Summary
Denne protokollen fremhever anvendelsen av vestlig blottingteknikk for å studere funksjonene og aktivitetene til neuronal K-Cl co-transporter KCC2. Protokollen beskriver undersøkelsen av KCC2 fosforylering på kinase reguleringssteder Thr906/1007 via western blotting. Også flere metoder for å bekrefte KCC2-aktivitet er kort fremhevet i denne teksten.
Abstract
Kaliumklorid-kotransportører 2 (KCC2) er medlem av løsemiddelbærerfamilien 12 (SLC12) av kationklorid-kotransportører (CCC), som utelukkende finnes i nevronet og er avgjørende for riktig funksjon av Cl-homeostase og følgelig funksjonell GABAergisk inhibering. Svikt i riktig regulering av KCC2 er skadelig og har vært assosiert med forekomsten av flere nevrologiske sykdommer, inkludert epilepsi. Det har vært betydelig fremgang med hensyn til å forstå mekanismene som er involvert i reguleringen av KCC2, akkreditert til utvikling av teknikker som gjør det mulig for forskere å studere dets funksjoner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering av kinasereguleringssteder fosforylering) eller indirekte (observasjon og overvåking av GABA-aktivitet) undersøkelser. Her fremhever protokollen hvordan man undersøker KCC2-fosforylering på kinasereguleringssteder - Thr906 og Thr1007 - ved hjelp av vestlig blottingteknikk. Det finnes andre klassiske metoder som brukes til å måle KCC2-aktivitet direkte, for eksempel rubidiumion og thalliumionopptaksanalyse. Ytterligere teknikker som patch-klemme-elektrofysiologi brukes til å måle GABA-aktivitet; derfor indirekte reflekterer aktivert og/eller inaktivert KCC2 som informert av vurderingen av intracellulær kloridionhomeostase. Noen av disse tilleggsteknikkene vil bli kort omtalt i dette manuskriptet.
Introduction
Kaliumklorid-kotransportører 2 (KCC2) er medlem av løsemiddelbærerfamilien 12 (SLC12) av kationklorid-kotransportører (CCC), som utelukkende finnes i nevronet og er avgjørende for riktig funksjon av Cl-homeostase og følgelig funksjonell GABAergisk inhibering 1,2,3,4. Opprettholdelsen av lav intranevronal Cl-konsentrasjon ([Cl-]i) ved 4-6 mM av KCC2 muliggjør γ-aminosmørsyre (GABA)/glycin hyperpolarisering og synaptisk hemming i hjernen og ryggmargen5. Svikt i riktig regulering av KCC2 har vært assosiert med forekomsten av flere nevrologiske sykdommer, inkludert epilepsi4. Videre har redusert KCC2-mediert Cl-ekstrudering og nedsatt hyperpolariserende GABAA og / eller glycinreseptormediert strøm vært involvert i epilepsi, nevropatisk smerte og spastisitet 6,7. Neuronal KCC2 er negativt modulert via fosforylering av viktige regulatoriske rester innenfor sitt C-terminale intracellulære domene av med-no-lysin (WNK)-STE20/SPS1-relatert prolin/alaninrikt (SPAK)/Oksidativt stressresponsivt (OSR) kinasesignalkompleks1, som letter opprettholdelsen av depolarisert GABA-aktivitet i umodne nevroner 2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1 fosforylerer treoninrester 906 og 1007 (Thr906/Thr1007) og nedregulerer deretter mRNA-genuttrykket til KCC2, noe som fører til en påfølgende forverring av dens fysiologiske funksjon 8,10. Enda viktigere er det imidlertid allerede et faktum at WNK-SPAK/OSR1-kinasekomplekset er kjent for å fosforylere og hemme KCC2-uttrykk 1,2,4,11,12, og at inhiberingen av kinasekompleksets signalveier til fosforylat Thr906/Thr1007 har vært knyttet til det økte uttrykket av KCC2 mRNA-genet13,14,15 . Det er viktig å merke seg at reguleringen av nevronal KCC2 og Na+-K+-2Cl- kotransportører 1 (NKCC1) ekspresjon via proteinfosforylering virker samtidig og i omvendte mønstre 1,4,16.
Det har vært konsekvent og betydelig fremgang med hensyn til forståelsen av mekanismer involvert i reguleringen av KCC2, akkreditert til utvikling av teknikker som gjør det mulig for forskere å studere sine funksjoner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering av kinasereguleringssteder fosforylering) eller indirekte (observasjon og overvåking av GABA-aktivitet) undersøkelser. Protokollen som presenteres her fremhever anvendelsen av vestlige blottingteknikker for å studere funksjonene og aktivitetene til neuronal K + -Cl- co-transporter KCC2 ved å undersøke fosforyleringen av kotransportøren på kinasereguleringssteder Thr906/1007.
Western blot er en metode som brukes til å oppdage spesifikke proteiner av interesse fra en prøve av vev eller celle. Denne metoden separerer først proteinene etter størrelse gjennom elektroforese. Proteinene overføres deretter elektroforetisk til en solid støtte (vanligvis en membran) før målproteinet merkes ved hjelp av et spesifikt antistoff. Antistoffene er konjugert til forskjellige koder eller fluoroforkonjugerte antistoffer som oppdages ved hjelp av enten kolorimetriske, kjemiluminescens- eller fluorescensmetoder. Dette gjør det mulig å oppdage et bestemt målprotein fra en blanding av proteiner. Denne teknikken har blitt brukt til å karakterisere fosfospesifikke steder av KCC1 og har blitt brukt til å identifisere kinasehemmere som hemmer KCC3 Thr991 / Thr1048 fosforylering17. Ved å følge denne protokollen kan man spesifikt oppdage total og fosforylert KCC2 fra celle/vevslysater. I prinsippet er påvisning av proteinkonjugerte antistoffer ved hjelp av denne teknikken svært instrumentell, da det bidrar til å forbedre forståelsen av samarbeidsaktiviteter på fosfo-stedene til KCC2, som kaster lys over de molekylære mekanismene som er involvert i deres fysiologiske forskrifter. Den kvantitative analysen av det totale proteinuttrykket er representativt for funksjonen og aktiviteten til KCC2. Det finnes andre klassiske metoder som brukes til å måle KCC2-aktivitet direkte, for eksempel rubidiumion og thalliumionopptaksanalyse. Ytterligere teknikker som patch-klemme-elektrofysiologi brukes til å måle GABA-aktivitet; derfor indirekte reflekterer aktivert og/eller inaktivert KCC2 som informert av vurderingen av intracellulær kloridionhomeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen beskriver den vestlige blottingmetoden for å oppdage spesifikke proteiner av interesse.
1. Cellekultur og transfeksjon
- Varm alle reagensene i perlebadet (37 °C) før cellekulturprosedyren. Forbered kulturmedium, Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% hver av 2mM L-glutamin, 100x ikke-essensiell aminosyre, 100 mM natriumpyruvat og 100 enheter / ml penicillin-streptomycin.
- Tin stabilt transfisert rotte KCC2b human embryonal nyre 293 celler (HEK293rnKCC2b)18 helt i perlebadet (37 °C). Overfør cellene fra kryovisavet til et sentrifugerrør som inneholder 5 ml friske medier. Spinn cellen ved 1200 ×g i 3-5 min.
- Bruk en aspiratorpipette (festet til en vakuumpumpe) til å aspirere supernatanten og tilsett 10 ml friske medier for å suspendere cellene igjen. Overfør cellesuspensjonen til en 10 cm tallerken.
- Plasser parabolen i inkubatoren og la den vokse i 48 timer ved 37 ° С i en fuktet 5% CO2 atmosfære. Overvåk inkubasjonsperioden for å sikre sunn cellevekst. Videre splitte cellene når de har oppnådd over 90% sammenløp etter inkubasjonsperioden.
- Aspirer det gamle mediet ut fra celleskålen og skyll forsiktig cellene med 2 ml fosfatbuffersaltvann (PBS). Tilsett 2 ml trypsin og inkuber i ca 1-2 minutter ved romtemperatur.
- Bruk 2 ml komplette medier for å vaske forsiktig de trypsiniserte cellene i parabolen. Tilsett 9 ml ferske medier til nye retter og tilsett 1 ml løsning fra den gamle retten til hver av de nye. Overfør oppvasken med delte celler tilbake til inkubatoren i 48 timer for å oppnå ≥ 90% sammenheng.
- Behandle cellene med enten dimetylsulfoksid (DMSO) som kontroll, 8 μM staurosporin eller 0,5 mM N-etylmaleimid (NEM) i 15 minutter før cellene høstes i lysisbuffer.
2. Fremstilling av cellelysater og belastningsprøver
- Aspirer media på kulturskålen (fra transfeksjonsprosedyrer). Plasser cellekulturen på is og vask cellene med iskald PBS.
- Aspirer PBS, tilsett deretter 1,0 ml iskald lysisbuffer som inneholder 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N′,N′-tetraeddiksyre (EGTA), 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 50 mM natriumfluorid, 5 mM natriumpyrofosfat, 10 mM natrium-β-glycerofosfat, 1 mM natriumortovanadat, 1% (w/v) Triton X-100, 0,27 M sukrose, 1 mM benzamin, 0,1% (v/v) 2-merkaptoetanol og 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) til parabolen.
MERK: Volumet av lysisbuffer under cellehøsting varierer med tallerkenstørrelser, for eksempel er 1 ml lysisbuffer egnet per 1 x 107 celler / 100 mm tallerken / 150 cm 2 kolbe, mens 0,5 ml er egnet per 5 x 106 celler / 60 mm tallerken / 75 cm2 kolbe. - Bruk en kald plastcelleskrape til å skrape cellene av bunnen av fatet, og bruk deretter forsiktig en pipette for å overføre cellesuspensjonen til et mikrosentrifugerrør som allerede er på is. Rør røret konstant i 30 minutter ved 4 °C.
- Spinn cellelysatene i en kald sentrifuge (4 °C) ved 16 000 x g i 20 minutter, fjern røret forsiktig fra sentrifugen og legg det på is. Samle supernatanten i et forkjølt ferskt rør og kast pelleten.
MERK: Det kan være nødvendig å variere sentrifugeringskraften og tiden avhengig av celletypen. Selv om generelle retningslinjer oppfordrer sentrifugering ved 16 000 x g i 20 minutter. Dette må imidlertid bestemmes for hvert eksperiment. For eksempel trenger delikate celler som leukocytter en veldig lett sentrifugeringshastighet.
3. Fremstilling av immunoprecipitants fra cellelysater
- Pipette 300 μL protein-G-sepharose inn i et mikrosentrifugerør. Spinn løsningen ved 500 x g i 2 minutter og kast supernatanten.
- Tilsett 500 μL PBS og vortex løsningen godt. Spinn løsningen ved 500 x g i 2 minutter og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet.
- Bland 1 mg anti-KCC2 Thr906 og anti-KCC2 Thr1007 antistoffer med 200 μL protein G-sepharose perler og utgjør volumet til 500 μL med PBS. Rist på en vibrerende plattform eller roterende hjul i 2 timer ved 4 °C. Vask 2x med PBS.
- Utfør proteinkvantifisering på hele cellelysatene og tilsett 1 mg av cellelysatet til de vaskede perlene. Inkuber forsiktig i en ende-til-ende-rotator i 2 timer ved 4 °C. Spinn ned perlene og vask dem 3x med PBS som inneholder 150 mM natriumklorid (NaCl).
- Vask immunoprecipitants (perler) 3x med 200 μL PBS. Resuspendere den endelige pelleten i 100 μL 1x litiumdodecylsulfat (LDS) prøvebuffer.
- Rist rørene i en rotor shaker ved romtemperatur i 5 min og inkuber dem i en varmeblokk ved 75 °C i 10 minutter. Sentrifuge lasteprøven ved 11 000 x g i 2 minutter og bruk supernatanten til gelbelastning.
4. Utføre den vestlige blot
- Monter støpeapparatet og hell nylaget 8% separeringsgel (se tabell 1 for oppskrift/tilberedning) for å støpe gelen slik at det er ca. 2 cm plass fra toppen av støpeglasset. Tilsett 200 μL absolutt isopropanol i oppsettet og la det stå ved romtemperatur i 60 minutter.
MERK: Polyakrylamidgeloppskriften for natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) avhenger av størrelsen på proteinet av interesse (tabell 2). Noter derfor proteinstørrelsen før du bestemmer ønsket gelprosent. - Bruk en pipette for å fjerne isopropanol og skyll gelen forsiktig med ca. 200 μL destillert vann. Tilsett nylaget 6% stablegel (se tabell 1 for oppskrift/tilberedning) for å fylle opp ca. 2 cm plass på støpeoppsettet. Pass forsiktig i brønnkammen og la stå ved romtemperatur i 30 minutter.
- Fest den støpte gelen i elektroforesetanken.
- Oppløs 30,3 g Tris base, 144,1 g glycin og 10 g SDS i 1000 ml destillert vann for å forberede 10x overføringsbuffer. Forbered 1x løpende buffer ved å legge til 10 ml 10 % SDS og 100 ml 10x overføringsbuffer til 890 ml destillert vann.
- Hell 1x løpende buffer i tanken. Legg 5 μL molekylvektmarkør i den første brønnen og en lik mengde protein i hver brønn i SDS-PAGE-gelen (mellom 18-30 μL, avhengig av kamstørrelsen som brukes). Fyll opp tomme brønner med 1x LDS og kjør gelen i ca 90-120 min ved 120 V.
- Oppløs 58,2 g Tris base og 29,3 g glycin i 1000 ml destillert vann for å forberede 10x overføringsbuffer. Aktiver nitrocellulosemembran med 1x overføringsbuffer som inneholder 20% metanol. Skyll gelen og membranen med overføringsbufferen og spred dem forsiktig ut på forberedelsesbunken.
MERK: Det er ikke nødvendig å justere pH-verdien i løpe- og overføringsbufferne, da de skal være på den optimale pH-verdien som kreves. Det anbefales også å forberede disse bufferne og lagre dem ved romtemperatur før eksperimentet for å spare tid. - Ordne smørbrødet som skal overføres i denne rekkefølgen: negativ elektrode (svart ramme / slutt) - sandwichskum - filterpapir - skyllet SDS-PAGE gel - skyllet nitrocellulosemembran - filterpapir - sandwichskum - positiv elektrode (rød ramme). Stable den monterte sandwichen i overføringstanken og kjør på 90 V i 90 minutter eller 30 V i 360 min.
5. Antistofffarging og bildeutvikling
- Fjern membranen og la den tørke. Blokker membranen i 1 time ved romtemperatur ved hjelp av en blokkeringsbuffer laget av 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann som inneholder 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
- Inkuber membranene med passende fortynninger av primært antistoff 8,15,19 og beta-aktin (belastningskontroll) i blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C. Vask membranen i tre vasker på 1x TBS-T i 5 minutter hver.
MERK: Inkubasjonen av den separate membranen med belastningskontroller som beta-aktin, alfa-tubulin eller glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase antistoffer er å normalisere de andre vestlige blottingresultatene under etterfølgende kvantifisering. Den anbefalte fortynningen for hvert primære antistoff er tilgjengelig i produsentens håndbok. - Inkuber den vaskede membranen med sekundært antistoff fortynnet 5000 ganger i blokkeringsbuffer i 60 minutter ved romtemperatur. Igjen, vask membranen 3x i 1x TBS-T i 5 minutter hver.
MERK: Det anbefales på det sterkeste at det sekundære antistoffet heves mot arten der det primære antistoffet heves. For eksempel, hvis det primære antistoffet til total KCC2 er mus anti-KCC2, må det sekundære antistoffet for anti-mus brukes. - Plasser den vaskede membranen på bildekortet. Bland like store mengder av hvert forbedret kjemiluminescens (ECL) reagens og spre forsiktig den blandede løsningen på membranen for å utvikle signaler.
6. Bildeinnsamling ved hjelp av et bildebehandlingssystem og datakvantifisering
- Overfør bildekortet til riktig rom på bildesystemet for avbildning. Åpne bildebehandlingsprogramvaren på datamaskinen for bildebehandling.
- Klikk på Ny protokoll på verktøylinjen, og velg Én kanal. Klikk Velg under dialogboksen Gelavbildning/program, bla til Blot og velg enten Chemi Hi Sensitivity eller Chemi Hi Resolution. Klikk deretter på Signal Accumulation Setup for å angi varighet og antall bilder som skal skaffes.
- Klikk på Plasser gel under protokolloppsett og juster gelen i bildesystemet om nødvendig. Klikk Kjør protokoll for å hente bildene.
- Høyreklikk på et av de anskaffede bildene under bildekatalogboksen for å lagre bildene på datamaskinen. Naviger til ønsket bilde og klikk på Velg bilde og Fortsett under dialogboksen Kjør.
- Klikk på Image Transform-ikonet for å justere kontrasten og pikselmetningen til bildet. Klikk på Skjermbilde ikonet på den generelle verktøylinjen for å lagre bildet på datamaskinen, avhengig av ønsket bildeformat.
- Mål båndtetthetene ved hjelp av ImageJ-programvare og analyser ved hjelp av passende statistiske verktøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her undersøkte det representative resultatet presentert i figur 1 virkningen av staurosporin og NEM på WNK-SPAK/OSR1-mediert fosforylering av KCC2 og NKCC1 i HEK293-cellelinjer som stabilt uttrykker KCC2b (HEKrnKCC2b)18 ved hjelp av western blotting-teknikken. Omfattende detaljer om de representative resultatene er omtalt i Zhang et al.15. I likhet med NEM er staurosporin en bred kinasehemmer som kan øke KCC2-transportaktiviteten og hemme NKCC1-aktiviteten15,20. Behandlingen av HEK293-celler med staurosporin og NEM forårsaket redusert fosforylering på SPAK-målsteder - Thr233 som ligger i T-loop-kinasedomenet og S-loop-fosforyleringsstedet Ser373 av hsSPAK. Dermed forkortet begge forbindelsene fosforyleringsnivåene til de nevnte SPAK-fosfo-stedene. Staurosporin reduserte også fosforyleringen av Ser940 i HEKrnKCC2b, men NEM økte fosforyleringen betydelig. Videre reduserer staurosporin fosforylering på Thr505-stedet, mens NEM forårsaket en liten, men ubetydelig økning i fosforylering på samme sted. De differensielle effektene av begge forbindelsene på fosforylering av proteinkinase C (PKC) på Thr505-stedet, og KCC2b på Ser940-stedet, korrelerer godt. Det representative resultatet viste også at begge midlene endret uttrykket av total rnKCC2b, hsNKCC1 eller hsSPAK. NEM (men ikke staurosporinbehandling) forårsaket en signifikant økning i ekspresjonen av den totale KCC2-mengden, mens ekspresjonen av total NKCC1 og SPAK ikke ble signifikant endret ved behandling med begge forbindelser. Videre forårsaket de to forbindelsene en redusert fosforylering av SPAK på Thr233- og Ser373-steder, og dette korrelerte med den forkortede fosforyleringen av Thr906 / Thr1007 og Thr203/207/212-steder i henholdsvis rnKCC2b og hsNKCC1. I tillegg reduserte og økte staurosporin og økning fosforyleringen av PKC på Ser940-stedet i henholdsvis rnKCC2b, som korrelerte med reduksjonen og økningen i fosforyleringen av PKC-δ på Thr505-stedet ved henholdsvis staurosporin- og NEM-behandling (figur 1).
Figur 1: Kvantitative analyser av rn KCC2b og hsNKCC1 fosfo-steder ved staurosporin- og NEM-behandling i HEK rn KCC2b-celler. (A) Stabilt transfiserte HEK rnKCC2b-celler ble behandlet med DMSO (kontroll), 8 μM staurosporin eller 0,5 mM NEM i 15 minutter. Cellelysater ble høstet og utsatt for immunprecipitasjon (IP) og immunblot (IB) med indikerte antistoffer. Forkortelser: D = dimerisk KCC2; M = monomer KCC2. (B) Immunoblotkvantifisering av stabilt transfiserte HEKrnKCC2b-celler. Bandintensiteter ble kvantifisert med ImageJ-programvare. p < 0,001; **p < 0,01; Wilcoxon-Mann Whitney test (n = 6). Dette tallet er modifisert fra Zhang et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 8 ml 8 % separerende gel | 5 ml 6 % stablegel | ||
| Nødvendige materialer | Volum (μL) | Nødvendige materialer | Volum (μL) |
| Destillert H2O | 4200 | Destillert H2O | 2900 |
| 40% akrylamid | 1600 | 40% akrylamid | 750 |
| 1,5 M Tris pH 8,8 | 2000 | 0,5 m Tris pH 6,8 | 1250 |
| 10% SDS | 80 | 10% SDS | 50 |
| 10% APS | 80 | 10% APS | 50 |
| TEMED | 8 | TEMED | 5 |
| Å lage separeringsgelen: | |
| 1) | Begynn med 4,2 ml ddH2O |
| 2) | Tilsett 1,6 ml 40 % akrylamid/bis-akrylamidoppløsning |
| 3) | Tilsett 2 ml 1,5 M Tris pH 8,8 og bland |
| 4) | Bland i 80 μL på 10% SDS |
| 5) | Når den er klar til bruk, tilsett 8 μL TEMED og bland |
| 6) | Tilsett 80 μL med 10 % APS* og bland |
| Å lage stablingsgelen: | |
| 1) | Begynn med 2,9 ml ddH2O |
| 2) | Tilsett 0,75 ml 40 % akrylamid/bis-akrylamidoppløsning |
| 3) | Tilsett 1,25 ml 0,5 m Tris pH 6,8 og bland |
| 4) | Bland i 50 μL 10% SDS |
| 5) | Når den er klar til bruk, tilsett 5 μL TEMED og bland |
| 6) | Tilsett 50 μL med 10 % APS* og bland |
| SDS = Natriumdodecylsulfat | |
| APS = Ammonium per sulfat | |
| TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-tetrametyletylendiamin | |
| *Ved tilsetning av APS skal oppløsningen umiddelbart helles i støpeapparatet fordi løsningen polymeriseres i løpet av få minutter. Derfor anbefales det å forberede separerings- og stablingsgelløsningene omtrent når løsningene trengs. | |
Tabell 1 Oppskrift på å lage polyakrylamidgelblanding (separering og stabling av gelløsninger).
| Gelprosent (%) | Protein størrelse (kDa) |
| Opptil 20 | 4 til 40 |
| 15 | 12 til 45 |
| 12.5 | 10 til 70 |
| 10 | 15 til 100 |
| 8 | 50 til 200 |
| 4 til 6 | > 200 |
Tabell 2 Anbefalt SDS-PAGE gelprosent for forskjellige størrelser proteiner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange metoder har blitt brukt til å måle aktivitetene til SLC12 av CCC som uttrykkes i nevronene, inkludert KCC2. Mange av disse teknikkene har vist seg å øke vitenskapelig kunnskap om analysen av den funksjonelle relevansen til disse transportørene og deres strukturfunksjonsmønstre i forskjellige sykdomsrelaterte mutasjoner. Kritisk er det fordeler og forbehold ved de ulike metodene21. Protokollen forklart ovenfor skisserte imidlertid hvordan man vurderer KCC2-fosforylering på kinasereguleringssteder, Thr906 og Thr1007, ved bruk av western blot, noe som kan være nyttig for å studere funksjonene og aktivitetene til KCC2.
Reguleringen av KCC2 skjer gjennom fosforylering og defosforylering ved viktige serin-/treoninrester1. Western blotting er en effektiv teknikk som kan brukes til å undersøke KCC2 fosforylering på kinase reguleringssteder på Thr906 og Thr1007. I prinsippet påvises endringer i fosforylering av KCC2 ved bruk av fosfospesifikke antistoffer rettet mot fosfopeptider av immunblottprøvene/proteinene av interesse. Western blot er en metode som brukes til å oppdage det spesifikke proteinet av interesse fra en prøve av vev eller celle. Denne metoden separerer først proteinene etter størrelse gjennom elektroforese. Proteinene overføres deretter elektroforetisk til en solid støtte (vanligvis en membran) før målproteinet merkes ved hjelp av et spesifikt antistoff. Antistoffene er konjugert til forskjellige koder eller fluoroforkonjugerte antistoffer som oppdages ved hjelp av enten kolorimetriske, kjemiluminescens- eller fluorescensmetoder. Dette gjør det mulig å oppdage et bestemt målprotein fra en blanding av proteiner. Denne teknikken har blitt brukt til å karakterisere fosfospesifikke steder av KCC2 2,8 og har blitt brukt til å identifisere hemmere av KCC2 som motvirker KCC2 Thr906 / Thr1007 fosforylering15. HEK293-linjer har vært i bruk for flere eksperimenter på grunn av deres fordel i molekylærbiologiske eksperimenter. De er raske å reprodusere, enkle å vedlikeholde og svært effektive for transfeksjon og proteinproduksjon22. Noen meninger mener imidlertid at det kanskje ikke er den mest egnede kandidaten for å utføre nevrobiologiske eksperimenter fordi det ikke er en celle hentet fra hjernen, og dermed kan dens fysiologiske spesifisitet være tvilsom i nevrovitenskapsforskning. Tidligere arbeider har imidlertid vist at lignende resultater observeres i uttrykket av KCC2 i HEK293-celler og faktiske nevronvev / celler15,23. Derfor kan relevansen av HEK293 i nevrovitenskapelig forskning ikke forkastes direkte.
I studier som involverer analyse av proteinuttrykk ved vestlig blottingteknikk, bør det tas særlig hensyn til valg av lysisbuffersammensetning, arten (type og konsentrasjon) av vaskemiddelet som skal brukes24, og proteasehemmerne. Sammensetningen av bufferen må optimaliseres for å passe til målproteinet for å lette dets oppløseliggjørings- og ekstraksjonsprosesser, og for å tillate enkel deteksjon av western blot25. Mildt vaskemiddel ved lav konsentrasjon er vanligvis nødvendig for løselige proteiner, mens membranproteiner kan kreve sterkere vaskemiddelforhold. Imidlertid kan sterke vaskemidler forstyrre interaksjoner og komplekser kan gå tapt. Begge typer og konsentrasjoner av vaskemidlene kan påvirke proteinets art og aktivitet, og det er derfor nødvendig å holde seg til et begrenset/tolerert konsentrasjonsområde for disse vaskemidlene. Tilsetningen av proteaseinhibitor vil avverge at målproteinet nedbrytes av endogene proteiner, og den optimale anbefalte arbeidstemperaturen er 4 ° C for effektivt å redusere proteolytiske hastigheter. Noen ganger, i et forsøk på å oppnå høykvalitets immunoblotsignaler for antistoffer som gir dårlige immunoblotsignaler, utføres immunoprecipitation (IP) som et oppstrømseksperiment for vestlig blotting. Denne teknikken er fordelaktig fordi den letter samspillet mellom antigener og deres respektive antistoffer i deres opprinnelige konformasjon før deres påfølgende separasjon og kvantifisering26. Derfor kan IP forbedre kvaliteten på utganger fra western blotting prosedyrer. Før anvendelsen av IP-teknikken er det viktig å vurdere tilstedeværelsen og effektiviteten av ekspresjon av koimmunopresipiterte partnerproteiner i lysatet ved å analysere enten hele cellelysatet eller inngangsfraksjonene ved vestlig blotting. Videre er forkunnskaper om molekylvekten til proteinet som skal undersøkes nødvendig før man fremstiller de ønskede prosentgelløsningene for SDS-PAGE elektroforese, da størrelsen på proteinet påvirker sikteffekten av gelmatrisen.
Selv om deteksjon av proteinkonjugerte antistoffer ved denne teknikken er svært instrumentell, da det bidrar til å forbedre forståelsen av samarbeidsaktiviteter på fosfo-stedene til KCC2 som kan gi informasjon om kotransportørfosforylering og integriteten til signalveien som kan regulere kotransportørene, for en pålitelig prediksjon av kotransportøraktivitet. Det er imidlertid viktig å merke seg at western blot-teknikken bare er i stand til å produsere semi-kvantitative data, noe som betyr at teknikken bare fremhever den relative vurderingen av proteinuttrykk, men ikke absolutt kvantifisering. Dette er akkreditert til avvik i prisene for prøvelasting og overføring i separate baner, som er forskjellige på individuelle flekker. Det oppdagede signalet som genereres er heller ikke lineært og reflekterer ikke konsentrasjonsområdet for prøver27. Dessuten kan fosforyleringsstatus ikke være en pålitelig faktor for rapportering av proteinaktivitet, da intervensjoner som hemmere, mutasjoner og proteininteraksjoner med miljøet direkte kan påvirke proteinaktiviteten uten å endre fosforyleringsnivået28,29,30. Dermed kan det være mer fordelaktig å bruke fosfospesifikke antistoffer for å supplere andre biokjemiske metoder.
Som nevnt tidligere er det andre klassiske metoder som brukes til å måle KCC2-aktivitet direkte. Vurderingen av KCC2 ved måling av radioaktiv 86Rb + fluks gjennom membranen til homogene cellepreparater er en populær tilnærming. Denne metoden bruker aktive radioisotoper som sporstoffer ved å føre dem gjennom ioniske kanaler. Kort fortalt inkuberes cellene av interesse i kationfrie løsninger for å hemme endogen KCC2, etterfulgt av inkubasjon med spesifikke hemmere som ouabain, og deretter med opptaksmedium som inneholder inhibitoren og 86Rb +. Flytende scintillasjonstellere brukes til å måle/spore aktiviteter som følger med cellelyse. Selv om denne metoden er robust, svært følsom og selektiv og er mindre utsatt for forstyrrelser. Imidlertid strekker applikasjonene seg ikke til vev med flere celletyper som hjerne- eller nevronkulturer. Videre begrenser denne teknikken endringer i oppløsningen av ionkonsentrasjon på subcellulært nivå. Videre er det sikkerhetsproblemer med hensyn til potensiell toksisitet og helsefare ved arbeid med kort halveringstid (18,65 dager) radioisotoper karakterisert med høy energiutslipp (maks. 1,77 MeV; maks 1,08 MeV)31. Dette kan massivt antyde en uegnethet for nevroncellestudier der høyt antall celler vanligvis kreves. Disse problemene fører til utviklingen av den ikke-radioaktive 85Rb + effluksanalysen av Terstappen 1999, som et alternativ til den radioaktive 86Rb + for bestemmelse av ionflukser. Den ikke-radioaktive tilnærmingen har i stor grad forvist de radioaktive 86Rb + -analysene for analyse av K + og ikke-selektive kationkanaler i farmasøytisk industri31. Ikke-radioaktiv 85Rb + effluksanalyse involverer to hovedprosesser, den første er cellekultur og manipulasjon og den andre er bestemmelse av tracer rubidium ved atomabsorpsjonsspektroskopi (AAS). Denne metoden er enkel å bruke, men den krever en rekke analysevalideringseksperimenter og lider av dårlig tidsmessig oppløsning32. Likevel har ikke-radioaktiv 85Rb+ effluksanalyse gradvis vist seg å være en pålitelig teknikk for vurdering av KCC og NKCCs33.
Thallium (TI+)-fluksanalysen bruker TI+ som surrogation for K+ på grunn av sin høye bindingsaffinitet til K+-området på KCC2 og NKCC2. TI+-tilstrømning til celler kunne påvises ved hjelp av et thalliumfølsomt fluorescerende fargestoff som benzothiazolcoumarin og fluozin-2. Når det er transportert av kanalen, kan TI + assosiere med BTC / fluozin-2-fargestoffet som forårsaker en fluorescerende forandring som kan detekteres av fluorometrisk bildeplateleser31. TI + indikatorfargestoffer kommer inn i celler som acetoksymetylestere som deretter spaltes av cytoplasmatiske esteraser for å frigjøre de aktive fluorogene formene. For å aktivere KCC-ene stimuleres cellene med en blanding av K+ og Tl+ i nærvær eller fravær av testforbindelser (f.eks. KCC2-hemmere). Thallium kommer inn og binder seg til fluorescensfargestoffet. Økningen i fluorescerende signal er proporsjonal med tilstrømningen av Tl+ inn i cellen spesifikt gjennom kotransportøren, og representerer derfor en funksjonell måling av kotransportøraktiviteten. Denne metoden har også blitt godt anvendt ved måling av KCC2- og NKCC2-aktivitet i ulike typer cellekulturer, for eksempel studier på HEK293-cellelinje som stabilt uttrykker menneskelig KCC234. På en demerit-ende er det en rekke potensielle off-target-baner som kan forstyrre TI + -tilstrømningen, for eksempel kan Na + / K + ATPase i HEK293-celler forårsake en høyere falsk positiv eller falsk negativ treffrate35. Videre, som med andre fluksanalyser, forblir implementeringen av en slik tilnærming i nevronceller begrenset på grunn av dårlig overlevelse av nevronceller etter flere vasketrinn. Nevronuttrykket til flere K+-kanaler og transportør kan også hindre nøyaktig vurdering av KCC2-spesifikke K+-flukser. Denne teknikken presenterer begrensninger for studier av kanaler i små nevronrom som dendritter og dendritiske spines, og axonene skyldtes mangel på romlig oppløsning kombinert med lav tidsmessig oppløsning.
Ytterligere teknikker som patch-klemme-elektrofysiologi brukes til å måle GABA-aktivitet; derfor indirekte reflekterer aktivert og/eller inaktivert KCC2 som informert av vurderingen av intracellulær kloridionhomeostase. Generelt er elektrofysiologiske målinger av SLC12-funksjonen avhengig av prinsippet om at GABA A-reseptorene (GABAA R) er gjennomtrengelige for klorid36. KCC2 er nøkkelen i moduleringen av GABAergic inhibering. Spesielt ligger [Cl-]i-ekstruderingsaktiviteten til KCC2 til grunn for hyperpolariseringen av GABAAR6. Intracellulære opptak gir avgjørende innsikt gjennom ekstrapolering av kloridekstruderingskapasiteten til KCC2 fra reverseringen i potensialet til GABAAR-medierte strømmer (EGABA). En hyperpolarisert EGABA indikerer lavere [Cl-] i og dermed en økning i aktiviteten til KCC2. Gramicidin patch-clamp teknikk i elektrofysiologi er en gullstandard tilnærming for måling av GABA-aktivitet. Noen tidligere publiserte studier har brukt gramicidin patch-clamp opptak for å undersøke funksjonene og aktivitetene til KCC2 for å vurdere / overvåke [Cl-] i homeostase har faktisk vist seg vellykket 8,9,37,38,39,40 . Under et gramicidin-lappklemmeopptak opprettes en tett forsegling på celle- / vevsoverflaten ved hjelp av en glasselektrode med en relativ for å registrere den intracellulære aktiviteten til ionkanaler i referanse til en annen elektrode i et bad som omgir cellen / vevet. Denne teknikken kan utføres ved å måle mengden strøm som krysser en cellemembran ved en fast spenning i spenningsklemmemodus eller ved å registrere mengden spenning som beveger seg over membranen ved en fast strøm i gjeldende klemmemodus36. Flere varianter av den grunnleggende teknikken kan brukes som i stor grad avhenger av problemstillingen. Teknikken skaper ikke et relativt stort porelignende helcelleplasteropptak, men det poredannende antibiotikumet (gramicidin) som finnes i elektrodeløsningen brukes til å danne små porer i membranen36. Spesielt skaper tilsetningen av gramicidin kation-selektive porer i membranen, som utviser ubetydelig anionpermeabilitet. Spenningsrampeprotokoller er et effektivt og pålitelig alternativ til å registrere strømmen med jevn spenning. Strøm/ spenningsrelasjonene oppnådd med spenningsrampeprotokoller ser ut til å gi en bedre registrering av GABAAR-medierte membranstrømmer. I denne protokollen påføres en stadig skiftende, men overvåket spenning (med jevn hastighet), og strømmen måles kontinuerlig samtidig36,41. Under denne protokollen brukes anvendelsen av spenningspulser (vanligvis i hyperpolariserende retning) for å aktivere lekkasjestrømmen som et resultat av ohmske responser. Vanligvis beregnes GABAAR-medierte membranstrømmer ut fra lekkasjestrømmen (dvs. reverseringspotensialene til de lekkasje-subtraherte agoniststrømmene)36. Strømspenningsforeningene hentet fra denne protokollen bidrar til å gi en bedre forståelse av hvor endringene skjer i ionkonsentrasjoner under et eksperimentelt scenario som involverer GABA A-reseptorkanaler. Yelhekar et al.41 brukte en beregningsmodell for å vise at konklusjoner om stabile ionekonsentrasjoner fra interpolasjonsmetoden kanskje ikke er forsvarlige fordi det estimerte reverseringspotensialet fra metoden kan være feil.
Den gjennomsnittlige motstanden som brukes for de fleste opptak er 5 MΩ. Pipetter med lavere motstand på 3-4 MΩ kan resultere i lavere seriemotstand som er å foretrekke for spenningsklemmeopptak. Pipettens spiss vil imidlertid være sammenlignbart bredere for pipetter med høyere motstand, og som en konsekvens utgjør den en utfordring i form av vanskeligheter med tetningsdannelse og stabilitet36,42. Derfor er det nødvendig å overvåke GΩ-formasjonen for å oppnå opptak med en betydelig reduksjon i nivået av genererte støyende data. Robustheten til denne teknikken for å studere KCC2s funksjon og aktiviteter som bedømt av dens egnethet og pålitelighet ved måling av GABA-aktivitet, er bekreftet av flere studier. Tidligere studier har vist at [Cl-] i forblir stabil ved hjelp av denne teknikken ved å måle responsene til GABAARs (som er i stand til å gate kloridkonduktans) til sine respektive agonister. Underforstått kommer kontinuerlig elektrisk tilgang med liten eller ingen endring av intracellulær kloridkonsentrasjon43,44. Videre letter denne teknikken omgåelse av kunstige endringer i membranpotensial og E GABA underGABA A-R-aktivering (som åpner klorid- og bikarbonatkonduktans)45. Det nevnte gir denne teknikken et forsprang foran andre typer elektrofysiologiopptak. Begrensningene i denne teknikken inkluderer imidlertid følgende: (1) hyppig opptaksstøy kan oppstå på grunn av at spissen av elektroden opptar en del av membranen som kan redusere strømoppløsningen, og (2) perforering av membranen med gramicidin tar vanligvis relativt lengre tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av The Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094), og et Commonwealth Ph.D. Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
References
- de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
- Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
- Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
- Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
- Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
- Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
- Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
- Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
- Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
- Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
- Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
- AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
- Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
- Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
- Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
- Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
- Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
- Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
- Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
- Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
- Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
- Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
- Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
- Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
- Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
- Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
- Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
- Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
- Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
- Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
- Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
- Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
- Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
- Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
- Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
- Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
- Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
- Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
- Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).
