Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

دراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2 باستخدام النشاف الغربي

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64179
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

يسلط البروتوكول الحالي الضوء على تطبيق تقنية النشاف الغربي لدراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2. يصف البروتوكول التحقيق في فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز Thr906/1007 عبر النشاف الغربي. أيضا ، يتم تمييز طرق إضافية لتأكيد نشاط KCC2 لفترة وجيزة في هذا النص.

Abstract

الناقلات المشتركة لكلوريد البوتاسيوم 2 (KCC2) هي عضو في عائلة حاملات المذاب 12 (SLC12) من الناقلات المشتركة لكلوريد الكاتيون (CCCs) ، الموجودة حصريا في الخلايا العصبية وهي ضرورية للتشغيل السليم لتوازن Cl وبالتالي تثبيط GABAergic الوظيفي. الفشل في التنظيم السليم ل KCC2 ضار وقد ارتبط بانتشار العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك الصرع. وقد أحرز تقدم كبير فيما يتعلق بفهم الآليات التي ينطوي عليها تنظيم نظام KCC2، المعتمد لتطوير التقنيات التي تمكن الباحثين من دراسة وظائفه وأنشطته؛ إما عن طريق التحقيقات المباشرة (تقييم فسفرة المواقع التنظيمية للكيناز) أو التحقيقات غير المباشرة (مراقبة ومراقبة نشاط GABA). هنا ، يسلط البروتوكول الضوء على كيفية التحقيق في فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز - Thr906 و Thr1007 - باستخدام تقنية النشاف الغربية. هناك طرق كلاسيكية أخرى تستخدم لقياس نشاط KCC2 مباشرة ، مثل أيون الروبيديوم ومقايسة امتصاص أيون الثاليوم. يتم استخدام تقنيات أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية المشبك لقياس نشاط GABA. ومن ثم ، تعكس بشكل غير مباشر KCC2 المنشط و / أو المعطل كما هو موضح في تقييم توازن أيون الكلوريد داخل الخلايا. ستتم مناقشة بعض هذه التقنيات الإضافية بإيجاز في هذه المخطوطة.

Introduction

الناقلات المشتركة لكلوريد البوتاسيوم 2 (KCC2) هي عضو في عائلة حاملات المذاب 12 (SLC12) من الناقلات المشتركة لكلوريد الكاتيون (CCCs) ، الموجودة حصريا في الخلايا العصبية وهي ضرورية للتشغيل السليم لتوازن Cl- وبالتالي تثبيط GABAergic الوظيفي1،2،3،4. إن الحفاظ على تركيز Cl- منخفض داخل الخلايا العصبية ([Cl-]i) عند 4-6 مللي متر بواسطة KCC2 يسهل γ-aminobutyric acid (GABA) / فرط استقطاب الجلايسين وتثبيط متشابك في الدماغ والحبل الشوكي5. ارتبط الفشل في التنظيم السليم ل KCC2 بانتشار العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك الصرع4. علاوة على ذلك ، فإن انخفاض قذف Cl− بوساطة KCC2 وضعف فرط استقطاب GABAA و / أو التيارات بوساطة مستقبلات الجلايسين متورطة في الصرع وآلام الأعصاب والتشنج 6,7. يتم تعديل الخلايا العصبية KCC2 بشكل سلبي عن طريق فسفرة المخلفات التنظيمية الرئيسية داخل المجال داخل الخلايا الطرفية C بواسطة مركب إشارات كيناز كيناز1 المرتبط بالبرولين / الألانين الغني بالألانين (SPAK) / المستجيب للإجهاد التأكسدي (OSR) 1 ، والذي يسهل الحفاظ على نشاط GABA غير المستقطب في الخلايا العصبية غير الناضجة2،8،9 . يقوم WNK-SPAK / OSR1 بفسفرة بقايا ثريونين 906 و 1007 (Thr906 / Thr1007) وبالتالي يقلل من تنظيم التعبير الجيني mRNA ل KCC2 ، مما يؤدي إلى تدهور لاحق في وظيفته الفسيولوجية 8,10. والأهم من ذلك ، أنه من المعروف بالفعل أن مركب كيناز WNK-SPAK / OSR1 معروف بالفسفرة وتثبيطتعبير KCC2 1،2،4،11،12 ، وأن تثبيط مسارات إشارات مجمع الكيناز لفسفرة Thr906 / Thr1007 قد تم ربطه بزيادة التعبير عن جين KCC2 mRNA 13،14،15 . من المهم ملاحظة أن تنظيم التعبير العصبي KCC2 و Na + -K + -2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) عبر فسفرة البروتين يعمل بشكل متزامن وفي أنماط عكسية1،4،16.

وقد أحرز تقدم ثابت وكبير فيما يتعلق بفهم الآليات التي ينطوي عليها تنظيم نظام KCC2، المعتمد لتطوير التقنيات التي تمكن الباحثين من دراسة وظائفه وأنشطته؛ إما عن طريق التحقيقات المباشرة (تقييم فسفرة المواقع التنظيمية للكيناز) أو التحقيقات غير المباشرة (مراقبة ومراقبة نشاط GABA). يسلط البروتوكول المقدم هنا الضوء على تطبيق تقنيات النشاف الغربية لدراسة وظائف وأنشطة الناقل العصبي K + -Cl- co-transporter KCC2 من خلال التحقيق في فسفرة الناقل المشترك في المواقع التنظيمية للكيناز Thr906/1007.

اللطخة الغربية هي طريقة تستخدم للكشف عن بروتينات معينة ذات أهمية من عينة من الأنسجة أو الخلية. تفصل هذه الطريقة أولا البروتينات حسب الحجم من خلال الرحلان الكهربائي. ثم يتم نقل البروتينات كهربائيا إلى دعامة صلبة (عادة غشاء) قبل تمييز البروتين المستهدف باستخدام جسم مضاد معين. يتم اقتران الأجسام المضادة بعلامات مختلفة أو أجسام مضادة مترافقة بالفلوروفور يتم اكتشافها باستخدام طرق القياس اللوني أو التلألؤ الكيميائي أو التألق. هذا يسمح باكتشاف بروتين مستهدف محدد من خليط من البروتينات. وقد استخدمت هذه التقنية لتوصيف المواقع الفوسفاتية النوعية ل KCCs1 واستخدمت لتحديد مثبطات الكيناز التي تثبط فسفرة KCC3 Thr991/Thr104817. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يكتشف على وجه التحديد KCC2 الكلي والمفسفر من تحلل الخلايا / الأنسجة. من حيث المبدأ ، يعد اكتشاف الأجسام المضادة المترافقة بالبروتين بواسطة هذه التقنية مفيدا للغاية لأنه يساعد على تحسين فهم الأنشطة التعاونية في مواقع الفوسفو في KCC2 ، والتي تلقي الضوء على الآليات الجزيئية المشاركة في لوائحها الفسيولوجية. يمثل التحليل الكمي للتعبير الكلي للبروتين وظيفة ونشاط KCC2. هناك طرق كلاسيكية أخرى تستخدم لقياس نشاط KCC2 مباشرة ، مثل أيون الروبيديوم ومقايسة امتصاص أيون الثاليوم. يتم استخدام تقنيات أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية المشبك لقياس نشاط GABA. ومن ثم ، تعكس بشكل غير مباشر KCC2 المنشط و / أو المعطل كما هو موضح في تقييم توازن أيون الكلوريد داخل الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يصف البروتوكول طريقة النشاف الغربي للكشف عن بروتينات معينة ذات أهمية.

1. ثقافة الخلية والنقل

  1. قم بتسخين جميع الكواشف في حمام الخرز (37 درجة مئوية) قبل إجراء زراعة الخلية. تحضير وسط الاستزراع ، وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ لكل من 2mM L-glutamine ، 100x حمض أميني غير أساسي ، 100 mM بيروفات الصوديوم ، و 100 وحدة / مل بنسلين ستربتومايسين.
  2. ذوبان الفئران المنقولة بثبات KCC2b الكلى الجنينية البشرية 293 خلية (HEK293rnKCC2b)18 تماما في حمام حبة (37 درجة مئوية). نقل الخلايا من أنبوب التبريد إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 5 مل من الوسائط الطازجة. أدر الخلية على 1200 × جم لمدة 3-5 دقائق.
  3. استخدم ماصة شفاط (مثبتة بمضخة تفريغ) لشفط المادة الطافية وإضافة 10 مل من الوسائط الطازجة لإعادة تعليق الخلايا. انقل معلق الخلية إلى طبق 10 سم.
  4. ضع الطبق في الحاضنة واتركه ينمو لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 . مراقبة فترة الحضانة لضمان نمو الخلايا الصحية. مزيد من تقسيم الخلايا عندما تصل إلى أكثر من 90 ٪ التقاء بعد فترة الحضانة.
  5. قم بشفط الوسائط القديمة من طبق الخلايا وشطف الخلايا برفق باستخدام 2 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS). أضف 2 مل من التربسين واحتضانه لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. استخدم 2 مل من الوسائط الكاملة لغسل خلايا التربسين برفق في الطبق. أضف 9 مل من الوسائط الطازجة إلى الأطباق الجديدة وأضف محلول 1 مل من الطبق القديم إلى كل طبق جديد. انقل أطباق الخلية المنقسمة مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة للوصول إلى التقاء ≥ 90٪.
  7. عالج الخلايا إما باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كعنصر تحكم ، أو 8 ميكرومتر ستوروسبورين ، أو 0.5 مللي متر N-ethylmaleimide (NEM) لمدة 15 دقيقة قبل حصاد الخلايا في محلول التحلل.

2. تحضير محللات الخلايا وتحميل العينات

  1. استنشاق وسائل الإعلام على طبق الثقافة (من إجراءات النقل). ضع ثقافة الخلية على الثلج واغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج.
  2. قم بشفط برنامج تلفزيوني ، ثم أضف 1.0 مل من محلول التحلل البارد بالثلج الذي يحتوي على 50 مللي مول من tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 1 مللي مول من جلايكول إيثيلين مكرر (β-أمينو إيثيل إيثر) -N ، N ، N ′ ، N′-حمض رباعي الخليك (EGTA) ، 1 مللي متر حمض إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، 50 مللي مول فلوريد الصوديوم ، 5 مللي مول بيروفوسفات الصوديوم ، 10 مللي مول صوديوم β جليسيروفوسفات ، 1 مللي متر أورثوفانادات الصوديوم ، 1٪ (وزن / حجم) تريتون X-100 ، 0.27 م سكروز ، 1 ملي متر بنزامين ، 0.1٪ (v / v) 2-ميركابتو إيثانول ، و 2 ملي مول فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) إلى الطبق.
    ملاحظة: يختلف حجم محلول التحلل أثناء حصاد الخلايا باختلاف أحجام الأطباق ، على سبيل المثال ، 1 مل من محلول التحلل مناسب لكل 1 × 107 خلايا / طبق 100 مم / 150 سم 2 دورق ، بينما 0.5 مل مناسب لكل 5 × 106 خلايا / طبق 60 مم / 75 سم2 قارورة.
  3. استخدم مكشطة الخلايا البلاستيكية الباردة لكشط الخلايا من قاع الطبق ، ثم استخدم ماصة برفق لنقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق موجود بالفعل على الجليد. حرك الأنبوب باستمرار لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بتدوير الخلية في جهاز طرد مركزي بارد (4 درجات مئوية) عند 16000 × جم لمدة 20 دقيقة ، وقم بإزالة الأنبوب برفق من جهاز الطرد المركزي ، وضعه على الثلج. اجمع المادة الطافية في أنبوب طازج مبرد مسبقا وتخلص من الحبيبات.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري تغيير قوة الطرد المركزي والوقت حسب نوع الخلية. على الرغم من ذلك ، تشجع الإرشادات العامة على الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 20 دقيقة. ومع ذلك ، يجب تحديد هذا لكل تجربة. على سبيل المثال ، تحتاج الخلايا الحساسة مثل الكريات البيض إلى سرعة طرد مركزي خفيفة للغاية.

3. تحضير المرسبات المناعية من محللات الخلايا

  1. ماصة 300 ميكرولتر من البروتين-G-sepharose في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أدر المحلول في 500 × جم لمدة 2 دقيقة وتخلص من المادة الطافية.
  2. أضف 500 ميكرولتر من PBS ودوامة الحل جيدا. أدر المحلول في 500 × جم لمدة 2 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة.
  3. امزج 1 ملغ من الأجسام المضادة المضادة ل KCC2 Thr906 والأجسام المضادة ل KCC2 Thr1007 مع 200 ميكرولتر من حبات البروتين G-sepharose وقم بتكوين الحجم إلى 500 ميكرولتر مع PBS. رج العبوة على منصة اهتزازية أو عجلة دوارة لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. اغسل 2x مع برنامج تلفزيوني.
  4. إجراء قياس كمية البروتين على محللات الخلية بأكملها وإضافة 1 ملغ من محللة الخلية إلى الخرز المغسول. احتضن بلطف في دوار من طرف إلى طرف لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. قم بتدوير الخرز واغسله 3x باستخدام PBS الذي يحتوي على 150 مللي مول كلوريد الصوديوم (NaCl).
  5. غسل المرسبات المناعية (الخرز) 3x مع 200 ميكرولتر من PBS. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 100 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت لعينة كبريتات دوديسيل الليثيوم (LDS).
  6. رج الأنابيب في شاكر دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق واحتضانها في كتلة تسخين عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي لعينة التحميل عند 11000 × جم لمدة 2 دقيقة واستخدم المادة الطافية لتحميل الهلام.

4. أداء اللطخة الغربية

  1. قم بتجميع جهاز الصب واسكب جل فصل 8٪ طازج (انظر الجدول 1 للحصول على الوصفة / التحضير) لصب الجل مما يسمح بحوالي 2 سم من المساحة من أعلى زجاج الصب. أضف 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المطلق إلى الإعداد واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: تعتمد وصفة هلام بولي أكريلاميد للرحلان الكهربائي لكبريتات دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد جل (SDS-PAGE) على حجم البروتين محل الاهتمام (الجدول 2). ومن ثم ، قم بتدوين حجم البروتين قبل تحديد نسبة الجل المطلوبة.
  2. استخدم ماصة لإزالة الأيزوبروبانول وشطف الجل بعناية بحوالي 200 ميكرولتر من الماء المقطر. أضف جل التراص الطازج بنسبة 6٪ (انظر الجدول 1 للوصفة / التحضير) لملء مساحة 2 سم تقريبا في إعداد الصب. ضع مشط البئر برفق واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. ثبت الجل المصبوب في خزان الرحلان الكهربائي.
  4. قم بإذابة 30.3 جم من قاعدة Tris ، و 144.1 جم من الجلايسين ، و 10 جم من SDS في 1000 مل من الماء المقطر لتحضير محلول نقل 10x. قم بإعداد مخزن مؤقت تشغيل واحد عن طريق إضافة 10 مل من 10٪ SDS و 100 مل من مخزن نقل 10x إلى 890 مل من الماء المقطر.
  5. صب 1x تشغيل العازلة في الخزان. قم بتحميل 5 ميكرولتر من علامة الوزن الجزيئي في البئر الأول وكمية متساوية من البروتين في كل بئر من هلام SDS-PAGE (بين 18-30 ميكرولتر ، اعتمادا على حجم المشط المستخدم). املأ الآبار الفارغة ب 1x LDS وقم بتشغيل الجل لمدة 90-120 دقيقة عند 120 فولت.
  6. قم بإذابة 58.2 جم من قاعدة Tris و 29.3 جم من الجلايسين في 1000 مل من الماء المقطر لتحضير محلول نقل 10x. تنشيط غشاء النيتروسليلوز مع 1x نقل عازلة تحتوي على 20 ٪ الميثانول. شطف الجل والغشاء مع المخزن المؤقت للنقل ونشرها برفق على كومة التحضير.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لضبط الأس الهيدروجيني للمخازن المؤقتة للتشغيل والنقل حيث يجب أن تكون عند الرقم الهيدروجيني الأمثل المطلوب. أيضا ، ينصح بإعداد هذه المخازن المؤقتة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة قبل التجربة لتوفير الوقت.
  7. رتب الساندويتش المراد نقله بهذا الترتيب: قطب سالب (إطار / نهاية أسود) - رغوة ساندويتش - ورق ترشيح - جل SDS-PAGE مغسول - غشاء نيتروسليلوز مغسول - ورق ترشيح - رغوة شطيرة - قطب موجب (إطار أحمر). قم بتكديس الساندويتش المجمع في خزان النقل وقم بتشغيله بسرعة 90 فولت لمدة 90 دقيقة أو 30 فولت لمدة 360 دقيقة.

5. تلطيخ الأجسام المضادة وتطوير الصورة

  1. قم بإزالة الغشاء واتركه يجف. سد الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام عازل مانع مصنوع من حليب منزوع الدسم بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن يحتوي على 0.1٪ 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. احتضان الأغشية مع التخفيفات المناسبة من الجسم المضاد الأولي8،15،19 وبيتا أكتين (التحكم في التحميل) في حجب المخزن المؤقت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الغشاء في ثلاث غسلات من 1x TBS-T لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: إن حضانة الغشاء المنفصل مع أدوات التحكم في التحميل مثل بيتا أكتين أو ألفا توبولين أو الأجسام المضادة لنازعة هيدروجين الجلسرين 3-فوسفات هو تطبيع نتائج النشاف الغربية الأخرى أثناء القياس الكمي اللاحق. يتوفر التخفيف الموصى به لكل جسم مضاد أساسي في دليل الشركة المصنعة.
  3. احتضان الغشاء المغسول بجسم مضاد ثانوي مخفف 5000 ضعف في المخزن المؤقت المانع لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الغشاء 3x في 1x TBS-T لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: يوصى بشدة برفع الجسم المضاد الثانوي ضد الأنواع التي ينشأ فيها الجسم المضاد الأساسي. على سبيل المثال ، إذا كان الجسم المضاد الأساسي لإجمالي KCC2 هو مضاد الماوس KCC2 ، فيجب استخدام الجسم المضاد الثانوي لمكافحة الماوس.
  4. ضع الغشاء المغسول على لوحة التصوير. امزج كميات متساوية من كل كاشف تلألؤ كيميائي محسن (ECL) وانشر المحلول المختلط برفق على الغشاء لتطوير الإشارات.

6. الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير وقياس البيانات

  1. انقل لوحة التصوير إلى المقصورة المناسبة في نظام التصوير للتصوير. افتح برنامج التصوير على الكمبيوتر لمعالجة الصور.
  2. على شريط الأدوات، انقر فوق بروتوكول جديد واختر قناة واحدة. انقر فوق تحديد ضمن مربع حوار التصوير / التطبيق الهلامي ، وقم بالتمرير إلى Blot وحدد إما حساسية Chemi Hi أو Chemi Hi Resolution. ثم انقر فوق إعداد تراكم الإشارة لتعيين مدة وعدد الصور المراد الحصول عليها.
  3. انقر فوق Position Gel ضمن إعداد البروتوكول واضبط الجل في نظام التصوير إذا لزم الأمر. انقر فوق تشغيل البروتوكول للحصول على الصور.
  4. انقر بزر الماوس الأيمن فوق إحدى الصور التي تم الحصول عليها ضمن مربع كتالوج الصور لحفظ الصور على الكمبيوتر. انتقل إلى الصورة المطلوبة وانقر على تحديد صورة ومتابعة ضمن مربع الحوار تشغيل.
  5. انقر على أيقونة تحويل الصورة لضبط التباين وتشبع البكسل للصورة. انقر على أيقونة لقطة الشاشة على شريط الأدوات العام لحفظ الصورة على الكمبيوتر اعتمادا على تنسيق الصورة المطلوب.
  6. قم بقياس كثافة النطاق باستخدام برنامج ImageJ والتحليل باستخدام الأدوات الإحصائية المناسبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا ، بحثت النتيجة التمثيلية المقدمة في الشكل 1 في تأثير staurosporine و NEM على الفسفرة بوساطة WNK-SPAK / OSR1 ل KCC2 و NKCC1 في خطوط خلايا HEK293 التي تعبر بثبات عن KCC2b (HEKrnKCC2b) 18 باستخدام تقنية النشاف الغربي. وترد مناقشة تفاصيل شاملة عن النتائج التمثيلية في Zhang et al.15. على غرار NEM ، فإن staurosporine هو مثبط كيناز واسع يمكن أن يعزز نشاط نقل KCC2 ويمنع نشاط NKCC115,20. تسببت معالجة خلايا HEK293 بالستوروسبورين و NEM في انخفاض الفسفرة في المواقع المستهدفة SPAK - Thr233 الموجودة في مجال كيناز T-loop وموقع الفسفرة S-loop Ser373 من hsSPAK. وهكذا ، اختصر كلا المركبين مستويات الفسفرة لمواقع فوسفو SPAK المذكورة أعلاه. أيضا ، قلل الستوروسبورين من فسفرة Ser940 في HEKrnKCC2b ، لكن NEM زاد بشكل كبير من الفسفرة. علاوة على ذلك ، يقلل الستوروسبورين من الفسفرة في موقع Thr505 ، بينما تسبب NEM في زيادة طفيفة ولكنها ضئيلة في الفسفرة في نفس الموقع. ترتبط التأثيرات التفاضلية لكلا المركبين على فسفرة بروتين كيناز C (PKC) في موقع Thr505 ، و KCC2b في موقع Ser940 ارتباطا جيدا. أظهرت النتيجة التمثيلية أيضا أن كلا العاملين غيرا التعبير الكلي rnKCC2b أو hsNKCC1 أو hsSPAK. تسبب NEM (ولكن ليس علاج staurosporine) في زيادة كبيرة في التعبير عن إجمالي كمية KCC2 ، في حين أن التعبير الكلي NKCC1 و SPAK لم يتغير بشكل كبير عند معالجته بكلا المركبين. علاوة على ذلك ، تسبب المركبان في انخفاض فسفرة SPAK في مواقع Thr233 و Ser373 ، وهذا مرتبط بالفسفرة المختصرة لمواقع Thr906 / Thr1007 و Thr203/207/212 في rnKCC2b و hsNKCC1 ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، قلل الستوروسبورين و NEM من فسفرة PKC وزاداها في موقع Ser940 في rnKCC2b ، على التوالي ، والذي ارتبط بالتقليل والزيادة في فسفرة PKC-δ في موقع Thr505 عند معالجة staurosporine و NEM ، على التوالي (الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1: التحليلات الكمية لمواقع الفوسفو rn KCC2b و hsNKCC1 عند علاج الستوروسبورين و NEM في خلايا HEK rn KCC2b. (أ) عولجت خلايا HEK rnKCC2b المنقولة بثبات باستخدام DMSO (السيطرة) ، أو 8 ميكرومتر من الستوروسبورين ، أو 0.5 مللي متر NEM لمدة 15 دقيقة. تم حصاد محللات الخلايا وتعريضها لهطول مناعي (IP) و immunoblot (IB) مع الأجسام المضادة المشار إليها. الاختصارات: D = ثنائي KCC2 ؛ M = أحادي KCC2. (ب) القياس الكمي للبقع المناعية لخلايا HEKrnKCC2b المنقولة باستقرار. تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ. ص < 0.001 ؛ ** ص < 0.01 ؛ اختبار ويلكوكسون مان ويتني (ن = 6). تم تعديل هذا الرقم من Zhang et al.15. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

8 مل من 8٪ جل فصل 5 مل من 6٪ جل التراص
المواد اللازمة الحجم (ميكرولتر) المواد اللازمة الحجم (ميكرولتر)
H2O المقطر 4200 H2O المقطر 2900
40٪ أكريلاميد 1600 40٪ أكريلاميد 750
1.5 م تريس درجة الحموضة 8.8 2000 0.5 م تريس درجة الحموضة 6.8 1250
10٪ SDS 80 10٪ SDS 50
10٪ APS 80 10٪ APS 50
تيميد 8 تيميد 5
صنع جل الفصل:
1) ابدأ ب 4.2 مل من ddH2O
2) أضف 1.6 مل من محلول الأكريلاميد / ثنائي الأكريلاميد بنسبة 40٪
3) أضف 2 مل من 1.5 M Tris pH 8.8 واخلطه
4) مزيج في 80 ميكرولتر من 10 ٪ SDS
5) عندما تكون جاهزا للاستخدام ، أضف 8 ميكرولتر من TEMED واخلطه
6) أضف 80 ميكرولتر من 10٪ APS * واخلط
صنع جل التراص:
1) ابدأ ب 2.9 مل من ddH2O
2) أضف 0.75 مل من محلول الأكريلاميد / ثنائي الأكريلاميد بنسبة 40٪
3) أضف 1.25 مل من 0.5 M Tris pH 6.8 واخلطه
4) مزيج في 50 ميكرولتر من 10 ٪ SDS
5) عندما تكون جاهزا للاستخدام ، أضف 5 ميكرولتر من TEMED واخلطه
6) أضف 50 ميكرولتر من 10٪ APS * واخلطه
SDS = كبريتات دوديسيل الصوديوم
APS = الأمونيوم لكل كبريتات
TEMED = N، N، Nʹ، Nʹ-رباعي ميثيل إيثيلين ديامين
* عند إضافة APS ، يجب سكب المحلول على الفور في جهاز الصب لأن المحلول يتبلمر في غضون دقائق قليلة. وبالتالي ، ينصح بإعداد محاليل جل الفصل والتكديس عند الحاجة إلى الحلول.

الجدول 1: وصفة لصنع مزيج هلام بولي أكريلاميد (فصل وتكديس حلول هلام).

نسبة الجل (٪) حجم البروتين (كيلو دالتون)
حتى 20 4 إلى 40
15 12 إلى 45
12.5 10 إلى 70
10 15 إلى 100
8 50 إلى 200
4 إلى 6 > 200

الجدول 2: نسبة جل SDS-PAGE الموصى بها لأحجام مختلفة من البروتينات

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم استخدام العديد من الطرق لقياس أنشطة SLC12 من CCCs التي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية ، بما في ذلك KCC2. وقد ثبت أن العديد من هذه التقنيات تعزز المعرفة العلمية بشأن تحليل الأهمية الوظيفية لهذه الناقلات وأنماط هيكلها الوظيفي في مختلف الطفرات المرتبطة بالمرض. بشكل حاسم ، هناك مزايا ومحاذير للطرق المختلفة21. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الموضح أعلاه ، حدد كيفية تقييم فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز ، Thr906 و Thr1007 ، باستخدام اللطخة الغربية ، والتي يمكن أن تكون مفيدة في دراسة وظائف وأنشطة KCC2.

يحدث تنظيم KCC2 من خلال الفسفرة وإزالة الفسفرة عند بقايا سيرين / ثريونين الرئيسية1. النشاف الغربي هو تقنية فعالة يمكن استخدامها للتحقيق في فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز في Thr906 و Thr1007. من حيث المبدأ ، يتم الكشف عن التغيرات في فسفرة KCC2 باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو الموجهة ضد الببتيدات الفوسفو لعينات / بروتينات المناعة ذات الأهمية. اللطخة الغربية هي طريقة تستخدم للكشف عن البروتين المحدد محل الاهتمام من عينة من الأنسجة أو الخلية. تفصل هذه الطريقة أولا البروتينات حسب الحجم من خلال الرحلان الكهربائي. ثم يتم نقل البروتينات كهربائيا إلى دعامة صلبة (عادة غشاء) قبل تمييز البروتين المستهدف باستخدام جسم مضاد معين. يتم اقتران الأجسام المضادة بعلامات مختلفة أو أجسام مضادة مترافقة بالفلوروفور يتم اكتشافها باستخدام طرق القياس اللوني أو التلألؤ الكيميائي أو التألق. هذا يسمح باكتشاف بروتين مستهدف محدد من خليط من البروتينات. تم استخدام هذه التقنية لتوصيف المواقع الفوسفاتية ل KCC2 2,8 وتم استخدامها لتحديد مثبطات KCC2 التي تعادي فسفرة KCC2 Thr906 / Thr100715. تم استخدام خطوط HEK293 في العديد من التجارب بسبب ميزتها في تجارب البيولوجيا الجزيئية. فهي سريعة التكاثر وسهلة الصيانة وذات كفاءة عالية للنقل وإنتاج البروتين22. ومع ذلك ، ترى بعض الآراء أنها قد لا تكون المرشح الأنسب لإجراء تجارب البيولوجيا العصبية لأنها ليست خلية مصدرها الدماغ ، وبالتالي قد تكون خصوصيتها الفسيولوجية موضع شك في أبحاث علم الأعصاب. ومع ذلك ، فقد أظهرت الأعمال السابقة أن نتائج مماثلة لوحظت في التعبير عن KCC2 في خلايا HEK293 والأنسجة / الخلايا العصبية الفعلية15،23. وبالتالي ، قد لا يتم تجاهل أهمية HEK293 في أبحاث علم الأعصاب تماما.

في الدراسات التي تنطوي على تحليل تعبير البروتين بواسطة تقنية النشاف الغربية ، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لاختيار تكوين عازلة التحلل ، وطبيعة (نوع وتركيز) المنظف الذي سيتم استخدامه24 ، ومثبطات الأنزيم البروتيني. يجب تحسين تركيبة المخزن المؤقت لتناسب البروتين المستهدف لتسهيل عمليات الذوبان والاستخراج ، وللسماح باكتشافه بسهولة بواسطة اللطخة الغربية25. عادة ما يكون المنظف المعتدل بتركيز منخفض مطلوبا للبروتينات القابلة للذوبان ، بينما قد تتطلب البروتينات الغشائية ظروف منظف أقوى. ومع ذلك ، قد تعطل المنظفات القوية التفاعلات وقد تفقد المجمعات. قد يؤثر كلا النوعين والتركيزات من المنظفات على طبيعة ونشاط البروتين ، وبالتالي ، هناك حاجة للالتزام بنطاق مقيد / مقبول من التركيزات لهذه المنظفات. ستؤدي إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني إلى تجنب البروتين المستهدف من التحلل بواسطة البروتينات الداخلية ، ودرجة حرارة العمل المثلى الموصى بها هي 4 درجات مئوية لخفض معدلات تحلل البروتين بشكل فعال. في بعض الأحيان ، في محاولة لتحقيق إشارات مناعية عالية الجودة للأجسام المضادة التي تعطي إشارات ضعيفة للبقع المناعية ، يتم إجراء الترسيب المناعي (IP) كتجربة أولية للنشاف الغربي. هذه التقنية مفيدة لأنها تسهل التفاعل بين المستضدات والأجسام المضادة الخاصة بها في شكلها الأصلي الذي يسبق الانفصال والقياس الكمي اللاحق26. ومن ثم، قد تعزز الملكية الفكرية جودة النواتج من إجراءات النشاف الغربية. قبل تطبيق تقنية IP ، من المهم تقييم وجود وكفاءة التعبير عن بروتينات الشريك المترسب المناعي المشترك في المحللة عن طريق تحليل إما محللة الخلية بأكملها أو كسور الإدخال عن طريق النشاف الغربي. علاوة على ذلك ، من الضروري معرفة مسبقة بالوزن الجزيئي للبروتين المراد فحصه قبل تحضير محاليل هلام النسبة المئوية المطلوبة للرحلان الكهربائي SDS-PAGE لأن حجم البروتين يؤثر على تأثير الغربلة لمصفوفة الهلام.

على الرغم من ذلك ، فإن الكشف عن الأجسام المضادة المترافقة بالبروتين بواسطة هذه التقنية مفيد للغاية لأنه يساعد على تحسين فهم الأنشطة التعاونية في مواقع الفوسفو في KCC2 والتي قد توفر معلومات حول فسفرة الناقل المشترك وسلامة مسار الإشارات الذي قد ينظم الناقلات المشتركة ، من أجل التنبؤ الموثوق بنشاط الناقل المشترك. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن تقنية اللطخة الغربية قادرة فقط على إنتاج بيانات شبه كمية ، مما يعني أن التقنية تسلط الضوء فقط على التقييم النسبي لتعبيرات البروتين ولكن ليس القياس الكمي المطلق. هذا معتمد على التناقضات في معدلات تحميل العينات ونقلها في ممرات منفصلة ، والتي تختلف في البقع الفردية. كما أن الإشارة المكتشفة المتولدة ليست خطية ولا تعكس نطاق تركيز العينات27. إلى جانب ذلك ، قد لا تكون حالة الفسفرة عاملا موثوقا به للإبلاغ عن نشاط البروتين لأن التدخلات مثل المثبطات والطفرات وتفاعلات البروتين مع بيئتها يمكن أن تؤثر بشكل مباشر على نشاط البروتين دون تغيير مستوى الفسفرة28،29،30. وبالتالي ، قد يكون من المفيد استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو لتكملة الطرق الكيميائية الحيوية الأخرى.

كما ذكرنا سابقا ، هناك طرق كلاسيكية أخرى تستخدم لقياس نشاط KCC2 مباشرة. يعد تقييم KCC2 من خلال قياس التدفق المشع 86Rb + من خلال غشاء مستحضرات الخلايا المتجانسة نهجا شائعا. تستخدم هذه الطريقة النظائر المشعة النشطة كمتتبعات عن طريق تمريرها عبر القنوات الأيونية. باختصار ، يتم تحضين الخلايا ذات الأهمية في محاليل خالية من الكاتيون لتثبيط KCC2 الداخلي ، تليها الحضانة مع مثبطات محددة مثل ouabain ، ثم مع وسط امتصاص يحتوي على المانع و 86Rb +. تستخدم عدادات التلألؤ السائل لقياس / تتبع الأنشطة تتمة لتحلل الخلية. على الرغم من أن هذه الطريقة قوية وحساسة للغاية وانتقائية وأقل عرضة للاضطرابات. ومع ذلك ، فإن تطبيقاته لا تمتد إلى الأنسجة ذات أنواع الخلايا المتعددة مثل مزارع الدماغ أو الخلايا العصبية. علاوة على ذلك ، تقيد هذه التقنية التغييرات في دقة تركيز الأيونات على المستوى تحت الخلوي. وعلاوة على ذلك، هناك قضايا تتعلق بالسلامة فيما يتعلق بالسمية المحتملة والمخاطر الصحية للعمل مع نظائر مشعة قصيرة نصف العمر (18.65 يوما) تتميز بانبعاث طاقة مرتفع (بحد أقصى 1.77 ميجا فولت؛ بحد أقصى 1.08 ميجا فولت)31. قد يشير هذا بشكل كبير إلى عدم ملاءمة دراسات الخلايا العصبية حيث عادة ما تكون هناك حاجة إلى عدد كبير من الخلايا. تؤدي هذه المشكلات إلى تطوير مقايسة التدفق غير المشع 85Rb + بواسطة Terstappen 1999 ، كبديل ل 86Rb + المشع لتحديد تدفقات الأيونات. أدى النهج غير المشع إلى نفي مقايسات 86Rb + المشعة إلى حد كبير لتحليل K + وقنوات الكاتيون غير الانتقائية في صناعة الأدوية31. يتضمن فحص التدفق غير المشع 85Rb + عمليتين رئيسيتين ، الأولى هي زراعة الخلايا والتلاعب والثانية هي تحديد الروبيديوم المقتفي بواسطة التحليل الطيفي للامتصاص الذري (AAS). هذه الطريقة سهلة الاستخدام ، على الرغم من أنها تتطلب عددا من تجارب التحقق من صحة الفحص وتعاني من ضعف الدقة الزمنية32. ومع ذلك ، فقد ثبت تدريجيا أن مقايسة التدفق غير المشعة 85Rb + هي تقنية موثوقة لتقييم KCCs و NKCCs33.

يستخدم مقايسة تدفق الثاليوم (TI +) TI + كأيون بديل ل K + نظرا لتقاربه العالي مع موقع K + على KCC2 و NKCC2. يمكن الكشف عن تدفق TI + إلى الخلايا باستخدام صبغة فلورية حساسة للثاليوم مثل البنزوثيازول كومارين وفلوزين -2. بمجرد نقلها بواسطة القناة ، قد ترتبط TI + بصبغة BTC / fluozin-2 مما يتسبب في تغيير الفلورسنت الذي يمكن اكتشافه بواسطة قارئ لوحة التصوير الفلوري31. تدخل أصباغ مؤشر TI + الخلايا كاسترات أسيتوكسي ميثيل والتي يتم شقها بعد ذلك بواسطة استرات السيتوبلازم لإطلاق الأشكال الفلورية النشطة. لتنشيط KCCs ، يتم تحفيز الخلايا بمزيج من K + و Tl + في وجود أو عدم وجود مركبات اختبار (على سبيل المثال ، مثبطات KCC2). يدخل الثاليوم ويرتبط بصبغة التألق. تتناسب الزيادة في إشارة الفلورسنت مع تدفق Tl + إلى الخلية على وجه التحديد من خلال الناقل المشترك ، وبالتالي تمثل قياسا وظيفيا لنشاط الناقل المشترك. تم تطبيق هذه الطريقة أيضا بشكل جيد في قياس نشاط KCC2 و NKCC2 في أنواع مختلفة من مزارع الخلايا ، على سبيل المثال ، دراسات على خط خلية HEK293 يعبر بثبات عن KCC234 البشري. في نهاية النقص ، هناك مجموعة متنوعة من خطوط المسارات المحتملة خارج الهدف والتي يمكن أن تتداخل مع تدفق TI + ، على سبيل المثال ، يمكن أن يتسبب Na + / K + ATPase في خلايا HEK293 في ارتفاع معدل إصابة إيجابي كاذب أو سلبي كاذب35. علاوة على ذلك ، كما هو الحال مع فحوصات التدفق الأخرى ، يظل تنفيذ هذا النهج في الخلايا العصبية محدودا بسبب ضعف بقاء الخلايا العصبية بعد خطوات غسيل متعددة. يمكن أن يؤدي التعبير العصبي لقنوات K + المتعددة والناقل أيضا إلى إعاقة التقييم الدقيق لتدفقات K + الخاصة ب KCC2. تمثل هذه التقنية قيودا على دراسة القنوات في المقصورة العصبية الصغيرة مثل الزوائد الشجيرية والعمود الفقري التغصني ، والمحاور بسبب نقص الدقة المكانية إلى جانب الدقة الزمنية المنخفضة.

يتم استخدام تقنيات أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية المشبك لقياس نشاط GABA. ومن ثم ، تعكس بشكل غير مباشر KCC2 المنشط و / أو المعطل كما هو موضح في تقييم توازن أيون الكلوريد داخل الخلايا. بشكل عام ، تعتمد القياسات الكهربية لوظيفة SLC12 على مبدأ أن مستقبلات GBAA (GABAAR) قابلة للنفاذ إلى الكلوريد36. KCC2 هو المفتاح في تعديل تثبيط GABAergic. على وجه الخصوص ، فإن نشاط البثق [Cl-] i ل KCC2 يكمن وراء فرط استقطاب GABAAR6. توفر التسجيلات داخل الخلايا رؤى مهمة من خلال استقراء قدرة بثق الكلوريد ل KCC2 من الانعكاس في إمكانات التيارات بوساطة GABAAR (EGABA). يشير EGABA مفرط الاستقطاب إلى انخفاض [Cl-] i وبالتالي زيادة في نشاط KCC2. تقنية Gramicidin patch-clamp في الفيزيولوجيا الكهربية هي نهج قياسي ذهبي لقياس نشاط GABA. استخدمت بعض الدراسات المنشورة سابقا تسجيل مشبك التصحيح gramicidin للتحقيق في وظائف وأنشطة KCC2 لتقييم / مراقبة [Cl-] لقد أثبت التوازن الناجح بالفعل8،9،37،38،39،40 . أثناء تسجيل مشبك التصحيح gramicidin ، يتم إنشاء ختم محكم على سطح الخلية / الأنسجة باستخدام قطب زجاجي مع رقعة نسبية لتسجيل النشاط داخل الخلايا للقنوات الأيونية في إشارة إلى قطب كهربائي آخر في الحمام المحيط بالخلية / الأنسجة. يمكن إجراء هذه التقنية عن طريق قياس كمية التيار التي تعبر غشاء الخلية بجهد ثابت في وضع مشبك الجهد أو عن طريق تسجيل مقدار الجهد الذي يتحرك عبر الغشاء بتيار ثابت في وضع المشبك الحالي36. يمكن تطبيق العديد من الاختلافات في التقنية الأساسية والتي تعتمد إلى حد كبير على سؤال البحث. لا تخلق هذه التقنية تسجيلا كبيرا نسبيا للخلية الكاملة يشبه المسام ، ولكن يتم استخدام المضاد الحيوي المكون للمسام (gramicidin) الموجود في محلول القطب لتشكيل مسام صغيرة في الغشاء36. على وجه الخصوص ، فإن إضافة gramicidin يخلق المسام الانتقائية الكاتيونية في الغشاء ، والتي تظهر نفاذية أنيون ضئيلة. تعد بروتوكولات منحدر الجهد بديلا فعالا وموثوقا لتسجيل التيار بجهد ثابت. يبدو أن علاقات التيار / الجهد التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكولات منحدر الجهد تعطي تسجيلا أفضل لتيارات الغشاء بوساطة GABAAR. في هذا البروتوكول ، يتم تطبيق جهد متغير باستمرار ولكن مراقب (بمعدل ثابت) ويتم قياس التيار باستمرار في وقت واحد36,41. خلال هذا البروتوكول ، يتم استخدام تطبيق نبضات الجهد (عادة في اتجاه فرط الاستقطاب) لتنشيط تيار التسرب نتيجة للاستجابات الأومية. عادة ، يتم حساب التيارات الغشائية بوساطة GABAAR من تيار التسرب (أي إمكانات الانعكاس لتيارات ناهض التسرب المطروح)36. تساعد ارتباطات الجهد الحالي التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول على توفير فهم أفضل لمكان حدوث التغييرات في تركيزات الأيونات خلال سيناريو تجريبي يتضمن قنوات مستقبلات GABAA. استخدم Yelhekar et al.41 نموذجا حسابيا لإظهار أن الاستنتاجات المتعلقة بتركيزات الأيونات المستقرة من طريقة الاستيفاء قد لا تكون مبررة لأن إمكانات الانعكاس المقدرة من الطريقة قد تكون غير صحيحة.

متوسط المقاومة المستخدمة لمعظم التسجيلات هو 5 MΩ. قد تؤدي الماصات ذات المقاومة المنخفضة من 3-4 MΩ إلى مقاومة سلسلة أقل وهو الأفضل لتسجيلات مشبك الجهد. ومع ذلك ، سيكون طرف الماصة أوسع نسبيا بالنسبة للماصات ذات المقاومة الأعلى ، ونتيجة لذلك ، فإنه يشكل تحديا في شكل صعوبة في تكوين الختم والاستقرار36,42. وبالتالي ، من الضروري مراقبة تشكيل GΩ للحصول على تسجيلات مع انخفاض كبير في مستوى البيانات الصاخبة التي تم إنشاؤها. تم تأكيد متانة هذه التقنية لدراسة وظيفة وأنشطة KCC2 كما تم الحكم عليها من خلال ملاءمتها وموثوقيتها في قياس نشاط GABA من خلال العديد من الدراسات. أظهرت الدراسات السابقة أن [Cl-] i تظل مستقرة باستخدام هذه التقنية عن طريق قياس استجابات GABAARs (القادرة على بوابة توصيل الكلوريد) إلى ناهضاتها الخاصة. ضمنيا ، يأتي الوصول الكهربائي المستمر مع تعديل ضئيل أو معدوم لتركيز الكلوريد داخل الخلايا43,44. علاوة على ذلك ، تسهل هذه التقنية التحايل على التغيرات الاصطناعية في إمكانات الغشاء و E GABA أثناء تنشيطGABA AR (الذي يفتح توصيل الكلوريد والبيكربونات)45. يوفر ما سبق ذكره هذه التقنية ميزة قبل الأنواع الأخرى من تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية. ومع ذلك ، فإن قيود هذه التقنية تشمل ما يلي: (1) قد تحدث ضوضاء تسجيل متكررة بسبب طرف القطب الذي يشغل جزءا من الغشاء مما قد يقلل من الدقة الحالية ، و (2) عادة ما يستغرق ثقب الغشاء باستخدام جراميسيدين وقتا أطول نسبيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الملكية في المملكة المتحدة (رقم المنحة. IEC \ NSFC \ 201094) ، ومنحة دكتوراه الكومنولث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 190،
دراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2 باستخدام النشاف الغربي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F.,… More

Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter