Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Исследование функций и активности нейронального K-Cl котранспортера KCC2 с использованием вестерн-блоттинга

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64179
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

В настоящем протоколе подчеркивается применение метода западного блоттинга для изучения функций и активности нейронального K-Cl сотранспортера KCC2. Протокол описывает исследование фосфорилирования KCC2 на регуляторных участках киназы Thr906/1007 посредством западного блоттинга. Кроме того, в этом тексте кратко освещаются дополнительные методы подтверждения активности KCC2.

Abstract

Котранспортеры хлорида калия 2 (KCC2) являются членом семейства растворенных носителей 12 (SLC12) катион-хлорид-котранспортеров (CCC), обнаруженных исключительно в нейроне и необходимых для правильного функционирования Cl-гомеостаза и, следовательно, функционального ГАМКергического ингибирования. Неспособность в надлежащей регуляции KCC2 вредна и связана с распространенностью нескольких неврологических заболеваний, включая эпилепсию. Был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов, участвующих в регулировании KCC2, аккредитованных для разработки методов, которые позволяют исследователям изучать его функции и деятельность; либо путем прямых (оценка фосфорилирования киназных регуляторных участков), либо косвенных (наблюдение и мониторинг активности ГАМК) исследований. Здесь протокол подчеркивает, как исследовать фосфорилирование KCC2 в регуляторных участках киназы - Thr906 и Thr1007 - с использованием метода западного блоттинга. Существуют и другие классические методы, используемые для непосредственного измерения активности KCC2, такие как анализ поглощения ионов рубидия и таллия. Для измерения активности ГАМК используются другие методы, такие как электрофизиология пластыря-зажима; следовательно, косвенно отражая активированный и/или инактивированный KCC2, полученный в результате оценки внутриклеточного хлорид-ионного гомеостаза. Некоторые из этих дополнительных методов будут кратко рассмотрены в этой рукописи.

Introduction

Котранспортеры хлорида калия 2 (KCC2) являются членом семейства растворенных носителей 12 (SLC12) катион-хлорид-котранспортеров (CCC), обнаруженных исключительно в нейроне и необходимых для правильного функционирования Cl-гомеостаза и, следовательно, функционального ГАМКергического ингибирования 1,2,3,4. Поддержание низкой внутринейрональной концентрации Cl- ([Cl-]i) при 4-6 мМ KCC2 способствует гиперполяризации γ-аминомасляной кислоты (ГАМК)/глицина и синаптическому ингибированию в головном и спинном мозге5. Сбой в правильной регуляции KCC2 был связан с распространенностью нескольких неврологических заболеваний, включая эпилепсию4. Кроме того, снижение KCC2-опосредованной Cl−экструзии и нарушение гиперполяризующих токов ГАМКА и/или глициновых рецепторов были вовлечены в эпилепсию, невропатическую боль и спастичность 6,7. Нейрональный KCC2 отрицательно модулируется путем фосфорилирования ключевых регуляторных остатков в его С-концевом внутриклеточном домене с помощью сигнального комплекса1, связанного с пролином/богатым аланином (SPAK)/окислительным стрессом (OSR), который облегчает поддержание деполяризованной активности ГАМК в незрелых нейронах 2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1 фосфорилирует остатки треонина 906 и 1007 (Thr906/Thr1007) и впоследствии понижает экспрессию гена мРНК KCC2, что приводит к последующему ухудшению его физиологической функции 8,10. Что еще более важно, однако, уже фактом является то, что киназный комплекс WNK-SPAK/OSR1, как известно, фосфорилирует и ингибирует экспрессию KCC2 1,2,4,11,12, и что ингибирование сигнальных путей комплекса киназы к фосфорилату Thr906/Thr1007 было связано с повышенной экспрессией гена мРНК KCC2 13,14,15 . Важно отметить, что регуляция экспрессии нейронных KCC2 и Na+-K+-2Cl-котранспортеров 1 (NKCC1) посредством фосфорилирования белка работает одновременно и в обратных паттернах 1,4,16.

Был достигнут последовательный и значительный прогресс в отношении понимания механизмов, участвующих в регулировании KCC2, аккредитованных для разработки методов, которые позволяют исследователям изучать его функции и деятельность; либо путем прямых (оценка фосфорилирования киназных регуляторных участков), либо косвенных (наблюдение и мониторинг активности ГАМК) исследований. Протокол, представленный здесь, подчеркивает применение методов западного блоттинга для изучения функций и активности нейронального K+-Cl-ко-транспортера KCC2 путем исследования фосфорилирования котранспортера в регуляторных участках киназы Thr906/1007.

Вестерн-блот — это метод, используемый для обнаружения специфических белков, представляющих интерес, из образца ткани или клетки. Этот метод сначала разделяет белки по размеру с помощью электрофореза. Затем белки электрофоретически переносятся на твердую опору (обычно мембрану), прежде чем целевой белок будет помечен с использованием специфического антитела. Антитела конъюгируются с различными метками или флуорофорно-конъюгированными антителами, которые обнаруживаются с использованием колориметрического, хемилюминесцентного или флуоресцентного методов. Это позволяет обнаружить конкретный белок-мишень из смеси белков. Этот метод был использован для характеристики фосфосфоспецифических участков KCCs1 и был использован для идентификации ингибиторов киназы, которые ингибируют фосфорилирование KCC3 Thr991/Thr104817. Следуя этому протоколу, можно специфически обнаружить тотальный и фосфорилированный KCC2 из лизатов клеток / тканей. В принципе, обнаружение белково-конъюгированных антител с помощью этого метода является очень полезным, поскольку оно помогает улучшить понимание совместной деятельности на фосфо-сайтах KCC2, что проливает свет на молекулярные механизмы, участвующие в их физиологических нормах. Количественный анализ экспрессии общего белка репрезентативен для функции и активности KCC2. Существуют и другие классические методы, используемые для непосредственного измерения активности KCC2, такие как анализ поглощения ионов рубидия и таллия. Для измерения активности ГАМК используются другие методы, такие как электрофизиология пластыря-зажима; следовательно, косвенно отражая активированный и/или инактивированный KCC2, полученный в результате оценки внутриклеточного хлорид-ионного гомеостаза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описывает метод вестерн-блоттинга для обнаружения специфических белков, представляющих интерес.

1. Клеточная культура и трансфекция

  1. Разогрейте все реагенты в бисерной ванне (37 °C) перед процедурой культивирования клеток. Приготовьте культуральную среду, модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% каждой из 2 мМ L-глутамина, 100x заменимой аминокислоты, 100 мМ пирувата натрия и 100 единиц / мл пенициллина-стрептомицина.
  2. Оттаивание стабильно трансфицированной крысы KCC2b эмбриональной почки человека 293 клетки (HEK293rnKCC2b)18 полностью в бисерной ванне (37 °C). Переведите клетки из криовиальной трубки в центрифужную трубку, содержащую 5 мл свежей среды. Вращайте ячейку при 1200 ×г в течение 3-5 мин.
  3. Используйте аспираторную пипетку (прикрепленную к вакуумному насосу) для аспирации супернатанта и добавьте 10 мл свежей среды для повторной приостановки клеток. Переложите суспензию ячейки на тарелку размером 10 см.
  4. Поместите блюдо в инкубатор и дайте ему расти в течение 48 ч при 37 °С в увлажненной 5% co2 атмосфере. Следите за инкубационным периодом, чтобы обеспечить здоровый рост клеток. Дальнейшее расщепление клеток, когда они достигают более 90% слияния после инкубационного периода.
  5. Аспирируйте старую среду из чашки клеток и осторожно промывайте клетки 2 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS). Добавьте 2 мл трипсина и инкубируйте около 1-2 мин при комнатной температуре.
  6. Используйте 2 мл полной среды, чтобы аккуратно вымыть трипсинизированные клетки в посуде. Добавьте 9 мл свежей среды в новые блюда и добавьте по 1 мл раствора из старого блюда в каждое из новых. Перенесите расщепленные клеточные чашки обратно в инкубатор на 48 ч, чтобы достичь ≥ 90% слива.
  7. Обрабатывайте клетки либо диметилсульфоксидом (DMSO) в качестве контроля, 8 мкМ ставроспорина или 0,5 мМ N-этилмалеймида (NEM) в течение 15 мин перед сбором клеток в буфере лизиса.

2. Подготовка клеточных лизатов и загрузка образцов

  1. Аспирировать носители на блюде культуры (от процедур трансфекции). Поместите культуру клеток на лед и промыть клетки ледяным PBS.
  2. Аспирировать PBS, затем добавить 1,0 мл ледяного буфера лизиса, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 1 мМ этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N',N'-тетрауксусную кислоту (ЭГТА), 1 мМ этилендиаминеттрауксусной кислоты (ЭДТА), 50 мМ фторида натрия, 5 мМ пирофосфата натрия, 10 мМ натрия-β-глицерофосфата, 1 мМ ортованадата натрия, 1% (мас./об.) тритона X-100, 0,27 М сахарозы, 1 мМ бензамина, 0,1% (v/v) 2-меркаптоэтанола и 2 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) на блюдо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем лизисного буфера во время сбора клеток варьируется в зависимости от размеров чашки, например, 1 мл лизисного буфера подходит на 1 х 107 ячеек / 100 мм чашки / 150 см2 колбы, в то время как 0,5 мл подходит на 5 х 106 ячеек / 60 мм тарелки / 75 см2 колбы.
  3. Используйте холодный пластиковый скребок, чтобы соскоблить ячейки со дна чашки, затем осторожно используйте пипетку, чтобы перенести клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку, уже находящуюся на льду. Постоянно перемешивайте пробирку в течение 30 мин при 4 °C.
  4. Раскрутите лизаты клетки в холодной центрифуге (4 °C) при 16 000 х г в течение 20 минут, аккуратно извлеките трубку из центрифуги и поместите ее на лед. Соберите супернатант в предварительно охлажденную свежую трубку и выбросьте гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться варьировать силу центрифугирования и время в зависимости от типа ячейки. Тем не менее, общие рекомендации поощряют центрифугирование при 16 000 х г в течение 20 минут. Однако это должно быть определено для каждого эксперимента. Например, нежные клетки, такие как лейкоциты, нуждаются в очень легкой скорости центрифугирования.

3. Получение иммунопреципитантов из клеточных лизатов

  1. Пипетка 300 мкл белка-G-сефарозы в микроцентрифужную трубку. Раскрутите раствор при 500 х г в течение 2 мин и выбросьте надосадочный материал.
  2. Добавьте 500 мкл PBS и хорошо вращайте раствор. Раскрутите раствор при 500 х г в течение 2 мин и выбросьте надосадочный материал. Повторите этот шаг.
  3. Смешайте 1 мг анти-KCC2 Thr906 и анти-KCC2 Thr1007 антител с 200 мкл белка G-сефарозных шариков и составляйте объем до 500 мкл с PBS. Встряхивайте на вибрирующей платформе или вращающемся колесе в течение 2 ч при 4 °C. Мойка 2x с PBS.
  4. Проводят количественную оценку белка на всех клеточных лизатах и добавляют 1 мг клеточного лизата в промытые шарики. Осторожно инкубируют в сквозном ротаторе в течение 2 ч при 4 °C. Открутите шарики и промыть их в 3 раза PBS, содержащим 150 мМ хлорида натрия (NaCl).
  5. Промыть иммунопреципитанты (шарики) 3x с 200 мкл PBS. Повторное суспендирование конечной гранулы в 100 мкл 1x буфера образца додецилсульфата лития (LDS).
  6. Встряхните трубки в роторном шейкере при комнатной температуре в течение 5 мин и высиживайте их в нагревательном блоке при 75 °C в течение 10 мин. Центрифугируйте нагрузочный образец при 11 000 х г в течение 2 мин и используйте супернатант для загрузки геля.

4. Выполнение вестерн-блот

  1. Соберите литейный аппарат и залейте свежеприготовленным 8% разделительным гелем (см. Таблицу 1 для рецепта/приготовления), чтобы отлить гель, давая около 2 см пространства от верхней части литейного стекла. Добавьте 200 мкл абсолютного изопропанола в установку и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт полиакриламидного геля для электрофореза додецилсульфат-полиакриламидного геля (SDS-PAGE) зависит от размера интересующего белка (таблица 2). Следовательно, запишите размер белка, прежде чем определять желаемый процент геля.
  2. Используйте пипетку для удаления изопропанола и тщательно промойте гель примерно 200 мкл дистиллированной воды. Добавьте свежеприготовленный 6% гель для укладки (рецепт/приготовление см. в таблице 1 ), чтобы заполнить примерно 2 см пространства на литье. Аккуратно вставьте в колодец гребень и дайте постоять при комнатной температуре 30 мин.
  3. Закрепите отлитый гель в резервуаре для электрофореза.
  4. Растворите 30,3 г основы Tris, 144,1 г г глицина и 10 г SDS в 1000 мл дистиллированной воды для приготовления 10-кратного буфера переноса. Подготовьте 1x работающий буфер, добавив 10 мл 10% SDS и 100 мл 10x буфера переноса в 890 мл дистиллированной воды.
  5. Налейте 1x бегущий буфер в резервуар. Загрузите 5 мкл маркера молекулярной массы в первую лунку и равное количество белка в каждую лунку геля SDS-PAGE (между 18-30 мкл, в зависимости от используемого размера гребня). Заполните пустые колодцы 1x LDS и запустите гель около 90-120 мин при 120 В.
  6. Растворите 58,2 г основы Tris и 29,3 г г глицина в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы подготовить 10-кратный буфер переноса. Активация нитроцеллюлозной мембраны с помощью 1x переносного буфера, содержащего 20% метанола. Промойте гель и мембрану с помощью переносного буфера и аккуратно распределите их по подготовительному стеку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости регулировать pH работающих и передающих буферов, так как они должны быть на оптимальном требуемом pH. Также желательно подготовить эти буферы и хранить их при комнатной температуре перед экспериментом, чтобы сэкономить время.
  7. Расположите сэндвич для переноса в следующем порядке: отрицательный электрод (черная рамка/конец) - сэндвич-пена - фильтровальная бумага - промытый гель SDS-PAGE - промытая нитроцеллюлозная мембрана - фильтровальная бумага - сэндвич-пена - положительный электрод (красная рамка). Сложите собранный сэндвич в передаточный бак и работайте при 90 В в течение 90 минут или 30 В в течение 360 минут.

5. Окрашивание антител и развитие изображения

  1. Снимите мембрану и дайте ей высохнуть. Блокируют мембрану в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью блокирующего буфера, изготовленного из 5% обезжиренного молока в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. Инкубируют мембраны с соответствующими разведениями первичных антител 8,15,19 и бета-актина (контроль нагрузки) в блокирующий буфер в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4°С. Промывайте мембрану в три промывки по 1x TBS-T в течение 5 мин каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация отдельной мембраны с элементами контроля нагрузки, такими как бета-актин, альфа-тубулин или антитела к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе, должна нормализовать другие результаты западного блоттинга во время последующей количественной оценки. Рекомендуемое разведение для каждого первичного антитела доступно в руководстве производителя.
  3. Инкубируют промытую мембрану вторичным антителом, разбавленным в 5000 раз в блокирующем буфере в течение 60 мин при комнатной температуре. Снова промыть мембрану 3x в 1x TBS-T в течение 5 минут каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется, чтобы вторичное антитело было поднято против вида, у которого выращивается первичное антитело. Например, если первичным антителом общего KCC2 является мышиный анти-KCC2, то необходимо использовать вторичное антитело для антимышечного.
  4. Поместите промытую мембрану на плату для визуализации. Смешайте равные объемы каждого реагента усиленной хемилюминесценции (ECL) и осторожно распределите смешанный раствор по мембране для выработки сигналов.

6. Получение изображений с помощью системы визуализации и количественной оценки данных

  1. Перенесите плату визуализации в соответствующий отсек системы визуализации для визуализации. Откройте программное обеспечение для обработки изображений на компьютере для обработки изображений.
  2. На панели инструментов щелкните Новый протокол и выберите Одноканальный. Нажмите кнопку «Выбрать » в диалоговом окне «Гелевая визуализация/применение», прокрутите до пункта «Blot» и выберите «Chemi Hi Sensitivity» или «Chemi Hi Resolution». Затем нажмите «Настройка накопления сигнала», чтобы установить продолжительность и количество изображений для получения.
  3. Нажмите Позиционировать гель под настройкой протокола и при необходимости отрегулируйте гель в системе визуализации. Щелкните Запустить протокол , чтобы получить образы.
  4. Щелкните правой кнопкой мыши одно из полученных изображений в каталоге изображений, чтобы сохранить изображения на компьютере. Перейдите к нужному изображению и нажмите Выбрать изображение и продолжить в диалоговом окне запуска.
  5. Щелкните значок Image Transform (Преобразование изображения ), чтобы настроить контрастность и насыщенность изображения в пикселях. Нажмите на значок Скриншот на общей панели инструментов, чтобы сохранить изображение на компьютере в зависимости от желаемого формата изображения.
  6. Измерьте плотность полос с помощью программного обеспечения ImageJ и проанализируйте с помощью соответствующих статистических инструментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь репрезентативный результат, представленный на рисунке 1, исследовал влияние ставроспорина и NEM на опосредованное WNK-SPAK/OSR1 фосфорилирование KCC2 и NKCC1 в клеточных линиях HEK293, стабильно экспрессирующих KCC2b (HEKrnKCC2b)18 с использованием метода западного блоттинга. Подробные сведения о репрезентативных результатах обсуждаются в Zhang et al.15. Подобно NEM, ставроспорин является ингибитором широкой киназы, который может усиливать транспортную активность KCC2 и ингибировать активность NKCC115,20. Обработка клеток HEK293 ставроспорином и NEM вызывала снижение фосфорилирования на целевых участках SPAK - Thr233, расположенных в домене киназы Т-петли, и в S-петлевом фосфорилировании Ser373 hsSPAK. Таким образом, оба соединения сократили уровни фосфорилирования вышеупомянутых фосфо-сайтов SPAK. Кроме того, ставроспорин уменьшал фосфорилирование Ser940 в HEKrnKCC2b, но NEM значительно увеличивал его фосфорилирование. Кроме того, ставроспорин уменьшает фосфорилирование на участке Thr505, тогда как NEM вызывает незначительное, но незначительное увеличение фосфорилирования на том же участке. Дифференциальное влияние обоих соединений на фосфорилирование протеинкиназы C (PKC) на участке Thr505 и KCC2b на сайте Ser940 хорошо коррелирует. Репрезентативный результат также показал, что оба агента изменяли экспрессию общего rnKCC2b, hsNKCC1 или hsSPAK. NEM (но не лечение ставроспорином) вызывало значительное увеличение экспрессии общего количества KCC2, тогда как экспрессия общего количества NKCC1 и SPAK не была достоверно изменена при лечении обоими соединениями. Кроме того, эти два соединения вызвали снижение фосфорилирования SPAK на участках Thr233 и Ser373, и это коррелировало с сокращенным фосфорилированием участков Thr906/Thr1007 и Thr203/207/212 в участках rnKCC2b и hsNKCC1, соответственно. Кроме того, ставроспорин и NEM уменьшали и увеличивали фосфорилирование PKC на участке Ser940 в rnKCC2b, соответственно, что коррелировало с уменьшением и увеличением фосфорилирования PKC-δ на участке Thr505 при лечении ставроспорином и NEM соответственно (рисунок 1).

Figure 1
Рисунок 1: Количественные анализы rnKCC2b и hsNKCC1 фосфо-сайтов при лечении ставроспорином и NEM в heKrnKCC2b клетках. (A) Стабильно трансфектированные heKrnKCC2b клетки обрабатывали DMSO (контроль), 8 мкМ ставроспорина или 0,5 мМ NEM в течение 15 мин. Клеточные лизаты собирали и подвергали иммунопреципитации (IP) и иммуноблоту (IB) с указанными антителами. Сокращения: D = димерный KCC2; M = мономерный KCC2. (B) Количественная оценка иммуноблота стабильно трансфектированных HEKrnKCC2b клеток. Интенсивность полосы была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ. p < 0,001; **p < 0,01; Тест Уилкоксона-Манна Уитни (n = 6). Эта цифра была изменена по сравнению с Zhang et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

8 мл 8% разделительного геля 5 мл 6% геля для укладки
Необходимые материалы Объем (мкл) Необходимые материалы Объем (мкл)
Дистиллированный H2O 4200 Дистиллированный H2O 2900
40% акриламид 1600 40% акриламид 750
1,5 М Трис рН 8,8 2000 0,5 М Трис рН 6,8 1250
10% SDS 80 10% SDS 50
10% APS 80 10% APS 50
ТЕМЕД 8 ТЕМЕД 5
Изготовление разделительного геля:
1) Начало с 4,2 мл ddH2O
2) Добавьте 1,6 мл 40% раствора акриламида/бис-акриламида
3) Добавьте 2 мл 1,5 M Tris pH 8,8 и перемешайте
4) Смесь в 80 мкл 10% SDS
5) Когда все будет готово к употреблению, добавьте 8 мкл TEMED и перемешайте
6) Добавить 80 мкл 10% APS* и перемешать
Изготовление укладочного геля:
1) Начните с 2,9 мл ddH2O
2) Добавьте 0,75 мл 40% раствора акриламида/бис-акриламида
3) Добавьте 1,25 мл 0,5 M Tris pH 6,8 и перемешайте
4) Смешать в 50 мкл 10% SDS
5) Когда все будет готово к употреблению, добавьте 5 мкл TEMED и перемешайте
6) Добавить 50 мкл 10% APS* и перемешать
SDS = Додецилсульфат натрия
APS = аммония на сульфат
TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-тетраметилэтилендиамин
*При добавлении АПС раствор следует немедленно влить в литейный аппарат, поскольку раствор полимеризуется в течение нескольких минут. Следовательно, желательно готовить сепарирующие и укладывающие гелевые растворы примерно тогда, когда растворы необходимы.

Таблица 1: Рецепт приготовления полиакриламидной гелевой смеси (разделение и укладка гелевых растворов).

Процент геля (%) Размер белка (кДа)
До 20 от 4 до 40
15 12 до 45
12.5 от 10 до 70
10 от 15 до 100
8 50 до 200
4 до 6 > 200

Таблица 2: Рекомендуемый процент геля SDS-PAGE для различных размеров белков

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Многие методы были использованы для измерения активности SLC12 CCC, которые экспрессируются в нейронах, включая KCC2. Многие из этих методов доказали, что расширяют научные знания по анализу функциональной значимости этих транспортеров и их структурно-функциональных паттернов в различных мутациях, связанных с заболеванием. Критически важно, что существуют преимущества и предостережения для различных методов21. Тем не менее, протокол, объясненный выше, изложил, как оценивать фосфорилирование KCC2 на регуляторных участках киназы, Thr906 и Thr1007, используя вестерн-блоттинг, который может быть полезен при изучении функций и активности KCC2.

Регуляция KCC2 происходит путем фосфорилирования и дефосфорилирования в ключевых остатках серина/треонина1. Вестерн-блоттинг является эффективным методом, который может быть использован для исследования фосфорилирования KCC2 в регуляторных участках киназы в Thr906 и Thr1007. В принципе, изменения фосфорилирования KCC2 обнаруживаются с помощью фосфоспецифических антител, направленных против фосфопептидов интересующих иммуноблотов образцов/белков. Вестерн-блот — это метод, используемый для обнаружения специфического белка, представляющего интерес, из образца ткани или клетки. Этот метод сначала разделяет белки по размеру с помощью электрофореза. Затем белки электрофоретически переносятся на твердую опору (обычно мембрану), прежде чем целевой белок будет помечен с использованием специфического антитела. Антитела конъюгируются с различными метками или флуорофорно-конъюгированными антителами, которые обнаруживаются с использованием колориметрического, хемилюминесцентного или флуоресцентного методов. Это позволяет обнаружить конкретный белок-мишень из смеси белков. Этот метод был использован для характеристики фосфосфоспецифических участков KCC2 2,8 и был использован для идентификации ингибиторов KCC2, которые противостоят KCC2 Thr906/Thr1007 фосфорилирования15. Линии HEK293 использовались для нескольких экспериментов из-за их преимущества в экспериментах молекулярной биологии. Они быстро размножаются, просты в обслуживании и высокоэффективны для трансфекции и производства белка22. Тем не менее, некоторые считают, что он может быть не самым подходящим кандидатом для проведения нейробиологических экспериментов, потому что это не клетка, полученная из мозга, и, следовательно, ее физиологическая специфика может быть сомнительной в исследованиях нейробиологии. Однако предыдущие работы показали, что аналогичные результаты наблюдаются в экспрессии KCC2 в клетках HEK293 и фактических нейронных тканях / клетках15,23. Следовательно, актуальность HEK293 в исследованиях в области неврологии не может быть отброшена сразу.

В исследованиях, включающих анализ экспрессии белка методом западного блоттинга, особое внимание следует уделять выбору буферного состава лизиса, природе (типу и концентрации) моющего средства, которое будет использоваться24, и ингибиторам протеазы. Состав буфера должен быть оптимизирован в соответствии с целевым белком, чтобы облегчить его процессы солюбилизации и экстракции, а также обеспечить его легкое обнаружение западным пятном25. Мягкое моющее средство при низкой концентрации обычно требуется для растворимых белков, в то время как мембранные белки могут потребовать более сильных условий моющего средства. Тем не менее, сильные моющие средства могут нарушить взаимодействие, и комплексы могут быть потеряны. Как типы, так и концентрации моющих средств могут влиять на характер и активность белка, следовательно, необходимо придерживаться ограниченного/допустимого диапазона концентраций для этих моющих средств. Добавление ингибитора протеазы предотвратит деградацию белка-мишени эндогенными белками, а оптимальная рекомендуемая рабочая температура составляет 4 ° C для эффективного снижения протеолитических показателей. Иногда, в попытке достичь высококачественных сигналов иммуноблота для антител, которые дают плохие сигналы иммуноблота, иммунопреципитация (IP) проводится в качестве эксперимента для западного блоттинга. Этот метод является преимуществом, поскольку он облегчает взаимодействие между антигенами и их соответствующими антителами в их нативной конформации, предшествующей их последующему разделению и количественной оценке26. Таким образом, ИС может повысить качество результатов процедур западного блоттинга. Перед применением метода IP важно оценить наличие и эффективность экспрессии коиммунопреципитированных белков-партнеров в лизате путем анализа либо лизата всей клетки, либо входных фракций путем вестерн-блоттинга. Кроме того, предварительное знание молекулярной массы исследуемого белка необходимо перед приготовлением желаемых процентных гелевых растворов для электрофореза SDS-PAGE, поскольку размер белка влияет на просеивающий эффект гелевой матрицы.

Тем не менее, обнаружение белково-конъюгированных антител с помощью этого метода очень важно, поскольку оно помогает улучшить понимание совместной деятельности на фосфо-сайтах KCC2, которые могут предоставить информацию о фосфорилировании котранспортера и целостности сигнального пути, который может регулировать котранспортеры, для надежного прогнозирования активности котранспортера. Тем не менее, важно отметить, что метод западного блоттинга способен производить только полуколичественные данные, что означает, что метод подчеркивает только относительную оценку белковых выражений, но не абсолютную количественную оценку. Это связано с расхождениями в скоростях загрузки и переноса проб по отдельным полосам, которые отличаются на отдельных пятнах. Генерируемый обнаруженный сигнал также не является линейным и не отражает диапазон концентраций образцов27. Кроме того, статус фосфорилирования не может быть надежным фактором для сообщения об активности белка, поскольку такие вмешательства, как ингибиторы, мутации и взаимодействия белка с окружающей средой, могут напрямую влиять на активность белка без изменения уровня фосфорилирования 28,29,30. Таким образом, может быть более полезным использовать фосфоспецифические антитела в дополнение к другим биохимическим методам.

Как упоминалось ранее, существуют и другие классические методы, используемые для непосредственного измерения активности KCC2. Оценка KCC2 путем измерения радиоактивного потока 86Rb+ через мембрану гомогенных клеточных препаратов является популярным подходом. Этот метод использует активные радиоизотопы в качестве индикаторов, пропуская их через ионные каналы. Вкратце, интересующие клетки инкубируют в безкатионных растворах для ингибирования эндогенного KCC2 с последующей инкубацией со специфическими ингибиторами, такими как уабаин, а затем со средой поглощения, содержащей ингибитор и 86Rb+. Жидкостные сцинтилляционные счетчики используются для измерения/отслеживания активности, вытекающей из лизиса клеток. Тем не менее, этот метод является надежным, высокочувствительным и избирательным и менее подвержен нарушениям. Однако его применение не распространяется на ткани с несколькими типами клеток, такими как мозг или нейронные культуры. Более того, этот метод ограничивает изменения в разрешении концентрации ионов на субклеточном уровне. Кроме того, существуют вопросы безопасности, касающиеся потенциальной токсичности и опасности для здоровья при работе с радиоизотопами с коротким периодом полураспада (18,65 дня), характеризующимися высокоэнергетическим излучением (макс. 1,77 МэВ; макс. 1,08 МэВ)31. Это может в значительной степени указывать на непригодность для исследований нейрональных клеток, где обычно требуется большое количество клеток. Эти проблемы привели к разработке нерадиоактивного анализа эффлюкса 85Rb+ Terstappen 1999 в качестве альтернативы радиоактивному 86Rb+ для определения потоков ионов. Нерадиоактивный подход в значительной степени исключил радиоактивные анализы 86Rb+ для анализа K+ и неселективных катионных каналов в фармацевтической промышленности31. Нерадиоактивный анализ эффлюкса 85Rb+ включает в себя два основных процесса, первый из которых - клеточная культура и манипуляция, а второй - определение индикатора рубидия с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии (AAS). Этот метод прост в использовании, хотя он требует ряда экспериментов по проверке анализа и страдает от плохого временного разрешения32. Тем не менее, нерадиоактивный анализ эффлюкса 85Rb+ постепенно оказался надежным методом оценки KCC и NKCC33.

Анализ потока таллия (TI+) использует TI+ в качестве суррогатного иона для K+ из-за его высокого сродства связывания с сайтом K+ на KCC2 и NKCC2. Приток TI+ в клетки может быть обнаружен с использованием чувствительного к таллию флуоресцентного красителя, такого как бензотиазол кумарин и флуозин-2. После транспортировки по каналу TI+ может ассоциироваться с красителем BTC/флуозин-2, вызывая флуоресцентное изменение, которое может быть обнаружено фторометрическим считывателемпластин 31. Индикаторные красители TI+ попадают в клетки в виде ацетоксиметиловых эфиров, которые затем расщепляются цитоплазматическими эстеразами для высвобождения активных фторогенных форм. Для активации KCC клетки стимулируют смесью K+ и Tl+ в присутствии или отсутствии тестируемых соединений (например, ингибиторов KCC2). Таллий входит и связывается с флуоресцентным красителем. Увеличение флуоресцентного сигнала пропорционально притоку Tl+ в ячейку конкретно через котранспортер, и поэтому представляет собой функциональное измерение активности котранспортера. Этот метод также хорошо применялся при измерении активности KCC2 и NKCC2 в различных типах клеточных культур, например, в исследованиях клеточной линии HEK293, стабильно экспрессирующей KCC234 человека. На недостатке существует множество потенциальных линий внецелевых путей, которые могут мешать притоку TI+ , например, Na+/K+ ATPase в клетках HEK293 может вызвать более высокий уровень ложноположительного или ложноотрицательного попадания35. Более того, как и в случае с другими флюсовыми анализами, реализация такого подхода в нейрональных клетках остается ограниченной из-за плохой выживаемости нейрональных клеток после нескольких этапов промывки. Нейронная экспрессия нескольких каналов K+ и транспортера также может препятствовать точной оценке специфических потоков KCC2 K+ . Этот метод представляет ограничения для изучения каналов в небольшом нейронном компартменте, таких как дендриты и дендритные шипы, а также аксонов из-за отсутствия пространственного разрешения в сочетании с низким временным разрешением.

Для измерения активности ГАМК используются другие методы, такие как электрофизиология пластыря-зажима; следовательно, косвенно отражая активированный и/или инактивированный KCC2, полученный в результате оценки внутриклеточного хлорид-ионного гомеостаза. Как правило, электрофизиологические измерения функции SLC12 основаны на принципе, согласно которому рецепторы ГАМКА (ГАМКАР) проницаемы для хлорида36. KCC2 является ключевым в модуляции ГАМКергического ингибирования. В частности, экструзионная активность [Cl-]i KCC2 лежит в основе гиперполяризации ГАМКAR6. Внутриклеточные записи обеспечивают важнейшую информацию путем экстраполяции хлоридной экструзионной способности KCC2 от обращения потенциала R-опосредованных токов ГАМКА(EGABA). Гиперполяризованная ЕГАМК указывает на более низкий [Cl-]i и, следовательно, на увеличение активности KCC2. Метод грамицидина в электрофизиологии является золотым стандартом для измерения активности ГАМК. В некоторых ранее опубликованных исследованиях использовалась запись грамицидина для изучения функций и деятельности KCC2 для оценки / мониторинга [Cl-]i гомеостаза действительно оказались успешными 8,9,37,38,39,40 . Во время записи грамицидинового пластыря-зажима создается плотное уплотнение на поверхности клетки/ткани с помощью стеклянного электрода с относительным пластырем для записи внутриклеточной активности ионных каналов по отношению к другому электроду в ванне, окружающей клетку/ткань. Этот метод может быть выполнен путем измерения количества тока, который пересекает мембрану ячейки при фиксированном напряжении в режиме зажима напряжения или путем регистрации количества напряжения, движущегося через мембрану при фиксированном токе в режиме36 зажима тока. Может быть применено несколько вариаций базовой методики, которая во многом зависит от исследовательского вопроса. Метод не создает относительно большую пористую запись цельноклеточного пластыря, но порообразующий антибиотик (грамицидин), который содержится в растворе электрода, используется для формирования небольших пор в мембране36. В частности, добавление грамицидина создает катион-селективные поры в мембране, которые проявляют незначительную анионную проницаемость. Протоколы повышения напряжения являются эффективной и надежной альтернативой записи тока при постоянном напряжении. Отношения ток/напряжение, полученные с помощью протоколов рампы напряжения, по-видимому, дают лучшую запись R-опосредованных ГАМКАмембранных токов. В этом протоколе подается постоянно меняющееся, но контролируемое напряжение (с постоянной скоростью) и ток постоянно измеряется одновременно36,41. Во время этого протокола применение импульсов напряжения (обычно в гиперполяризующем направлении) используется для активации тока утечки в результате омических реакций. Как правило, ГАМКАR-опосредованные мембранные токи рассчитываются на основе тока утечки (т.е. потенциалов разворота токов агониста, вычитаемых из утечки)36. Ассоциации ток-напряжение, полученные из этого протокола, помогают обеспечить лучшее понимание того, где происходят изменения в концентрациях ионов во время экспериментального сценария с участием каналов рецептора ГАМКА. Yelhekar et al.41 использовали вычислительную модель, чтобы показать, что выводы о концентрациях стабильных ионов из метода интерполяции могут быть неоправданными, поскольку предполагаемый потенциал разворота из метода может быть неправильным.

Среднее сопротивление, используемое для большинства записей, составляет 5 МОм. Пипетки с более низким сопротивлением 3-4 МОм могут привести к более низкому последовательному сопротивлению, что предпочтительно для записей зажима напряжения. Тем не менее, наконечник пипетки будет сравнительно шире для пипеток с более высоким сопротивлением и, как следствие, представляет собой проблему в виде сложности формирования уплотнения и устойчивости36,42. Следовательно, необходимо контролировать образование GΩ для получения записей со значительным снижением уровня генерируемых шумных данных. Надежность этого метода для изучения функции и деятельности KCC2, оцениваемая его пригодностью и надежностью при измерении активности ГАМК, была подтверждена несколькими исследованиями. Предыдущие исследования показали, что [Cl-]i остаются стабильными с использованием этого метода путем измерения реакций ГАМКARs (которые способны заглушать проводимость хлорида) на их соответствующие агонисты. Подразумевается, что непрерывный электрический доступ происходит с незначительной или нулевой модификацией внутриклеточной концентрации хлорида43,44. Кроме того, этот метод облегчает обход искусственных изменений мембранного потенциала и ЕГАМК во время активации ГАМКАR (которая открывает проводимость хлорида и бикарбоната)45. Вышеупомянутое дает этой технике преимущество перед другими типами электрофизиологических записей. Однако ограничения этого метода включают следующее: (1) частая запись шума может возникать из-за того, что кончик электрода занимает часть мембраны, что может снизить разрешение тока, и (2) перфорация мембраны грамицидином обычно занимает относительно более длительное количество времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Королевским обществом Великобритании (грант No IEC\NSFC\201094) и стипендией Содружества Ph.D. Scholarship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

Tags

Биохимия выпуск 190
Исследование функций и активности нейронального K-Cl котранспортера KCC2 с использованием вестерн-блоттинга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F.,… More

Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter