸化特異的部位を特徴付けるために使用されており、KCC2 Thr906/Thr1007リン酸化に拮抗するKCC2の阻害剤を特定するために使用されています15。HEK293ラインは、分子生物学実験における利点により、いくつかの実験に使用されています。再現性が速く、メンテナンスが容易で、トランスフェクションやタンパク質生産に非常に効率的です22。しかし、脳由来の細胞ではないため、神経生物学実験を行うのに最も適した候補ではない可能性があり、したがって、その生理学的特異性は神経科学研究において疑わしい可能性があるという意見もあります。しかし、以前の研究では、HEK293細胞および実際の神経組織/細胞におけるKCC2の発現において同様の結果が観察されることが示されている15,23。したがって、神経科学研究におけるHEK293の関連性は完全に破棄されない可能性があります。

ウェスタンブロッティング技術によるタンパク質発現の分析を含む研究では、溶解バッファー組成の選択、使用する界面活性剤の性質(種類と濃度)24、およびプロテアーゼ阻害剤に特に注意を払う必要があります。バッファーの組成は、その可溶化および抽出プロセスを容易にし、ウェスタンブロットによる容易な検出を可能にするために、標的タンパク質に適合するように最適化する必要があります25。可溶性タンパク質には通常、低濃度の中性洗剤が必要ですが、膜タンパク質はより強力な界面活性剤条件を必要とする場合があります。ただし、強力な洗剤は相互作用を妨害し、複合体が失われる可能性があります。洗剤の種類と濃度の両方がタンパク質の性質と活性に影響を与える可能性があるため、これらの洗剤の濃度の制限/許容範囲に固執する必要があります。プロテアーゼ阻害剤の添加は、標的タンパク質が内因性タンパク質によって分解されるのを防ぎ、タンパク質分解速度を効果的に低下させるために最適な推奨使用温度は4°Cです。時には、貧弱なイムノブロットシグナルを与える抗体に対して高品質のイムノブロットシグナルを達成するために、免疫沈降(IP)がウェスタンブロッティングの上流実験として実施されます。この技術は、それらの結果としての分離および定量に先行するそれらの天然立体構造における抗原およびそれらのそれぞれの抗体との間の相互作用を促進するので有利である26。したがって、IPはウェスタンブロッティング手順からの出力の品質を向上させる可能性があります。IP技術を適用する前に、全細胞ライセートまたはインプト画分をウェスタンブロッティングで分析することにより、ライセート中の共免疫沈降パートナータンパク質の発現の有無と効率を評価することが重要です。さらに、タンパク質のサイズがゲルマトリックスのふるい分け効果に影響を与えるため、SDS-PAGE電気泳動用の所望のパーセンテージゲル溶液を調製する前に、調査するタンパク質の分子量に関する事前知識が必要です。

しかし、この技術によるタンパク質結合抗体の検出は、共輸送体のリン酸化と共輸送体を調節する可能性のあるシグナル伝達経路の完全性に関する情報を提供する可能性のあるKCC2のリン酸化部位での協同活性の理解を深め、共輸送体活性の信頼性の高い予測に役立つため、非常に役立ちます。ただし、ウェスタンブロット法は半定量的なデータしか生成できないため、タンパク質発現の相対的な評価のみを強調し、絶対定量は強調しないことに注意することが重要です。これは、個々のブロットで異なる別々のレーンでのサンプルロードと転送の速度の不一致が認められています。生成された検出シグナルも線形ではなく、サンプル27の濃度範囲を反映していない。さらに、阻害剤、突然変異、およびその環境とのタンパク質相互作用などの介入は、リン酸化レベルを変化させることなくタンパク質活性に直接影響を与える可能性があるため、リン酸化状態はタンパク質活性を報告するための信頼できる因子ではない可能性があります28,29,30。したがって、他の生化学的方法を補うためにリン酸化特異的抗体を使用することがより有益であり得る。

前述のように、KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法があります。均質な細胞調製物の膜を通る放射性86Rb+フラックスの測定によるKCC2の評価は、一般的なアプローチです。この方法は、活性放射性同位元素をイオンチャネルに通すことによってトレーサーとして使用する。簡単に説明すると、目的の細胞を陽イオンフリー溶液中でインキュベートして内因性KCC2を阻害し、続いてウアバインなどの特異的阻害剤とインキュベートし、次いで阻害剤および86Rb+を含む取り込み培地でインキュベートします。液体シンチレーションカウンターは、細胞溶解の続編の活性を測定/追跡するために使用されます。ただし、この方法は堅牢で感度が高く、選択的であり、外乱を起こしにくいです。ただし、そのアプリケーションは、脳やニューロンの培養など、複数の細胞タイプの組織には及ばない。さらに、この技術は、細胞内レベルでのイオン濃度の分解能の変化を制限する。さらに、高エネルギー放出(最大1.77MeV、最大1.08MeV)を特徴とする短い半減期(18.65日)放射性同位元素を扱うことの潜在的な毒性と健康被害に関する安全性の問題があります31。これは、通常多数の細胞が必要とされる神経細胞研究には不適切であることを大いに示唆している可能性があります。これらの問題は、イオンフラックスの測定のための放射性86Rb+の代替として、Terstappen 1999による非放射性85Rb+排出アッセイの開発につながります。非放射性アプローチは、製薬業界におけるK+および非選択的陽イオンチャネルの分析のための放射性86Rb+アッセイを大幅に排除しました31。非放射性85Rb+排出アッセイには、細胞培養と操作、原子吸光分析(AAS)によるトレーサールビジウムの測定の2つの主要なプロセスが含まれます。この方法は使いやすいですが、多くのアッセイ検証実験が必要であり、時間分解能が不十分です32。それにもかかわらず、非放射性85Rb+排出アッセイは、KCCおよびNKCCの評価のための信頼できる技術であることが徐々に証明されています33。

タリウム(TI+)フラックスアッセイは、KCC2およびNKCC2のK+部位への結合親和性が高いため、TI+をK+の代理イオンとして使用します。細胞へのTI+流入は、ベンゾチアゾールクマリンやフルオジン-2などのタリウム感受性蛍光色素を用いて検出することができた。チャネルによって輸送されると、TI+はBTC/フルオジン-2色素と会合し、蛍光イメージングプレートリーダー31によって検出できる蛍光変化を引き起こす可能性がある。TI+指示色素はアセトキシメチルエステルとして細胞に入り、細胞質エステラーゼによって切断されて活性蛍光発生型を放出します。KCCを活性化するために、細胞は、試験化合物(例えば、KCC2阻害剤)の存在下または非存在下でK+およびTl+の混合物で刺激される。タリウムは蛍光色素に入り、結合します。蛍光シグナルの増加は、共輸送体を介した細胞へのTl+の流入に比例するため、共輸送体活性の機能的測定値を表します。この方法は、様々なタイプの細胞培養物におけるKCC2およびNKCC2活性の測定にも十分に適用されており、例えば、ヒトKCC2を安定に発現するHEK293細胞株に関する研究34が挙げられる。デメリット側では、TI+流入を妨害する可能性のある様々な潜在的なオフターゲット経路ラインがあり、例えば、HEK293細胞におけるNa+/K+ ATPaseは、より高い偽陽性または偽陰性のヒット率を引き起こす可能性がある35。さらに、他のフラックスアッセイと同様に、ニューロン細胞におけるそのようなアプローチの実施は、複数の洗浄ステップ後のニューロン細胞の生存率が低いため、依然として制限されています。複数のK+チャネルとトランスポーターのニューロン発現も、KCC2特異的K+フラックスの正確な評価を妨げる可能性があります。この技術は、樹状突起や樹状突起棘などの小さなニューロンコンパートメントのチャネルの研究に限界があり、軸索は空間分解能の欠如と低い時間分解能のために発生します。

パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。一般に、SLC12機能の電気生理学的測定は、GABAA受容体(GABAA AR)が塩化物36に対して透過性であるという原理に依存している。KCC2はGABA作動性阻害の調節において重要である。特に、KCC2の[Cl-]i押出活性は、GABAA R6の過分極の根底にある。細胞内記録は、GABAAR媒介電流(EGABA)の電位の逆転からKCC2の塩化物押し出し能力の外挿を通じて重要な洞察を提供します。過分極EGABAは、より低い[Cl-]iを示し、したがってKCC2の活性の増加を示す。電気生理学におけるグラミシジンパッチクランプ技術は、GABA活性を測定するためのゴールドスタンダードのアプローチです。以前に発表されたいくつかの研究では、グラミシジンパッチクランプ記録を使用してKCC2の機能と活性を調査し、[Cl-]i恒常性を評価/監視することが実際に成功したことが証明されています8,9,37,38,39,40 .グラミシジンパッチクランプ記録中、相対パッチを備えたガラス電極を使用して細胞/組織表面にタイトなシールを作成し、細胞/組織を囲む浴内の別の電極を参照してイオンチャネルの細胞内活性を記録します。この技術は、電圧クランプモードで固定電圧で細胞の膜を横切る電流の量を測定することによって、または電流クランプモード36で固定電流で膜を横切って移動する電圧の量を記録することによって実行することができる。基本的な手法のいくつかのバリエーションを適用できますが、これは研究の質問に大きく依存します。この技術は、比較的大きな細孔状の全細胞パッチ記録を作成しないが、電極溶液に含まれる細孔形成抗生物質(グラミシジン)を使用して、膜36内に小さな細孔を形成する。特に、グラミシジンの添加は膜中にカチオン選択的細孔を形成し、それはわずかなアニオン透過性を示す。電圧ランププロトコルは、安定した電圧で電流を記録するための効果的で信頼性の高い代替手段です。電圧ランププロトコルで得られた電流/電圧関係は、GABAAR媒介膜電流のより良い記録を与えるようです。このプロトコルでは、絶えず変化するが監視されている電圧が(一定の速度で)印加され、電流は常に同時に測定されます36,41。このプロトコルでは、電圧パルス(通常は過分極方向)を印加して、オーム応答の結果としてリーク電流を活性化します。典型的には、GABAAR媒介膜電流は、リーク電流(すなわち、リーク減算アゴニスト電流の反転電位)36から計算される。このプロトコルから得られた電流-電圧の関連は、GABAA受容体チャネルを含む実験シナリオ中にイオン濃度の変化がどこで起こっているかをよりよく理解するのに役立ちます。Yelhekarら41は、計算モデルを使用して、補間法からの安定したイオン濃度に関する結論は、方法からの推定反転電位が正しくない可能性があるため、正当化できない可能性があることを示しました。

ほとんどの録音に使用される平均抵抗は5MΩです。抵抗が3〜4MΩの低いピペットは、電圧クランプ記録に適した直列抵抗が低くなる可能性があります。しかし、ピペットの先端は、抵抗の高いピペットでは比較的広くなり、その結果、シール形成と安定性が難しいという形で課題が生じます36,42。したがって、生成されるノイズの多いデータのレベルを大幅に下げた記録を取得するには、GΩ形成を監視する必要があります。GABA活性の測定におけるKCC2の適合性および信頼性によって判断されるKCC2の機能と活性を研究するためのこの技術の頑健性は、いくつかの研究によって確認されている。以前の研究では、[Cl-]iは、それぞれのアゴニストに対するGABAARs(塩化物コンダクタンスをゲートすることができる)の応答を測定することにより、この技術を使用して安定していることが示されています。含意により、連続的な電気的アクセスは、細胞内塩化物濃度の変化をほとんどまたはまったく伴わない43,44。さらに、この技術は、GABAAR活性化(塩化物および重炭酸コンダクタンスを開く)中の膜電位およびEGABAの人為的な変化の回避を容易にする45。前述の技術は、他のタイプの電気生理学記録よりも優位に立つ技術を提供します。しかしながら、この技術の限界には、(1)電極の先端が膜の一部を占めるために頻繁な記録ノイズが発生し、電流分解能を低下させる可能性があること、および(2)グラミシジンによる膜の穿孔は通常比較的長い時間がかかることが含まれる。

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Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgments

この研究は、英国王立協会(助成金番号IEC\NSFC\201094)、および連邦博士号奨学金によってサポートされました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions

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生化学、第190号、
ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究
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Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).

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