Summary
본 프로토콜은 뉴런 K-Cl 공동 수송체 KCC2의 기능 및 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다. 상기 프로토콜은 웨스턴 블로팅을 통한 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서의 KCC2 인산화의 조사를 기술한다. 또한 KCC2 활성을 확인하는 추가 방법이이 텍스트에서 간략하게 강조 표시됩니다.
Abstract
염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며, 뉴런에서만 발견되며 Cl- 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제에 필수적입니다. KCC2의 적절한 조절 실패는 해롭고 간질을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. KCC2의 규제와 관련된 메커니즘을 이해하는 것과 관련하여 상당한 진전이 있었으며, 연구자가 그 기능과 활동을 연구 할 수있는 기술 개발에 대한 인증을 받았습니다. 직접(키나아제 조절 부위 인산화 평가) 또는 간접(GABA 활성 관찰 및 모니터링) 조사를 통해 . 여기에서 프로토콜은 웨스턴 블로팅 기술을 사용하여 키나아제 조절 부위(Thr906 및 Thr1007)에서 KCC2 인산화를 조사하는 방법을 강조합니다. 루비듐 이온 및 탈륨 이온 흡수 분석과 같은 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다. 이러한 추가 기술 중 몇 가지가이 원고에서 간략하게 논의 될 것입니다.
Introduction
염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 뉴런에서만 발견되는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며 Cl- 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제 1,2,3,4에 필수적입니다. KCC2에 의한 4-6 mM에서의 낮은 뉴런 내 Cl- 농도 ([Cl-] i)의 유지는 뇌 및 척수에서 γ- 아미노 부티르산 (GABA) / 글리신 과분극 및 시냅스 억제를 촉진한다5. KCC2의 적절한 조절 실패는 간질4을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. 또한, 감소된 KCC2-매개 Cl- 압출 및 손상된 과분극 GABAA 및/또는 글리신 수용체 매개 전류는 간질, 신경병증성 통증 및 경직과 관련이 있습니다6,7. 뉴런 KCC2는 미성숙 뉴런에서 탈분극된 GABA 활성의 유지를 용이하게 하는 비-라이신(WNK)-STE20/SPS1 관련 프롤린/알라닌 풍부(SPAK)/산화 스트레스 반응성(OSR) 키나아제 신호 전달 복합체1에 의해 C-말단 세포 내 도메인 내의 주요 조절 잔기의 인산화를 통해 음성으로 조절됩니다. . WNK-SPAK/OSR1은 트레오닌 잔기 906 및 1007(Thr906/Thr1007)을 인산화하고, 이어서 KCC2의 mRNA 유전자 발현을 하향조절하여 결과적으로 생리적 기능을 저하시킨다8,10. 그러나 더 중요한 것은 WNK-SPAK/OSR1 키나아제 복합체가 KCC2 발현 1,2,4,11,12를 인산화 및 억제하는 것으로 알려져 있으며, Thr906/Thr1007을 인산화하는 키나아제 복합체 신호전달 경로의 억제가 KCC2 mRNA 유전자13,14,15의 발현 증가와 관련이 있다는 것은 이미 사실입니다. . 단백질 인산화를 통한 신경 KCC2 및 Na+-K+-2Cl- 공수송체 1(NKCC1) 발현의 조절은 수반 작용하고 반대 패턴 1,4,16으로 작용한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
KCC2의 규제와 관련된 메커니즘에 대한 이해와 관련하여 일관되고 상당한 진전이 있었으며, 연구자가 그 기능과 활동을 연구 할 수있는 기술 개발에 대한 인증을 받았습니다. 직접(키나아제 조절 부위 인산화 평가) 또는 간접(GABA 활성 관찰 및 모니터링) 조사를 통해 . 여기에 제시된 프로토콜은 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서 공수송체의 인산화를 조사함으로써 뉴런 K+-Cl- 공동 수송체 KCC2의 기능과 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다.
웨스턴 블롯은 조직 또는 세포의 샘플에서 관심있는 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 방법입니다. 이 방법은 먼저 전기 영동을 통해 단백질을 크기별로 분리합니다. 그런 다음 단백질은 특정 항체를 사용하여 표적 단백질을 표시하기 전에 고체 지지체(일반적으로 막)로 전기영동적으로 전달됩니다. 항체는 비색, 화학발광 또는 형광 방법을 사용하여 검출되는 상이한 태그 또는 형광단-접합된 항체에 접합된다. 이를 통해 단백질 혼합물에서 특정 표적 단백질을 검출 할 수 있습니다. 이 기술은 KCC1 의 인특이적 부위를 특성화하는 데 사용되었으며 KCC3 Thr991/Thr1048 인산화17을 억제하는 키나아제 억제제를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜을 따르면 세포/조직 용해물에서 전체 및 인산화된 KCC2를 특이적으로 검출할 수 있습니다. 원칙적으로이 기술에 의한 단백질 접합 항체의 검출은 생리적 조절과 관련된 분자 메커니즘을 밝히는 KCC2의 인 부위에서의 협력 활동에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이되므로 매우 중요합니다. 전체 단백질 발현의 정량 분석은 KCC2의 기능 및 활성을 대표한다. 루비듐 이온 및 탈륨 이온 흡수 분석과 같은 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다.
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Protocol
참고: 프로토콜은 관심 있는 특정 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅 방법을 설명합니다.
1. 세포 배양 및 형질감염
- 세포 배양 절차 전에 비드 배스(37°C)에서 모든 시약을 가온한다. 10 % 태아 소 혈청, 2mM L- 글루타민 각각 1 %, 100x 비 필수 아미노산, 100mM 나트륨 피루 베이트 및 100 단위 / mL 페니실린-스트렙토 마이신이 보충 된 배양 배지 인 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 준비합니다.
- 래트 KCC2b 인간 배아 신장 293 세포(HEK293rnKCC2b)18 를 비드 배스(37°C)에서 완전히 형질감염시켰다. 극저온 튜브에서 5mL의 새 배지가 들어 있는 원심분리 튜브로 세포를 옮깁니다. 셀을 1200 ×g에서 3-5 분 동안 돌립니다.
- 흡인기 피펫(진공 펌프에 고정)을 사용하여 상청액을 흡입하고 10mL의 새 배지를 추가하여 세포를 다시 부유시킵니다. 세포 현탁액을 10cm 접시에 옮깁니다.
- 접시를 인큐베이터에 넣고 가습 된 5 % CO2 분위기에서 37 °С에서 48 시간 동안 자라게합니다. 건강한 세포 성장을 보장하기 위해 잠복기를 모니터링합니다. 배양 기간 후에 90% 이상의 합류에 도달한 세포를 추가로 분할합니다.
- 세포 접시에서 오래된 배지를 흡인하고 2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 트립신 2mL를 넣고 실온에서 약 1-2분 동안 배양합니다.
- 2mL의 완전 배지를 사용하여 접시에서 트립신 세포를 부드럽게 씻습니다. 새 접시에 새 배지 9mL를 추가하고 기존 접시의 용액 1mL를 새 접시에 각각 추가합니다. 분할 된 세포 접시를 48 시간 동안 인큐베이터로 다시 옮겨 90 % 컨플루언시≥ 얻습니다.
- 세포를 용해 완충액에서 세포를 수확하기 전에 대조군으로 디메틸 설폭사이드(DMSO), 8μM 스타우로스포린 또는 0.5mM N-에틸말레이미드(NEM)로 15분 동안 처리합니다.
2. 세포 용해물 및 로딩 시료의 제조
- 배양 접시에서 배지를 흡인합니다 (형질 주입 절차에서). 세포 배양물을 얼음 위에 놓고 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척합니다.
- PBS를 흡인 한 다음 50mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1mM 에틸렌 글리콜 비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (EGTA), 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 50 mM 불화 나트륨, 5 mM 피로 인산 나트륨, 10 mM 나트륨 -β- 글리세로 포스페이트, 1 mM 나트륨 오르토 바나 데이트, 1 % (w / v) 트리톤 X-100, 0.27 M 자당, 1 mM 벤즈아민, 0.1 % (v / v) 2- 메르 캅토 에탄올 및 2 mM 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)를 접시에 넣습니다.
참고: 세포 수확 중 용해 완충액의 부피는 접시 크기에 따라 다릅니다(예: 1 x 107 cells/100mm dish/150 cm2 플라스크당 1mL의 용해 완충액이 적합하고 5 x 106 cells/60 mm dish/75 cm2 플라스크당 0.5mL가 적합합니다. - 차가운 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시 바닥에서 세포를 긁어낸 다음 피펫을 사용하여 셀 현탁액을 이미 얼음 위에 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 4 ° C에서 30 분 동안 튜브를 지속적으로 교반하십시오.
- 세포 용해물을 16,000 x g 의 차가운 원심분리기(4°C)에서 20분 동안 돌리고 원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거한 다음 얼음 위에 놓습니다. 상청액을 미리 냉각 된 신선한 튜브에 모으고 펠릿을 버립니다.
참고: 셀 유형에 따라 원심분리력과 시간을 변경해야 할 수도 있습니다. 그러나 일반적인 지침은 16,000 x g 에서 20분 동안 원심분리할 것을 권장합니다. 그러나 이것은 모든 실험에 대해 결정되어야합니다. 예를 들어, 백혈구와 같은 섬세한 세포는 매우 가벼운 원심분리 속도가 필요합니다.
3. 세포 용해물로부터 면역침전제의 제조
- 피펫 300 μL의 단백질-G-세파로스를 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 용액을 500 x g 에서 2분 동안 돌리고 상청액을 버립니다.
- 500μL의 PBS를 넣고 용액을 잘 와동시킵니다. 용액을 500 x g 에서 2분 동안 돌리고 상청액을 버립니다. 이 단계를 반복하십시오.
- 1mg의 항 -KCC2 Thr906 및 항 -KCC2 Thr1007 항체를 200μL의 단백질 G- 세파 로스 비드와 혼합하고 PBS로 부피를 500μL로 구성합니다. 진동 플랫폼 또는 회전 휠에서 4°C에서 2시간 동안 흔듭니다. PBS로 2 번 씻으십시오.
- 전체 세포 용해물에 대해 단백질 정량을 수행하고 세척된 비드에 1mg의 세포 용해물을 추가합니다. 종단 간 회전 장치에서 4 ° C에서 2 시간 동안 부드럽게 배양합니다. 비드를 스핀다운하고 150mM 염화나트륨(NaCl)이 포함된 PBS로 3배 세척합니다.
- 면역침전제(비드)를 200μL의 PBS로 3x 세척합니다. 최종 펠릿을 100μL의 1x 리튬 도데실 설페이트(LDS) 샘플 버퍼에 재현탁합니다.
- 실온에서 로터 셰이커에서 튜브를 5분 동안 흔들고 75°C의 가열 블록에서 10분 동안 배양합니다. 로딩 샘플을 11,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하고 겔 로딩을 위해 상청액을 사용합니다.
4. 웨스턴 블롯 수행
- 주조 장치를 조립하고 새로 준비된 8% 분리 젤(레시피/준비는 표 1 참조)을 부어 주조 유리 상단에서 약 2cm의 공간을 허용하는 겔을 주조합니다. 200μL의 절대 이소프로판올을 설정에 추가하고 실온에서 60분 동안 그대로 둡니다.
참고: 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 위한 폴리아크릴아미드 겔 제조법은 관심 단백질의 크기에 따라 다릅니다(표 2). 따라서 원하는 젤 비율을 결정하기 전에 단백질 크기를 기록해 두십시오. - 피펫을 사용하여 이소프로판올을 제거하고 약 200μL의 증류수로 젤을 조심스럽게 헹굽니다. 새로 준비한 6% 스태킹 젤(레시피/준비는 표 1 참조)을 추가하여 주조 설정에서 약 2cm 공간을 채웁니다. 잘 빗에 부드럽게 끼우고 실온에서 30 분 동안 방치하십시오.
- 주조 된 젤을 전기 영동 탱크에 고정하십시오.
- 트리스 염기 30.3g, 글리신 144.1g 및 SDS 10g을 증류수 1000mL에 용해시켜 10x 전달 완충액을 제조합니다. 890mL의 증류수에 10mL의 10% SDS와 100mL의 10x 전달 완충액을 추가하여 1x 실행 완충액을 준비합니다.
- 1x 실행 버퍼를 탱크에 붓습니다. 5μL의 분자량 마커를 첫 번째 웰에 넣고 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE 젤의 각 웰에 로드합니다(사용된 빗 크기에 따라 18-30μL 사이). 빈 우물을 1x LDS로 채우고 90V에서 약 120-120분 동안 젤을 실행합니다.
- 58.2g의 트리스 염기와 29.3g의 글리신을 1000mL의 증류수에 녹여 10x 전달 완충액을 준비합니다. 20 % 메탄올을 함유 한 1x 전달 완충액으로 니트로 셀룰로오스 막을 활성화하십시오. 전달 버퍼로 젤과 멤브레인을 헹구고 준비 스택에 부드럽게 펼칩니다.
참고: 실행 중인 버퍼 및 이송 버퍼의 pH는 필요한 최적의 pH에 있어야 하므로 조정할 필요가 없습니다. 또한 시간을 절약하기 위해 실험 전에 이러한 완충액을 준비하고 실온에서 보관하는 것이 좋습니다. - 음극(검은색 프레임/끝) - 샌드위치 폼 - 여과지 - 헹군 SDS-PAGE 젤 - 헹군 니트로셀룰로오스 멤브레인 - 여과지 - 샌드위치 폼 - 양극(빨간색 프레임) 순서로 전송할 샌드위치를 정렬합니다. 조립 된 샌드위치를 이송 탱크에 쌓고 90 분 동안 90 V 또는 30 분 동안 360 V에서 작동합니다.
5. 항체 염색 및 이미지 개발
- 멤브레인을 제거하고 건조시킵니다. 0.1% 1x Tween 20(1x TBS-T)을 함유하는 트리스-완충 식염수 중 5% 탈지유로 만든 블로킹 완충액을 사용하여 실온에서 1시간 동안 막을 차단한다.
- 1차 항체 8,15,19 및 베타-액틴(로딩 대조군)의 적절한 희석액과 함께 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 차단 완충액에서 배양합니다. 멤브레인을 1x TBS-T를 각각 5분 동안 세 번 세척하여 세척합니다.
참고: 베타-액틴, 알파-튜불린 또는 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 항체와 같은 로딩 대조군과 함께 분리된 막의 배양은 후속 정량화 동안 다른 웨스턴 블로팅 결과를 정상화하기 위한 것입니다. 각 1차 항체에 대한 권장 희석액은 제조업체 매뉴얼에서 확인할 수 있습니다. - 세척된 멤브레인을 블로킹 완충액에서 5000배 희석한 2차 항체와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션한다. 다시 멤브레인을 1x TBS-T에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
참고: 1차 항체가 제기된 종에 대해 2차 항체를 올려야 하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 총 KCC2의 1 차 항체가 마우스 항 -KCC2 인 경우 항 마우스에 대한 2 차 항체를 사용해야합니다. - 세척된 멤브레인을 이미징 보드에 놓습니다. 동일한 부피의 각 강화 화학발광(ECL) 시약을 혼합하고 혼합 용액을 멤브레인에 부드럽게 펴 신호를 발생시킵니다.
6. 이미징 시스템 및 데이터 정량화를 이용한 이미지 획득
- 이미징 보드를 이미징 시스템의 적절한 구획으로 옮겨 이미징합니다. 이미지 처리를 위해 컴퓨터에서 이미징 소프트웨어를 엽니다.
- 도구 모음에서 새 프로토콜을 클릭하고 단일 채널을 선택합니다. 젤 이미징/적용 대화 상자에서 선택을 클릭하고 블롯으로 스크롤한 다음 Chemi Hi 감도 또는 Chemi Hi 해상도를 선택합니다. 그런 다음 신호 누적 설정을 클릭하여 획득할 이미지의 지속 시간과 수를 설정합니다.
- 프로토콜 설정에서 젤 배치를 클릭하고 필요한 경우 이미징 시스템에서 젤 을 조정합니다. 프로토콜 실행을 클릭하여 이미지를 가져옵니다.
- 이미징 카탈로그 상자 아래에서 획득한 이미지 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 이미지를 컴퓨터에 저장합니다. 원하는 이미지로 이동하고 실행 대화 상자에서 이미지 선택 및 계속 을 클릭합니다.
- 이미지 변환 아이콘을 클릭하여 이미지의 대비와 픽셀 채도를 조정합니다. 일반 도구 모음에서 스크린 샷 아이콘을 클릭하여 원하는 이미지 형식에 따라 이미지를 컴퓨터에 저장합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도를 측정하고 적절한 통계 도구를 사용하여 분석합니다.
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Representative Results
여기서, 도 1에 제시된 대표적인 결과는 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 KCC2b(HEKrnKCC2b)18을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주에서 KCC2 및 NKCC1의 WNK-SPAK/OSR1 매개 인산화에 대한 스타우로스포린과 NEM의 영향을 조사하였다. 대표적인 결과에 대한 포괄적인 세부 사항은 Zhang et al.15에서 논의됩니다. NEM과 유사하게, 스타우로스포린은 KCC2 수송 활성을 향상시키고 NKCC1 활성을 억제할 수 있는 광범위한 키나아제 억제제이다15,20. HEK293 세포를 스타우로스포린 및 NEM으로 처리하면 T-루프 키나아제 도메인에 위치한 Thr233 및 hsSPAK의 S-루프 인산화 부위 Ser373인 SPAK 표적 부위에서 인산화가 감소했습니다. 따라서, 두 화합물 모두 전술한 SPAK 포스포-사이트의 인산화 수준을 요약하였다. 또한, 스타우로스포린은 HEKrnKCC2b에서 Ser940의 인산화를 감소시켰지만, NEM은 그의 인산화를 유의하게 증가시켰다. 또한, 스타우로스포린은 Thr505 부위에서 인산화를 감소시키는 반면, NEM은 동일한 부위에서 인산화를 약간이지만 미미하게 증가시켰다. Thr505 부위에서 단백질 키나아제 C (PKC)의 인산화에 대한 두 화합물의 차별적 효과와 Ser940 부위의 KCC2b는 잘 상관 관계가 있습니다. 대표적인 결과는 또한 두 제제 모두 총 rnKCC2b, hsNKCC1 또는 hsSPAK의 발현을 변경시키는 것으로 나타났다. NEM (스타우로 스포린 처리는 아님)은 총 KCC2 양의 발현을 유의하게 증가시킨 반면, 총 NKCC1 및 SPAK의 발현은 두 화합물로 처리했을 때 유의하게 변하지 않았다. 또한, 두 화합물은 Thr233 및 Ser373 부위에서 SPAK의 인산화를 감소시켰고, 이는 각각 rnKCC2b 및 hsNKCC1에서 Thr906/Thr1007 및 Thr203/207/212 부위의 축약된 인산화와 상관관계가 있었다. 또한, 스타우로스포린 및 NEM은 각각 rnKCC2b의 Ser940 부위에서 PKC의 인산화를 감소 및 증가시켰으며, 이는 각각 스타우로스포린 및 NEM 처리 시 Thr505 부위에서 PKC-δ의 인산화 감소 및 증가와 상관관계가 있었다(그림 1).
그림 1 : HEK rn KCC2b 세포에서 스타로 스포린 및 NEM 처리시 rn KCC2b 및 hsNKCC1 포스 포 사이트의 정량 분석. (A) 안정하게 형질감염된 HEK rnKCC2b 세포를 DMSO (대조군), 8 μM 스타우로스포린, 또는 0.5 mM NEM으로 15분 동안 처리하였다. 세포 용해물을 수확하고, 지시된 항체와 함께 면역침전 (IP) 및 면역블롯 (IB)을 실시하였다. 약어 : D = 이량 체 KCC2; M = 단량체 KCC2. (b) 안정적으로 형질감염된 HEKrnKCC2b 세포의 면역블롯 정량화. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화되었습니다. p < 0.001; **p < 0.01; 윌콕슨-만 휘트니 검정(n = 6). 이 수치는 Zhang et al.15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 8% 분리 젤 8mL | 6% 스태킹 젤 5mL | ||
| 필요한 재료 | 부피 (μL) | 필요한 재료 | 부피 (μL) |
| 증류된H2O | 4200 | 증류된H2O | 2900 |
| 40% 아크릴아미드 | 1600 | 40% 아크릴아미드 | 750 |
| 1.5 M 트리스 pH 8.8 | 2000 | 0.5 M 트리스 pH 6.8 | 1250 |
| 10% 표준시스(SDS) | 80 | 10% 표준시스(SDS) | 50 |
| 10% APS | 80 | 10% APS | 50 |
| 테메드 | 8 | 테메드 | 5 |
| 분리 젤 만들기 : | |
| 1) | 4.2 mL의 ddH2O로 시작 |
| 2) | 40% 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 용액 1.6mL 추가 |
| 3) | 1.5 M 트리스 pH 8.8 2 mL를 넣고 섞는다. |
| 4) | 80 μL의 10% SDS를 혼합합니다. |
| 5) | 사용할 준비가 되면 TEMED 8μL를 넣고 혼합합니다. |
| 6) | 80 μL의 10% APS*를 첨가하고 혼합 |
| 스태킹 젤 만들기: | |
| 1) | 2.9mL의 ddH2O로 시작 |
| 2) | 40% 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 용액 0.75mL 추가 |
| 3) | 0.5 M 트리스 pH 6.8 1.25 mL를 첨가하고 혼합 |
| 4) | 50 μL의 10% SDS를 혼합합니다. |
| 5) | 사용할 준비가 되면 TEMED 5μL를 추가하고 혼합합니다. |
| 6) | 50 μL의 10% APS*를 첨가하고 혼합합니다. |
| SDS = 소듐 도데 실 설페이트 | |
| APS = 황산염 당 암모늄 | |
| TEMED = N, N, Nʹ, N-테트라메틸에틸렌디아민 | |
| * APS를 첨가하면 용액이 몇 분 내에 중합되기 때문에 용액을 주조 장치에 즉시 부어야합니다. 따라서 용액이 필요할 때 분리 및 적층 젤 용액을 준비하는 것이 좋습니다. | |
표 1: 폴리 아크릴 아미드 겔 믹스를 만들기위한 레시피 (젤 용액 분리 및 스태킹).
| 겔 백분율 (%) | 단백질 크기 (kDa) |
| 최대 20 | 4에서 40 |
| 15 | 12에서 45 |
| 12.5 | 10에서 70 |
| 10 | 15에서 100 |
| 8 | 50에서 200 |
| 4에서 6 | > 200 |
표 2: 다양한 크기의 단백질에 권장되는 SDS-PAGE 젤 비율
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Discussion
KCC2를 포함하는 뉴런에서 발현되는 CCC의 SLC12의 활성을 측정하기 위해 많은 방법이 사용되었습니다. 이러한 기술 중 다수는 다양한 질병 관련 돌연변이에서 이러한 수송체의 기능적 관련성과 구조-기능 패턴 분석에 대한 과학적 지식을 향상시키는 것으로 입증되었습니다. 비판적으로, 다양한 방법(21)에 대한 장점과 주의사항이 있다. 그러나 위에서 설명한 프로토콜은 KCC2의 기능과 활성을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 웨스턴 블롯을 사용하여 키나아제 조절 부위인 Thr906 및 Thr1007에서 KCC2 인산화를 평가하는 방법을 설명했습니다.
KCC2의 조절은 주요 세린/트레오닌 잔기1에서 인산화 및 탈인산화를 통해 발생합니다. 웨스턴 블로팅은 Thr906 및 Thr1007의 키나아제 조절 부위에서 KCC2 인산화를 조사하는 데 사용할 수 있는 효율적인 기술입니다. 원칙적으로, KCC2의 인산화의 변화는 관심있는 면역 블롯 샘플 / 단백질의 포스 포 펩타이드에 대한 포스 포 특이 적 항체를 사용하여 검출된다. 웨스턴 블롯은 조직 또는 세포의 샘플로부터 관심있는 특정 단백질을 검출하기 위해 사용되는 방법이다. 이 방법은 먼저 전기 영동을 통해 단백질을 크기별로 분리합니다. 그런 다음 단백질은 특정 항체를 사용하여 표적 단백질을 표시하기 전에 고체 지지체(일반적으로 막)로 전기영동적으로 전달됩니다. 항체는 비색, 화학발광 또는 형광 방법을 사용하여 검출되는 상이한 태그 또는 형광단-접합된 항체에 접합된다. 이를 통해 단백질 혼합물에서 특정 표적 단백질을 검출 할 수 있습니다. 이 기술은 KCC2 2,8의 인특이적 부위를 특성화하는 데 사용되었으며 KCC2 Thr906/Thr1007 인산화15를 길항하는 KCC2의 억제제를 식별하는 데 사용되었습니다. HEK293 라인은 분자 생물학 실험에서 유리하기 때문에 여러 실험에 사용되었습니다. 그들은 재생산이 빠르고, 유지가 쉬우며, 형질감염 및단백질 생산에 매우 효율적이다2. 그러나 일부 의견은 뇌에서 유래 한 세포가 아니기 때문에 신경 생물학 실험을 수행하는 데 가장 적합한 후보가 아닐 수 있으므로 신경 과학 연구에서 생리 학적 특이성이 의심 스러울 수 있다고 주장합니다. 그러나 이전 연구에서는 HEK293 세포와 실제 신경 조직 / 세포15,23에서 KCC2의 발현에서 유사한 결과가 관찰되는 것으로 나타났습니다. 따라서 신경 과학 연구에서 HEK293의 관련성은 완전히 폐기되지 않을 수 있습니다.
웨스턴 블로팅 기법에 의한 단백질 발현의 분석을 포함하는 연구에서, 용해 완충액 조성물의 선택, 사용되는 세제의 성질(유형 및 농도)(24) 및 프로테아제 억제제에 특별한 주의를 기울여야 한다. 완충액의 조성은 그의 가용화 및 추출 공정을 용이하게 하고, 웨스턴 블롯25에 의해 용이하게 검출될 수 있도록 표적 단백질에 적합하도록 최적화되어야 한다. 가용성 단백질에는 일반적으로 저농도의 중성 세제가 필요하지만 막 단백질에는 더 강한 세제 조건이 필요할 수 있습니다. 그러나 강한 세제는 상호 작용을 방해하고 복합체가 손실 될 수 있습니다. 세제의 종류와 농도 모두 단백질의 성질과 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 이러한 세제에 대해 제한된/허용되는 농도 범위를 고수할 필요가 있습니다. 프로테아제 억제제를 첨가하면 표적 단백질이 내인성 단백질에 의해 분해되는 것을 방지할 수 있으며 최적의 권장 작동 온도는 단백질 분해 속도를 효과적으로 감소시키기 위해 4°C입니다. 때때로, 불량한 면역블롯 신호를 제공하는 항체에 대한 고품질 면역블롯 신호를 달성하기 위해, 면역침전(IP)은 웨스턴 블롯팅을 위한 업스트림 실험으로서 수행된다. 이 기술은 항원과 그의 각각의 항체 사이의 상호작용을 그들의 결과적인 분리 및 정량화26에 앞서 그들의 본래 형태에서 용이하게 하기 때문에 유리하다. 따라서 IP는 웨스턴 블로팅 절차의 출력 품질을 향상시킬 수 있습니다. IP 기술을 적용하기 전에, 웨스턴 블롯팅에 의한 전체 세포 용해물 또는 투입 분획을 분석하여 용해물에서 공동 면역침전된 파트너 단백질의 발현 존재 및 효율을 평가하는 것이 중요합니다. 또한, 단백질의 크기가 겔 매트릭스의 체질 효과에 영향을 미치기 때문에 SDS-PAGE 전기영동을 위해 원하는 비율의 겔 용액을 준비하기 전에 조사할 단백질의 분자량에 대한 사전 지식이 필요합니다.
그러나 이 기술에 의한 단백질 접합 항체의 검출은 공동 수송체 활성의 신뢰할 수 있는 예측을 위해 공동 수송체 인산화 및 공동 수송체를 조절할 수 있는 신호 경로의 무결성에 대한 정보를 제공할 수 있는 KCC2의 인-부위에서의 협력 활동에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 되기 때문에 매우 중요합니다. 그러나 웨스턴 블롯 기술은 반 정량적 데이터 만 생성 할 수 있으며,이 기술은 단백질 발현의 상대적 평가 만 강조하고 절대 정량화는 강조하지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이것은 개별 블롯에서 다른 별도의 레인에서 샘플 로딩 및 이송 속도의 불일치로 인정됩니다. 생성된 검출된 신호는 또한 선형이 아니며, 샘플(27)의 농도 범위를 반영하지 않는다. 게다가, 인산화 상태는 억제제, 돌연변이 및 환경과의 단백질 상호 작용과 같은 개입이 인산화 수준28,29,30을 변경하지 않고 단백질 활성에 직접적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 단백질 활성을 보고하는 신뢰할 수 있는 요소가 아닐 수 있습니다. 따라서, 다른 생화학적 방법을 보충하기 위해 포스포-특이적 항체를 사용하는 것이 더 유익할 수 있다.
앞서 언급했듯이 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 균질 세포 제제의 막을 통한 방사성 86Rb+ 플럭스 측정을 통한 KCC2 평가는 널리 사용되는 접근 방식입니다. 이 방법은 활성 방사성 동위 원소를 이온 채널을 통과시켜 추적자로 사용합니다. 간단히 말해서, 관심 세포를 내인성 KCC2를 억제하기 위해 양이온이 없는 용액에서 배양한 다음 우아뱅과 같은 특정 억제제와 함께 배양한 다음 억제제와 86Rb+를 포함하는 흡수 배지와 함께 배양합니다. 액체 섬광 계수기는 세포 용해에 대한 후속 활동을 측정/추적하는 데 사용됩니다. 그러나 이 방법은 강력하고 매우 민감하며 선택적이며 방해가 덜 발생합니다. 그러나 그 적용은 뇌 또는 뉴런 배양과 같은 여러 세포 유형을 가진 조직으로 확장되지 않습니다. 또한,이 기술은 세포 내 수준에서 이온 농도의 분해능 변화를 제한합니다. 또한 높은 에너지 방출(최대 1.77MeV, 최대 1.08MeV)31을 특징으로 하는 짧은 반감기(18.65일) 방사성 동위원소로 작업할 경우 발생할 수 있는 잠재적인 독성 및 건강 위험에 관한 안전 문제가 있습니다. 이것은 일반적으로 많은 수의 세포가 필요한 신경 세포 연구에 부적합하다는 것을 크게 시사할 수 있습니다. 이러한 문제로 인해 이온 플럭스 측정을 위한 방사성 86Rb+의 대안으로 Terstappen 1999의 비방사성 85Rb+ 유출 분석법이 개발되었습니다. 비방사성 접근법은 제약 산업에서 K+ 및 비선택적 양이온 채널의 분석을 위한 방사성 86Rb+ 분석을 크게 추방했습니다(31). 비방사성 85Rb+ 유출 분석에는 두 가지 주요 공정이 포함되며, 첫 번째는 세포 배양 및 조작이고 두 번째는 원자 흡수 분광법(AAS)에 의한 추적 루비듐 측정입니다. 이 방법은 사용하기 쉽지만 많은 분석 검증 실험이 필요하고 열악한 시간 분해능32을 겪습니다. 그럼에도 불구하고, 비방사성 85Rb+ 유출 분석은 KCC 및 NKCCs33의 평가를 위한 신뢰할 수 있는 기술임이 점진적으로 입증되었다.
탈륨(TI+) 플럭스 분석은 KCC2 및 NKCC2의 K+ 부위에 대한 높은 결합 친화도로 인해 TI+를 K+의 대리 이온으로 사용합니다. 세포로의 TI+ 유입은 벤조티아졸 쿠마린 및 플루오진-2와 같은 탈륨 민감성 형광 염료를 사용하여 검출할 수 있습니다. 일단 채널에 의해 수송되면, TI+는 BTC/플루오진-2 염료와 회합하여 형광 변화를 일으킬 수 있으며, 이는 형광 이미징 플레이트 판독기(31)에 의해 검출될 수 있다. TI+ 지시 염료는 아세톡시메틸 에스테르로 세포에 들어간 다음 세포질 에스테라제에 의해 절단되어 활성 형광 생성 형태를 방출합니다. KCC를 활성화하기 위해, 세포는 시험 화합물(예를 들어, KCC2 억제제)의 존재 또는 부재하에 K+ 및 Tl+의 혼합물로 자극된다. 탈륨은 형광 염료에 들어가 결합합니다. 형광 신호의 증가는 특이적으로 공수송체를 통한 세포 내로의 Tl+의 유입에 비례하며, 따라서 공수송체 활성의 기능적 측정을 나타낸다. 이 방법은 또한 다양한 유형의 세포 배양에서 KCC2 및 NKCC2 활성을 측정하는데도 잘 적용되었으며, 예를 들어 인간 KCC2를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주에 대한 연구(34)가 있다. 단점 끝에는 TI+ 유입을 방해할 수 있는 다양한 잠재적인 오프 타겟 경로 라인이 있으며, 예를 들어 HEK293 세포의 Na+/K+ ATPase는 더 높은 위양성 또는 위음성 적중률(35)을 유발할 수 있습니다. 더욱이, 다른 플럭스 분석과 마찬가지로, 뉴런 세포에서 이러한 접근법의 구현은 다중 세척 단계 후에 뉴런 세포의 불량한 생존으로 인해 제한적으로 남아 있다. 다중 K+ 채널 및 수송체의 뉴런 발현은 또한 KCC2 특이적 K+ 플럭스의 정확한 평가를 방해할 수 있습니다. 이 기술은 수상 돌기 및 수지상 가시와 같은 작은 신경 구획의 채널 연구에 한계를 나타내며 축삭은 낮은 시간 해상도와 결합 된 공간 해상도 부족으로 인해 발생합니다.
패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다. 일반적으로, SLC12 기능의 전기생리학적 측정은 GABAA 수용체 (GABAAR)가 염화물36에 투과성이라는 원리에 의존한다. KCC2는 GABA 성 억제의 조절에 핵심입니다. 특히, KCC2의 [Cl-] i 압출 활성은 GABAAR6의 과분극의 기초가된다. 세포 내 기록은 GABAAR 매개 전류 (EGABA)의 잠재력 반전으로부터 KCC2의 염화물 압출 용량의 외삽을 통해 중요한 통찰력을 제공합니다. 과분극 EGABA는 더 낮은 [Cl-]i 및 따라서 KCC2의 활성 증가를 나타냅니다. 전기 생리학의 그라미시딘 패치 클램프 기술은 GABA 활성을 측정하기 위한 황금 표준 접근 방식입니다. 이전에 발표 된 일부 연구에서는 항상성을 평가 / 모니터링하기 위해 KCC2의 기능과 활동을 조사하기 위해 그라 미신 패치 클램프 기록을 사용하여 실제로 성공적인 것으로 입증되었습니다 8,9,37,38,39,40 . 그라미시딘 패치 클램프 기록 중에 세포/조직 표면의 단단한 밀봉은 세포/조직을 둘러싼 욕조의 다른 전극을 참조하여 이온 채널의 세포 내 활성을 기록하기 위해 상대 패치가 있는 유리 전극을 사용하여 생성됩니다. 이 기술은 전압-클램프 모드에서 고정 전압에서 셀의 막을 가로지르는 전류의 양을 측정하거나 전류 클램프 모드(36)에서 고정된 전류로 막을 가로질러 이동하는 전압의 양을 기록함으로써 수행될 수 있다. 연구 질문에 크게 의존하는 기본 기술의 여러 변형을 적용 할 수 있습니다. 상기 기술은 비교적 큰 기공형 전체 세포 패치 기록을 생성하지 않지만, 전극 용액에 함유된 기공 형성 항생제(그라미시딘)가 멤브레인(36) 내에 작은 기공을 형성하는데 사용된다. 특히, 그라미시딘의 첨가는 막에 양이온 선택적 기공을 생성하며, 이는 미미한 음이온 투과성을 나타낸다. 전압 램프 프로토콜은 일정한 전압에서 전류를 기록하는 효과적이고 신뢰할 수 있는 대안입니다. 전압 램프 프로토콜로 얻은 전류/전압 관계는 GABAAR 매개 멤브레인 전류를 더 잘 기록하는 것으로 보입니다. 이 프로토콜에서는 지속적으로 변경되지만 모니터링되는 전압(일정한 속도로)이 적용되고 전류는 지속적으로 동시에 측정됩니다(36,41). 이 프로토콜 동안 전압 펄스 (일반적으로 과분극 방향)의 적용은 옴 응답의 결과로 누설 전류를 활성화하는 데 사용됩니다. 전형적으로, GABAAR- 매개 막 전류는 누설 전류 (즉, 누설 감산 작용제 전류의 반전 전위)로부터 계산된다 36. 이 프로토콜에서 얻은 전류-전압 연결은 GABAA 수용체 채널과 관련된 실험 시나리오에서 이온 농도의 변화가 발생하는 위치를 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다. Yelhekar et al.41은 계산 모델을 사용하여 보간 방법의 안정적인 이온 농도에 대한 결론이 방법의 추정 된 반전 전위가 부정확 할 수 있기 때문에 정당화되지 않을 수 있음을 보여주었습니다.
대부분의 녹음에 사용되는 평균 저항은 5MΩ입니다. 저항이 3-4MΩ인 피펫은 직렬 저항이 낮아질 수 있으며 이는 전압 클램프 기록에 선호됩니다. 그러나 피펫의 팁은 더 높은 저항의 피펫에 대해 비교적 넓을 것이며, 결과적으로 밀봉 형성 및 안정성의 어려움36,42의 형태로 문제를 제기합니다. 따라서 생성된 노이즈 데이터 레벨이 상당히 감소된 기록을 얻기 위해 GΩ 형성을 모니터링해야 합니다. GABA 활성 측정에서 적합성과 신뢰성으로 판단되는 KCC2의 기능과 활성을 연구하는이 기술의 견고성은 여러 연구에 의해 확인되었습니다. 이전 연구에 따르면 [Cl-]i는 각각의 작용제에 대한 GABAARs (염화물 전도도를 게이트 할 수 있음)의 반응을 측정하여이 기술을 사용하여 안정적으로 유지됩니다. 암시적으로, 지속적인 전기 액세스는 세포 내 염화물 농도(43,44)의 변형이 거의 또는 전혀 없다. 또한,이 기술은 GABAAR 활성화 (염화물 및 중탄산염 전도도를 개방하는) 동안 막 전위 및 EGABA의 인공 변화를 우회하는 것을 용이하게합니다.45. 앞서 언급한 내용은 이 기술이 다른 유형의 전기 생리학 기록보다 앞서 있습니다. 그러나, 이 기술의 한계는 다음과 같다: (1) 전류 분해능을 감소시킬 수 있는 멤브레인의 일부를 차지하는 전극의 팁으로 인해 빈번한 기록 노이즈가 발생할 수 있고, (2) 그라미시딘으로 멤브레인을 천공하는 것은 일반적으로 상대적으로 더 오랜 시간이 걸린다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 영국 왕립 학회 (보조금 번호 IEC \ NSFC \ 201094) 및 Commonwealth Ph.D. 장학금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
References
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