Summary
Das vorliegende Protokoll hebt die Anwendung der Western-Blotting-Technik hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt die Untersuchung der KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 mittels Western Blotting. Außerdem werden zusätzliche Methoden zur Bestätigung der KCC2-Aktivität in diesem Text kurz hervorgehoben.
Abstract
Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) sind ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der Cl-Homöostase und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung unerlässlich sind. Das Versagen bei der richtigen Regulierung von KCC2 ist schädlich und wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie, in Verbindung gebracht. Es wurden beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die für die Entwicklung von Techniken verantwortlich sind, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Hier zeigt das Protokoll, wie die KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen - Thr906 und Thr1007 - mit der Western-Blotting-Technik untersucht werden kann. Es gibt andere klassische Methoden, die verwendet werden, um die KCC2-Aktivität direkt zu messen, wie Rubidium-Ionen- und Thallium-Ionen-Aufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert. Einige dieser zusätzlichen Techniken werden in diesem Manuskript kurz diskutiert.
Introduction
Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) ist ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der Cl-Homöostase und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung 1,2,3,4 unerlässlich sind. Die Aufrechterhaltung einer niedrigen intraneuronalen Cl-Konzentration ([Cl-]i) bei 4-6 mM durch KCC2 erleichtert die Hyperpolarisation von γ-Aminobuttersäure (GABA)/Glycin und die synaptische Hemmung im Gehirn und Rückenmark 5. Das Versagen bei der richtigen Regulation von KCC2 wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie4, in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wurden verminderte KCC2-vermittelte Cl−-Extrusion und gestörte hyperpolarisierendeGABA-A- und/oder Glycinrezeptor-vermittelte Ströme mit Epilepsie, neuropathischen Schmerzen und Spastik in Verbindung gebracht 6,7. Neuronales KCC2 wird durch Phosphorylierung wichtiger regulatorischer Reste innerhalb seiner C-terminalen intrazellulären Domäne durch den mit No-Lysin (WNK)-STE20/SPS1-verwandten Prolin/Alanin-reichen (SPAK)/Oxidative Stress-responsive (OSR) Kinase-Signalkomplex1 negativ moduliert, was die Aufrechterhaltung der depolarisierten GABA-Aktivität in unreifen Neuronen erleichtert 2,8,9 . Der WNK-SPAK/OSR1 phosphoryliert die Threoninreste 906 und 1007 (Thr906/Thr1007) und reguliert anschließend die mRNA-Genexpression von KCC2 herunter, was zu einer Verschlechterung seiner physiologischen Funktion führt 8,10. Noch wichtiger ist jedoch, dass es bereits eine Tatsache ist, dass der WNK-SPAK/OSR1-Kinase-Komplex dafür bekannt ist, die KCC2-Expression 1,2,4,11,12 zu phosphorylieren und zu hemmen, und dass die Hemmung der Kinase-Komplex-Signalwege zum Phosphorylat Thr906/Thr1007 mit der erhöhten Expression des KCC2-mRNA-Gens in Verbindung gebracht wurde13,14,15 . Es ist wichtig zu beachten, dass die Regulation der neuronalen KCC2- und Na+-K+-2Cl-Cotransporter 1 (NKCC1) Expression über Proteinphosphorylierung gleichzeitig und in umgekehrten Mustern 1,4,16 funktioniert.
Es wurden beständige und beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die der Entwicklung von Techniken zugeschrieben wurden, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Das hier vorgestellte Protokoll hebt die Anwendung von Western-Blotting-Techniken hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K+-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen, indem die Phosphorylierung des Cotransporters an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 untersucht wird.
Western Blot ist eine Methode, um bestimmte Proteine von Interesse aus einer Gewebe- oder Zellprobe nachzuweisen. Diese Methode trennt die Proteine zunächst durch Elektrophorese nach Größe. Die Proteine werden dann elektrophoretisch auf einen festen Träger (meist eine Membran) übertragen, bevor das Zielprotein mit einem spezifischen Antikörper markiert wird. Die Antikörper werden an verschiedene Tags oder fluorophorkonjugierte Antikörper konjugiert, die entweder kolorimetrische, Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzmethoden nachgewiesen werden. Dadurch kann ein spezifisches Zielprotein aus einer Mischung von Proteinen nachgewiesen werden. Diese Technik wurde verwendet, um phosphospezifische Stellen von KCCs1 zu charakterisieren und Kinase-Inhibitoren zu identifizieren, die die KCC3 Thr991/Thr1048-Phosphorylierunghemmen 17. Durch die Befolgung dieses Protokolls kann man spezifisch Gesamt- und phosphoryliertes KCC2 aus Zell- / Gewebelysaten nachweisen. Prinzipiell ist der Nachweis von proteinkonjugierten Antikörpern durch diese Technik sehr hilfreich, da er dazu beiträgt, das Verständnis kooperativer Aktivitäten an den Phospho-Stellen von KCC2 zu verbessern, was Aufschluss über die molekularen Mechanismen gibt, die an ihrer physiologischen Regulation beteiligt sind. Die quantitative Analyse der Gesamtproteinexpression ist repräsentativ für die Funktion und Aktivität von KCC2. Es gibt andere klassische Methoden zur direkten Messung der KCC2-Aktivität, wie Rubidiumionen- und Thalliumionenaufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert.
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Protocol
HINWEIS: Das Protokoll beschreibt die Western-Blotting-Methode, um bestimmte Proteine von Interesse zu erkennen.
1. Zellkultur und Transfektion
- Erwärmen Sie alle Reagenzien vor dem Zellkulturvorgang im Kugelbad (37 °C). Bereiten Sie das Kulturmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) vor, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, jeweils 1% 2mM L-Glutamin, 100x nicht-essentieller Aminosäure, 100 mM Natriumpyruvat und 100 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin.
- Ratte KCC2b humane embryonale Niere 293 Zellen (HEK293rnKCC2b)18 stabil im Perlenbad (37 °C) auftauen. Die Zellen werden aus dem Kryoröhrchen in ein Zentrifugenröhrchen mit 5 ml frischem Medium überführt. Drehen Sie die Zelle bei 1200 ×g für 3-5 min.
- Verwenden Sie eine Aspiratorpipette (befestigt an einer Vakuumpumpe), um den Überstand abzusaugen, und fügen Sie 10 ml frisches Medium hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren. Die Zellsuspension auf eine 10 cm lange Tellerplatte geben.
- Stellen Sie die Schale in den Inkubator und lassen Sie sie 48 h bei 37 ° C in einer befeuchteten 5%CO2-Atmosphäre wachsen. Überwachen Sie die Inkubationszeit, um ein gesundes Zellwachstum zu gewährleisten. Weitere Spaltung der Zellen, wenn sie nach der Inkubationszeit eine Konfluenz von über 90% erreicht haben.
- Saugen Sie die alten Medien aus der Zellschale ab und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 2 ml Phosphatpuffersalzlösung (PBS) ab. Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für ca. 1-2 min bei Raumtemperatur.
- Verwenden Sie 2 ml komplettes Medium, um die trypsinisierten Zellen in der Schale vorsichtig zu waschen. Fügen Sie 9 ml frische Medien zu neuen Gerichten hinzu und fügen Sie 1 ml Lösung aus dem alten Gericht zu jedem der neuen hinzu. Die gespaltenen Zellschalen für 48 h zurück in den Inkubator geben, um ≥ 90% Konfluenz zu erreichen.
- Behandeln Sie die Zellen entweder mit Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kontrolle, 8 μM Staurosporin oder 0,5 mM N-Ethylmaleimid (NEM) für 15 Minuten, bevor Sie die Zellen im Lysepuffer ernten.
2. Vorbereitung von Zelllysaten und Beladung von Proben
- Absaugen der Medien auf der Kulturschale (aus Transfektionsverfahren). Die Zellkultur auf Eis legen und die Zellen mit eiskaltem PBS waschen.
- Das PBS wird abgesaugt, dann 1,0 ml eiskalter Lysepuffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure (EGTA), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 50 mM Natriumfluorid, 5 mM Natriumpyrophosphat, 10 mM Natrium-β-glycerophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 1% (w/v) Triton X-100, 0,27 M Saccharose, 1 mM Benzamin, 0,1% (v/v) 2-Mercaptoethanol und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in die Schale.
HINWEIS: Das Volumen des Lysepuffers während der Zellernte variiert mit der Schalengröße, zum Beispiel ist 1 ml Lysepuffer pro 1 x 107 Zellen / 100 mm Schale / 150 cm 2 Kolben geeignet, während 0,5 ml pro 5 x 106 Zellen / 60 mm Schale / 75 cm2 Kolben geeignet ist. - Verwenden Sie einen kalten Kunststoffzellenschaber, um die Zellen vom Boden der Schale abzukratzen, und verwenden Sie dann vorsichtig eine Pipette, um die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen, das bereits auf Eis liegt. Rühren Sie das Rohr 30 min lang konstant bei 4 °C.
- Die Zelllysate in einer Kaltzentrifuge (4 °C) bei 16.000 x g für 20 min schleudern, das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge nehmen und auf Eis legen. Sammeln Sie den Überstand in ein vorgekühltes frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
HINWEIS: Je nach Zelltyp kann es notwendig sein, die Zentrifugationskraft und -zeit zu variieren. Allgemeine Richtlinien empfehlen jedoch die Zentrifugation bei 16.000 x g für 20 Minuten. Dies muss jedoch für jedes Experiment ermittelt werden. Zum Beispiel benötigen empfindliche Zellen wie Leukozyten eine sehr leichte Zentrifugationsgeschwindigkeit.
3. Herstellung von Immunpräzipitantien aus Zelllysaten
- 300 μL Protein-G-Sepharose werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. Die Lösung bei 500 x g für 2 min drehen und den Überstand verwerfen.
- Fügen Sie 500 μL PBS hinzu und wirbeln Sie die Lösung gut durch. Die Lösung bei 500 x g für 2 min drehen und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Mischen Sie 1 mg Anti-KCC2 Thr906 und Anti-KCC2 Thr1007 Antikörper mit 200 μL Protein-G-Sepharose-Perlen und bilden Sie das Volumen auf 500 μL mit PBS. Auf einer vibrierenden Plattform oder einem rotierenden Rad 2 h bei 4 °C schütteln. 2x mit PBS waschen.
- Führen Sie eine Proteinquantifizierung an den Ganzzelllysaten durch und fügen Sie 1 mg des Zelllysats zu den gewaschenen Perlen hinzu. In einem End-to-End-Rotator 2 h bei 4 °C vorsichtig inkubieren. Die Perlen herunterdrehen und 3x mit PBS waschen, das 150 mM Natriumchlorid (NaCl) enthält.
- Immunpräzipitanten (Perlen) 3x mit 200 μL PBS waschen. Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 100 μL 1x Lithiumdodecylsulfat (LDS) Probenpuffer.
- Die Röhrchen in einem Rotorschüttler bei Raumtemperatur 5 min schütteln und in einem Heizblock bei 75 °C 10 min inkubieren. Zentrifugieren Sie die Beladungsprobe bei 11.000 x g für 2 min und verwenden Sie den Überstand zum Beladen des Gels.
4. Durchführung des Western Blots
- Gießen Sie die Gießvorrichtung zusammen und gießen Sie frisch zubereitetes 8% Trenngel (siehe Tabelle 1 für Rezept/Zubereitung), um das Gel zu gießen, so dass etwa 2 cm Platz von der Oberseite des Gießglases bleibt. 200 μL absolutes Isopropanol in den Aufbau geben und 60 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
HINWEIS: Das Polyacrylamid-Gelrezept für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) hängt von der Größe des interessierenden Proteins ab (Tabelle 2). Notieren Sie sich daher die Proteingröße, bevor Sie den gewünschten Gelprozentsatz bestimmen. - Verwenden Sie eine Pipette, um das Isopropanol zu entfernen und spülen Sie das Gel vorsichtig mit etwa 200 μL destilliertem Wasser ab. Fügen Sie frisch zubereitetes 6%iges Stapelgel hinzu (siehe Tabelle 1 für Rezept/Zubereitung), um den ca. 2 cm großen Raum auf dem Gießaufbau aufzufüllen. Vorsichtig in den Brunnenkamm einlegen und 30 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
- Fixieren Sie das gegossene Gel in den Elektrophoresetank.
- Lösen Sie 30,3 g Tris-Base, 144,1 g Glycin und 10 g SDS in 1000 ml destilliertem Wasser, um 10x Transferpuffer herzustellen. Bereiten Sie 1x Laufpuffer vor, indem Sie 10 mL 10% SDS und 100 mL 10x Transferpuffer zu 890 mL destilliertem Wasser hinzufügen.
- Gießen Sie 1x Laufpuffer in den Tank. Laden Sie 5 μL Molekulargewichtsmarker in die erste Vertiefung und eine gleiche Menge Protein in jede Vertiefung des SDS-PAGE-Gels (zwischen 18-30 μL, abhängig von der verwendeten Kammgröße). Leere Vertiefungen mit 1x LDS auffüllen und das Gel ca. 90-120 min bei 120 V laufen lassen.
- 58,2 g Tris-Base und 29,3 g Glycin werden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst, um einen 10-fachen Transferpuffer herzustellen. Aktivieren Sie die Nitrocellulosemembran mit 1x Transferpuffer, der 20% Methanol enthält. Spülen Sie das Gel und die Membran mit dem Transferpuffer ab und verteilen Sie sie vorsichtig auf dem Vorbereitungsstapel.
HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, den pH-Wert der Lauf- und Transferpuffer anzupassen, da sie den optimalen pH-Wert aufweisen sollten. Außerdem ist es ratsam, diese Puffer vorzubereiten und vor dem Experiment bei Raumtemperatur zu lagern, um Zeit zu sparen. - Ordnen Sie das zu übertragende Sandwich in dieser Reihenfolge an: negative Elektrode (schwarzer Rahmen/Ende) - Sandwichschaum - Filterpapier - gespültes SDS-PAGE Gel - gespülte Nitrozellulosemembran - Filterpapier - Sandwichschaum - positive Elektrode (roter Rahmen). Stapeln Sie das montierte Sandwich in den Transfertank und laufen Sie mit 90 V für 90 min oder 30 V für 360 min.
5. Antikörperfärbung und Bildentwicklung
- Entfernen Sie die Membran und lassen Sie sie trocknen. Blockieren Sie die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Blockpuffer aus 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
- Die Membranen werden mit geeigneten Verdünnungen des primären Antikörpers 8,15,19 und des Beta-Aktins (Belastungskontrolle) in Blockierpuffer für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Membran in drei Waschgängen von je 1x TBS-T für jeweils 5 min.
HINWEIS: Die Inkubation der separaten Membran mit Belastungskontrollen wie Beta-Aktin, Alpha-Tubulin oder Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Antikörpern dient dazu, die anderen westlichen Blotting-Ergebnisse während der nachfolgenden Quantifizierung zu normalisieren. Die empfohlene Verdünnung für jeden primären Antikörper ist im Handbuch des Herstellers verfügbar. - Inkubieren Sie die gewaschene Membran mit sekundären Antikörpern, die 5000-fach in Blockierpuffer verdünnt sind, für 60 min bei Raumtemperatur. Auch hier waschen Sie die Membran 3x in 1x TBS-T für jeweils 5 min.
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, dass der sekundäre Antikörper gegen die Spezies erhöht wird, bei der der primäre Antikörper erhöht wird. Wenn beispielsweise der primäre Antikörper des Gesamt-KCC2 Maus-Anti-KCC2 ist, muss der sekundäre Antikörper für Anti-Maus verwendet werden. - Legen Sie die gewaschene Membran auf die Bildplatine. Mischen Sie gleiche Volumina jedes Reagenzes für verbesserte Chemilumineszenz (ECL) und verteilen Sie die gemischte Lösung vorsichtig auf der Membran, um Signale zu entwickeln.
6. Bildaufnahme mit einem Bildgebungssystem und Datenquantifizierung
- Bringen Sie die Bildkarte für die Bildgebung in das entsprechende Fach des Bildgebungssystems. Öffnen Sie die Imaging-Software auf dem Computer für die Bildverarbeitung.
- Klicken Sie in der Symbolleiste auf Neues Protokoll und wählen Sie Single Channel (Einzelner Kanal). Klicken Sie im Dialogfeld Gelbildgebung/Anwendung auf Auswählen, scrollen Sie zu Blot und wählen Sie entweder Chemi Hi Sensitivity (Chemi Hi Sensitivität) oder Chemi Hi Resolution (Chemi Hi Sensitivität) oder Chemi Hi Resolution (Chemi Hi Resolution). Klicken Sie dann auf Signal Accumulation Setup, um die Dauer und Anzahl der aufzunehmenden Bilder festzulegen.
- Klicken Sie unter Protokolleinstellungen auf Gel positionieren und passen Sie das Gel ggf. im Bildgebungssystem an. Klicken Sie auf Protokoll ausführen , um die Bilder abzurufen.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eines der erfassten Bilder im Feld Imaging-Katalog, um die Bilder auf dem Computer zu speichern. Navigieren Sie zum gewünschten Bild und klicken Sie im Dialogfeld Ausführen auf Bild auswählen und fortfahren .
- Klicken Sie auf das Symbol Bildtransformation , um den Kontrast und die Pixelsättigung des Bildes anzupassen. Klicken Sie auf das Screenshot-Symbol in der allgemeinen Symbolleiste, um das Bild je nach gewünschtem Bildformat auf dem Computer zu speichern.
- Messen Sie die Banddichten mit der ImageJ-Software und analysieren Sie sie mit geeigneten statistischen Tools.
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Representative Results
Hier untersuchte das repräsentative Ergebnis in Abbildung 1 den Einfluss von Staurosporin und NEM auf die WNK-SPAK/OSR1-vermittelte Phosphorylierung von KCC2 und NKCC1 in HEK293-Zelllinien, die KCC2b (HEKrnKCC2b)18 stabil exprimieren, unter Verwendung der Western Blotting-Technik. Umfassende Details zu den repräsentativen Ergebnissen werden in Zhang et al.15 diskutiert. Ähnlich wie NEM ist Staurosporin ein breiter Kinase-Inhibitor, der die KCC2-Transportaktivität verstärken und die NKCC1-Aktivität hemmen kann15,20. Die Behandlung von HEK293-Zellen mit Staurosporin und NEM verursachte eine verminderte Phosphorylierung an SPAK-Zielstellen - Thr233 in der T-Loop-Kinase-Domäne und der S-Loop-Phosphorylierungsstelle Ser373 von hsSPAK. Somit verkürzten beide Verbindungen die Phosphorylierungsgrade der vorgenannten SPAK-Phospho-Stellen. Außerdem reduzierte Staurosporin die Phosphorylierung von Ser940 in HEKrnKCC2b, aber NEM erhöhte signifikant seine Phosphorylierung. Darüber hinaus verringert Staurosporin die Phosphorylierung an der Thr505-Stelle, während NEM eine leichte, aber unbedeutende Zunahme der Phosphorylierung an derselben Stelle verursacht. Die unterschiedlichen Wirkungen beider Verbindungen auf die Phosphorylierung der Proteinkinase C (PKC) an der Thr505-Stelle und KCC2b an der Ser940-Stelle korrelieren gut. Das repräsentative Ergebnis zeigte auch, dass beide Wirkstoffe die Expression von GesamtrnKCC2b, hsNKCC1 oder hsSPAK veränderten. NEM (aber keine Staurosporin-Behandlung) verursachte einen signifikanten Anstieg der Expression der Gesamtmenge KCC2, während die Expression von Gesamt-NKCC1 und SPAK nicht signifikant verändert wurden, wenn sie mit beiden Verbindungen behandelt wurden. Darüber hinaus verursachten die beiden Verbindungen eine verminderte Phosphorylierung von SPAK an Thr233- und Ser373-Stellen, was mit der verkürzten Phosphorylierung von Thr906/Thr1007- und Thr203/207/212-Stellen in rnKCC2b bzw. hsNKCC1 korrelierte. Darüber hinaus reduzierten und erhöhten Staurosporin und NEM die Phosphorylierung von PKC an der Ser940-Stelle in rnKCC2b, was mit der Reduktion und Erhöhung der Phosphorylierung von PKC-δ an der Thr505-Stelle nach Staurosporin- bzw. NEM-Behandlung korrelierte (Abbildung 1).
Abbildung 1: Quantitative Analysen von rn KCC2b und hsNKCC1 Phospho-Stellen nach Staurosporin und NEM-Behandlung in HEK rn KCC2b-Zellen. (A) Stabil transfizierte HEK rnKCC2b-Zellen wurden mit DMSO (Kontrolle), 8 μM Staurosporin oder 0,5 mM NEM für 15 min behandelt. Zelllysate wurden geerntet und Immunpräzipitation (IP) und Immunoblot (IB) mit indizierten Antikörpern unterzogen. Abkürzungen: D = dimeric KCC2; M = monomer KCC2. (B) Immunoblot-Quantifizierung von stabil transfizierten HEKrnKCC2b-Zellen. Die Bandintensitäten wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert. p < 0,001; **p < 0,01; Wilcoxon-Mann Whitney-Test (n = 6). Diese Zahl wurde von Zhang et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| 8 ml 8% Trenngel | 5 ml 6% Stapelgel | ||
| Benötigte Materialien | Volumen (μL) | Benötigte Materialien | Volumen (μL) |
| Destilliert H2O | 4200 | Destilliert H2O | 2900 |
| 40% Acrylamid | 1600 | 40% Acrylamid | 750 |
| 1,5 M Tris pH 8,8 | 2000 | 0,5 M Tris pH 6,8 | 1250 |
| 10% SDB | 80 | 10% SDB | 50 |
| 10% APS | 80 | 10% APS | 50 |
| TEMED | 8 | TEMED | 5 |
| Herstellung des Trenngels: | |
| 1) | Beginnen Sie mit 4,2 mlddH2O |
| 2) | 1,6 ml 40%ige Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung zugeben |
| 3) | Fügen Sie 2 ml 1,5 M Tris pH 8,8 hinzu und mischen Sie |
| 4) | Mischen Sie 80 μL von 10% SDS |
| 5) | Wenn Sie gebrauchsfertig sind, fügen Sie 8 μL TEMED hinzu und mischen Sie |
| 6) | Fügen Sie 80 μL 10% APS* hinzu und mischen Sie |
| Herstellung des Stapelgels: | |
| 1) | Beginnen Sie mit 2,9 mLddH2O |
| 2) | 0,75 ml 40%ige Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung zugeben |
| 3) | Fügen Sie 1,25 ml 0,5 M Tris pH 6,8 hinzu und mischen Sie |
| 4) | Mischen Sie 50 μL 10% SDS |
| 5) | Wenn Sie gebrauchsfertig sind, fügen Sie 5 μL TEMED hinzu und mischen Sie |
| 6) | 50 μL 10% APS* zugeben und mischen |
| SDS = Natriumdodecylsulfat | |
| APS = Ammonium pro Sulfat | |
| TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-Tetramethylethylendiamin | |
| *Nach Zugabe von APS sollte die Lösung sofort in die Gießapparatur gegossen werden, da die Lösung innerhalb weniger Minuten polymerisiert. Daher ist es ratsam, die Trenn- und Stapelgellösungen gerade dann vorzubereiten, wenn die Lösungen benötigt werden. | |
Tabelle 1: Rezept zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelmischung (Trenn- und Stapelgellösungen).
| Gelanteil (%) | Proteingröße (kDa) |
| Bis zu 20 | 4 bis 40 |
| 15 | 12 bis 45 |
| 12.5 | 10 bis 70 |
| 10 | 15 bis 100 |
| 8 | 50 bis 200 |
| 4 bis 6 | > 200 |
Tabelle 2: Empfohlener SDS-PAGE Gelprozentsatz für verschiedene Proteingrößen
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Discussion
Viele Methoden wurden verwendet, um die Aktivitäten von SLC12 von CCCs zu messen, die in den Neuronen exprimiert werden, einschließlich KCC2. Viele dieser Techniken haben sich als wissenschaftliche Erkenntnisse über die Analyse der funktionellen Relevanz dieser Transporter und ihrer Struktur-Funktionsmuster bei verschiedenen krankheitsbedingten Mutationen erwiesen. Entscheidend ist, dass die verschiedenen Methoden Vorteile und Vorbehalte haben21. Das oben erläuterte Protokoll beschreibt jedoch, wie die KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen, Thr906 und Thr1007, unter Verwendung von Western Blot bewertet werden kann, was bei der Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten von KCC2 hilfreich sein kann.
Die Regulation von KCC2 erfolgt durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung an wichtigen Serin/Threoninresten1. Western Blotting ist eine effiziente Technik, mit der die KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen an Thr906 und Thr1007 untersucht werden kann. Veränderungen in der Phosphorylierung von KCC2 werden prinzipiell mit phosphospezifischen Antikörpern nachgewiesen, die gegen Phosphopeptide der interessierenden Immunoblot-Proben/Proteine gerichtet sind. Western Blot ist eine Methode, die verwendet wird, um das spezifische Protein von Interesse aus einer Gewebe- oder Zellprobe nachzuweisen. Diese Methode trennt die Proteine zunächst durch Elektrophorese nach Größe. Die Proteine werden dann elektrophoretisch auf einen festen Träger (meist eine Membran) übertragen, bevor das Zielprotein mit einem spezifischen Antikörper markiert wird. Die Antikörper werden an verschiedene Tags oder fluorophorkonjugierte Antikörper konjugiert, die entweder kolorimetrische, Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzmethoden nachgewiesen werden. Dadurch kann ein spezifisches Zielprotein aus einer Mischung von Proteinen nachgewiesen werden. Diese Technik wurde verwendet, um phosphospezifische Stellen von KCC22,8 zu charakterisieren und wurde verwendet, um Inhibitoren von KCC2 zu identifizieren, die KCC2 Thr906 / Thr1007 Phosphorylierung15 antagonisieren. HEK293-Linien wurden aufgrund ihres Vorteils in molekularbiologischen Experimenten für mehrere Experimente verwendet. Sie sind schnell zu reproduzieren, einfach zu pflegen und hocheffizient für Transfektion und Proteinproduktion22. Einige Meinungen sind jedoch der Ansicht, dass es möglicherweise nicht der am besten geeignete Kandidat für die Durchführung neurobiologischer Experimente ist, da es sich nicht um eine Zelle aus dem Gehirn handelt und daher seine physiologische Spezifität in der neurowissenschaftlichen Forschung fragwürdig sein kann. Frühere Arbeiten haben jedoch gezeigt, dass ähnliche Ergebnisse in der Expression von KCC2 in HEK293-Zellen und tatsächlichen neuronalen Geweben / Zellen beobachtet werden15,23. Daher kann die Relevanz von HEK293 in der neurowissenschaftlichen Forschung nicht vollständig verworfen werden.
Bei Untersuchungen, die die Analyse der Proteinexpression mittels Western-Blotting-Technik umfassen, sollte der Wahl der Zusammensetzung des Lysepuffers, der Art (Art und Konzentration) des zu verwendenden Detergens24 und den Proteaseinhibitoren besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden. Die Zusammensetzung des Puffers muss an das Zielprotein angepasst werden, um seine Solubilisierungs- und Extraktionsprozesse zu erleichtern und seinen einfachen Nachweis durch Western Blot25 zu ermöglichen. Mildes Waschmittel in niedriger Konzentration ist normalerweise für lösliche Proteine erforderlich, während Membranproteine stärkere Reinigungsbedingungen erfordern können. Starke Reinigungsmittel können jedoch Wechselwirkungen stören und Komplexe können verloren gehen. Sowohl Arten als auch Konzentrationen der Detergenzien können die Art und Aktivität des Proteins beeinflussen, daher ist es notwendig, sich an einen eingeschränkten / tolerierten Konzentrationsbereich für diese Detergenzien zu halten. Die Zugabe von Proteaseinhibitoren verhindert, dass das Zielprotein durch endogene Proteine abgebaut wird, und die optimale empfohlene Arbeitstemperatur beträgt 4 ° C, um die proteolytischen Raten effektiv zu senken. Um qualitativ hochwertige Immunoblot-Signale für Antikörper zu erhalten, die schlechte Immunoblot-Signale liefern, wird die Immunpräzipitation (IP) manchmal als vorgeschaltetes Experiment für Western Blotting durchgeführt. Diese Technik ist vorteilhaft, weil sie die Interaktion zwischen Antigenen und ihren jeweiligen Antikörpern in ihrer nativen Konformation vor ihrer anschließenden Trennung und Quantifizierung erleichtert26. Daher kann IP die Qualität der Ergebnisse von Western Blotting-Verfahren verbessern. Vor der Anwendung der IP-Technik ist es wichtig, das Vorhandensein und die Effizienz der Expression der co-immunpräzipitierten Partnerproteine im Lysat zu bewerten, indem entweder das gesamte Zelllysat oder Eingangsfraktionen durch Western Blotting analysiert werden. Darüber hinaus sind Vorkenntnisse über das Molekulargewicht des zu untersuchenden Proteins erforderlich, bevor die gewünschten prozentualen Gellösungen für die SDS-PAGE-Elektrophorese hergestellt werden können, da die Größe des Proteins die Siebwirkung der Gelmatrix beeinflusst.
Der Nachweis von proteinkonjugierten Antikörpern durch diese Technik ist jedoch sehr hilfreich, da er dazu beiträgt, das Verständnis kooperativer Aktivitäten an den Phospho-Stellen von KCC2 zu verbessern, die Informationen über die Cotransporter-Phosphorylierung und die Integrität des Signalwegs, der die Cotransporter regulieren kann, für eine zuverlässige Vorhersage der Cotransporteraktivität liefern können. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Western-Blot-Technik nur semi-quantitative Daten liefern kann, was bedeutet, dass die Technik nur die relative Bewertung von Proteinexpressionen, nicht aber die absolute Quantifizierung hervorhebt. Dies ist auf Diskrepanzen in den Raten der Probenbeladung und des Transfers in separaten Bahnen zurückzuführen, die sich bei einzelnen Blots unterscheiden. Das erzeugte detektierte Signal ist ebenfalls nicht linear und spiegelt nicht den Konzentrationsbereich der Proben27 wider. Außerdem ist der Phosphorylierungsstatus möglicherweise kein zuverlässiger Faktor für die Meldung der Proteinaktivität, da Interventionen wie Inhibitoren, Mutationen und Proteininteraktionen mit seiner Umgebung die Proteinaktivität direkt beeinflussen können, ohne den Phosphorylierungsgrad28,29,30 zu verändern. Daher kann es vorteilhafter sein, Phospho-spezifische Antikörper zu verwenden, um andere biochemische Methoden zu ergänzen.
Wie bereits erwähnt, gibt es andere klassische Methoden, um die KCC2-Aktivität direkt zu messen. Die Bewertung von KCC2 durch Messung des radioaktiven 86Rb+ Flusses durch die Membran homogener Zellpräparate ist ein beliebter Ansatz. Diese Methode verwendet aktive Radioisotope als Tracer, indem sie durch Ionenkanäle geleitet werden. Kurz gesagt, die interessierenden Zellen werden in kationenfreien Lösungen inkubiert, um endogenes KCC2 zu hemmen, gefolgt von einer Inkubation mit spezifischen Inhibitoren wie Ouabain und dann mit Aufnahmemedium, das den Inhibitor und 86Rb+ enthält. Flüssigkeitsszintillationszähler werden verwendet, um Aktivitäten nach der Zelllyse zu messen / zu verfolgen. Diese Methode ist jedoch robust, hochempfindlich und selektiv und weniger störanfällig. Seine Anwendungen erstrecken sich jedoch nicht auf Gewebe mit mehreren Zelltypen wie Gehirn- oder Neuronenkulturen. Darüber hinaus begrenzt diese Technik Änderungen in der Auflösung der Ionenkonzentration auf subzellulärer Ebene. Darüber hinaus bestehen Sicherheitsfragen hinsichtlich der potenziellen Toxizität und Gesundheitsgefährdung bei der Arbeit mit Radioisotopen mit kurzer Halbwertszeit (18,65 Tage), die durch hohe Energieemission (max. 1,77 MeV; max. 1,08 MeV) gekennzeichnet sind31. Dies könnte massiv auf eine Ungeeignetheit für neuronale Zellstudien hindeuten, bei denen normalerweise eine hohe Anzahl von Zellen benötigt wird. Diese Probleme führten zur Entwicklung des nicht-radioaktiven 85Rb+ Efflux-Assays von Terstappen 1999 als Alternative zum radioaktiven 86Rb+ zur Bestimmung von Ionenflüssen. Der nicht-radioaktive Ansatz hat die radioaktiven 86Rb+ Assays für die Analyse von K+ und nicht-selektiven Kationenkanälen in der pharmazeutischen Industrie31 stark verbannt. Der nicht-radioaktive 85Rb+ Efflux-Assay umfasst zwei Hauptprozesse, den ersten ist die Zellkultur und -manipulation und der zweite ist die Bestimmung des Tracers Rubidium durch Atomabsorptionsspektroskopie (AAS). Diese Methode ist einfach anzuwenden, erfordert jedoch eine Reihe von Assay-Validierungsexperimenten und leidet unter einer schlechten zeitlichen Auflösung32. Nichtsdestotrotz hat sich der nicht-radioaktive 85Rb+ Efflux-Assay zunehmend als zuverlässige Technik für die Bewertung von KCCs und NKCCs33 erwiesen.
Der Thallium (TI+)-Flusstest verwendet TI+ als Surrogation für K+ aufgrund seiner hohen Bindungsaffinität zur K+-Stelle auf KCC2 und NKCC2. Der TI+-Einstrom in Zellen konnte mit einem thalliumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff wie Benzothiazolcumarin und Fluozin-2 nachgewiesen werden. Nach dem Transport durch den Kanal kann sich TI+ mit dem BTC/Fluozin-2-Farbstoff verbinden, was zu einer fluoreszierenden Änderung führt, die vom fluorometrischen Bildplattenleser31 erkannt werden kann. TI+-Indikatorfarbstoffe gelangen als Acetoxymethylester in Zellen, die dann durch zytoplasmatische Esterasen gespalten werden, um die aktiven fluorogenen Formen freizusetzen. Um die KCCs zu aktivieren, werden die Zellen mit einer Mischung aus K+ und Tl+ in Gegenwart oder Abwesenheit von Testverbindungen (z. B. KCC2-Inhibitoren) stimuliert. Thallium tritt in den Fluoreszenzfarbstoff ein und bindet an ihn. Die Zunahme des Fluoreszenzsignals ist proportional zum Einstrom von Tl+ in die Zelle spezifisch durch den Cotransporter und stellt daher eine funktionelle Messung der Cotransporteraktivität dar. Diese Methode wurde auch gut bei der Messung der KCC2- und NKCC2-Aktivität in verschiedenen Arten von Zellkulturen angewendet, zum Beispiel Studien an HEK293-Zelllinien, die stabil humanes KCC234 exprimieren. Auf der Demerit-Seite gibt es eine Vielzahl potenzieller Off-Target-Pfadlinien, die den TI + -Zustrom stören könnten, zum Beispiel könnte Na + / K + ATPase in HEK293-Zellen eine höhere falsch positive oder falsch negative Trefferrate verursachen35. Darüber hinaus bleibt die Implementierung eines solchen Ansatzes, wie bei anderen Flussassays, in neuronalen Zellen aufgrund des schlechten Überlebens neuronaler Zellen nach mehreren Waschschritten begrenzt. Die neuronale Expression mehrerer K+-Kanäle und Transporter kann auch die genaue Beurteilung von KCC2-spezifischen K+-Flüssen behindern. Diese Technik stellt Einschränkungen für die Untersuchung von Kanälen in kleinen neuronalen Kompartimenten wie Dendriten und dendritischen Dornen dar, und die Axone sind auf mangelnde räumliche Auflösung in Verbindung mit niedriger zeitlicher Auflösung zurückzuführen.
Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert. Im Allgemeinen beruhen elektrophysiologische Messungen der SLC12-Funktion auf dem Prinzip, dass die GABA-A-Rezeptoren (GABAA R) für Chlorid36 durchlässig sind. KCC2 ist der Schlüssel zur Modulation der GABAergen Hemmung. Insbesondere liegt die [Cl-]i-Extrusionsaktivität von KCC2 der Hyperpolarisation von GABAAR6 zugrunde. Intrazelluläre Aufzeichnungen liefern entscheidende Erkenntnisse durch die Extrapolation der Chloridextrudierungskapazität von KCC2 aus der Umkehrung des Potentials von GABAAR-vermittelten Strömen (EGABA). Eine hyperpolarisierteE-GABA deutet auf einen niedrigeren [Cl-]i und damit auf eine Erhöhung der Aktivität von KCC2 hin. Die Gramicidin Patch-Clamp-Technik in der Elektrophysiologie ist ein Goldstandardansatz zur Messung der GABA-Aktivität. Einige zuvor veröffentlichte Studien haben Gramicidin Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet, um die Funktionen und Aktivitäten von KCC2 zur Beurteilung / Überwachung der [Cl-]i-Homöostase zu untersuchen haben sich tatsächlich als erfolgreich erwiesen 8,9,37,38,39,40 . Während einer Gramicidin Patch-Clamp-Aufzeichnung wird eine dichte Abdichtung auf der Zell-/Gewebeoberfläche erzeugt, wobei eine Glaselektrode mit einem relativen Pflaster verwendet wird, um die intrazelluläre Aktivität von Ionenkanälen in Bezug auf eine andere Elektrode in einem Bad, das die Zelle / das Gewebe umgibt, aufzuzeichnen. Diese Technik kann durchgeführt werden, indem die Strommenge gemessen wird, die die Membran einer Zelle mit einer festen Spannung im Spannungsklemmmodus durchquert, oder durch Aufzeichnung der Spannungsmenge, die sich mit einem festen Strom im Stromzangenmodus36 über die Membran bewegt. Es können mehrere Variationen der Grundtechnik angewendet werden, die weitgehend von der Forschungsfrage abhängen. Die Technik erzeugt keine relativ große porenartige Ganzzellpflasteraufzeichnung, sondern das porenbildende Antibiotikum (Gramicidin), das in der Elektrodenlösung enthalten ist, wird verwendet, um kleine Poren in der Membran36 zu bilden. Insbesondere durch die Zugabe von Gramicidin entstehen kationenselektive Poren in der Membran, die eine unbedeutende Anionenpermeabilität aufweisen. Spannungsrampenprotokolle sind eine effektive und zuverlässige Alternative zur Stromaufzeichnung bei konstanter Spannung. Die Strom-Spannungs-Beziehungen, die mit Spannungsrampenprotokollen erhalten werden, scheinen eine bessereAufzeichnung von GABA-A-R-vermittelten Membranströmen zu ergeben. In diesem Protokoll wird eine sich ständig ändernde, aber überwachte Spannung (mit einer konstanten Rate) angelegt und der Strom wird ständig gleichzeitiggemessen 36,41. Während dieses Protokolls wird die Anwendung von Spannungsimpulsen (normalerweise in hyperpolarisierender Richtung) verwendet, um den Leckstrom als Ergebnis ohmscher Reaktionen zu aktivieren. Typischerweise werden die GABAAR-vermittelten Membranströme aus dem Leckstrom (d. h. den Umkehrpotentialen der lecksubtrahierten Agonistenströme) berechnet36. Die aus diesem Protokoll gewonnenen Strom-Spannungs-Assoziationen helfen, besser zu verstehen, wo die Änderungen der Ionenkonzentrationen während eines experimentellen Szenarios mit GABA-A-Rezeptorkanälen auftreten. Yelhekar et al.41 verwendeten ein Computermodell, um zu zeigen, dass Schlussfolgerungen zu stabilen Ionenkonzentrationen aus der Interpolationsmethode möglicherweise nicht gerechtfertigt sind, da das geschätzte Umkehrpotenzial der Methode falsch sein kann.
Der durchschnittliche Widerstand für die meisten Aufnahmen beträgt 5 MΩ. Pipetten mit einem niedrigeren Widerstand von 3-4 MΩ können zu einem niedrigeren Serienwiderstand führen, der für Spannungsklemmenaufzeichnungen vorzuziehen ist. Die Spitze der Pipette wird jedoch bei Pipetten mit höherem Widerstand vergleichsweise breiter sein und stellt daher eine Herausforderung in Form von Schwierigkeiten bei der Dichtungsbildung und -stabilität dar36,42. Daher ist es notwendig, die GΩ-Bildung zu überwachen, um Aufzeichnungen mit einer erheblichen Reduzierung der erzeugten verrauschten Daten zu erhalten. Die Robustheit dieser Technik zur Untersuchung der Funktion und Aktivitäten von KCC2 anhand seiner Eignung und Zuverlässigkeit bei der Messung der GABA-Aktivität wurde durch mehrere Studien bestätigt. Frühere Studien haben gezeigt, dass [Cl-]i mit dieser Technik stabil bleibt, indem sie die Reaktionen von GABAARs (die in der Lage sind, die Chloridleitfähigkeit zu gaten) auf ihre jeweiligen Agonisten messen. Implizit kommt ein kontinuierlicher elektrischer Zugang mit wenig oder keiner Änderung der intrazellulären Chloridkonzentration43,44. Darüber hinaus erleichtert diese Technik die Umgehung künstlicher Änderungen des Membranpotentials und der E GABA während derGABA AR-Aktivierung (die die Chlorid- und Bicarbonatleitfähigkeit öffnet)45. Das oben genannte bietet dieser Technik einen Vorteil gegenüber anderen Arten von elektrophysiologischen Aufnahmen. Die Einschränkungen dieser Technik umfassen jedoch Folgendes: (1) häufiges Aufnahmerauschen kann auftreten, da die Spitze der Elektrode einen Teil der Membran einnimmt, was die aktuelle Auflösung verringern kann, und (2) die Perforation der Membran mit Gramicidin dauert normalerweise relativ länger.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) und einem Commonwealth Ph.D. Stipendium unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
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