Summary
Het huidige protocol benadrukt de toepassing van western blotting-techniek om de functies en activiteiten van neuronale K-Cl co-transporter KCC2 te bestuderen. Het protocol beschrijft het onderzoek naar KCC2-fosforylering op kinaseregelplaatsen Thr906/1007 via western blotting. Ook aanvullende methoden om KCC2-activiteit te bevestigen worden kort gemarkeerd in deze tekst.
Abstract
Kaliumchloride cotransporters 2 (KCC2) is een lid van de opgeloste dragerfamilie 12 (SLC12) van kation-chloride-cotransporters (CCC's), uitsluitend aangetroffen in het neuron en is essentieel voor de goede werking van Cl-homeostase en bijgevolg functionele GABAerge remming. Falen in de juiste regulatie van KCC2 is schadelijk en is in verband gebracht met de prevalentie van verschillende neurologische ziekten, waaronder epilepsie. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot het begrijpen van de mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van KCC2, geaccrediteerd voor de ontwikkeling van technieken die onderzoekers in staat stellen de functies en activiteiten ervan te bestuderen; hetzij via direct (beoordelen van kinase regulerende sites fosforylering) of indirecte (observeren en monitoren van GABA-activiteit) onderzoeken. Hier benadrukt het protocol hoe KCC2-fosforylering op kinase-regulerende locaties - Thr906 en Thr1007 - kan worden onderzocht met behulp van western blotting-techniek. Er zijn andere klassieke methoden die worden gebruikt om KCC2-activiteit direct te meten, zoals rubidiumion en thalliumion opname assay. Verdere technieken zoals patch-clamp-elektrofysiologie worden gebruikt om GABA-activiteit te meten; dus indirect reflecterend op geactiveerd en/of geïnactiveerd KCC2 zoals gebaseerd op de beoordeling van intracellulaire chloride-ionhomeostase. Een paar van deze aanvullende technieken zullen in dit manuscript kort worden besproken.
Introduction
Kaliumchloride cotransporters 2 (KCC2) is een lid van de opgeloste dragerfamilie 12 (SLC12) van kationchloride-cotransporters (CCC's), uitsluitend aangetroffen in het neuron en is essentieel voor de goede werking van Cl-homeostase en bijgevolg functionele GABAerge remming 1,2,3,4. Het behoud van een lage intraneuronale Cl-concentratie ([Cl-]i) bij 4-6 mM door KCC2 vergemakkelijkt γ-aminoboterzuur (GABA)/glycine hyperpolarisatie en synaptische remming in de hersenen en het ruggenmerg5. Falen in de juiste regulatie van KCC2 is in verband gebracht met de prevalentie van verschillende neurologische ziekten, waaronder epilepsie4. Bovendien zijn verminderde KCC2-gemedieerde Cl− extrusie en verminderde hyperpolariserende GABAA en/of glycine receptor-gemedieerde stromen betrokken bij epilepsie, neuropathische pijn en spasticiteit 6,7. Neuronale KCC2 wordt negatief gemoduleerd via fosforylering van belangrijke regulerende residuen binnen zijn C-terminale intracellulaire domein door het met-geen-lysine (WNK)-STE20/SPS1-gerelateerde proline/alanine-rijke (SPAK)/oxidatieve stress-responsieve (OSR) kinase signaleringscomplex1, wat het behoud van gedepolariseerde GABA-activiteit in onrijpe neuronenvergemakkelijkt 2,8,9 . De WNK-SPAK/OSR1 fosforyleert threonineresiduen 906 en 1007 (Thr906/Thr1007) en downreguleert vervolgens de mRNA-genexpressie van KCC2, wat leidt tot een daaruit voortvloeiende verslechtering van de fysiologische functie 8,10. Belangrijker is echter dat het al een feit is dat van het WNK-SPAK/OSR1-kinasecomplex bekend is dat het KCC2-expressie 1,2,4,11,12 fosforylaat en remt, en dat de remming van de kinasecomplexsignaleringsroutes naar fosforylaat Thr906/Thr1007 in verband is gebracht met de verhoogde expressie van het KCC2 mRNA-gen 13,14,15 . Het is belangrijk op te merken dat de regulatie van neuronale KCC2 en Na+-K+-2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) expressie via eiwitfosforylering gelijktijdig en in omgekeerde patronen werkt 1,4,16.
Er is consistente en aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot het begrip van mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van KCC2, geaccrediteerd voor de ontwikkeling van technieken die onderzoekers in staat stellen de functies en activiteiten ervan te bestuderen; hetzij via direct (beoordelen van kinase regulerende sites fosforylering) of indirecte (observeren en monitoren van GABA-activiteit) onderzoeken. Het hier gepresenteerde protocol benadrukt de toepassing van western blotting-technieken om de functies en activiteiten van neuronale K +-Cl- co-transporter KCC2 te bestuderen door de fosforylering van de cotransporter op kinase-regelgevende locaties Thr906/1007 te onderzoeken.
Western blot is een methode die wordt gebruikt om specifieke eiwitten van belang te detecteren uit een monster van weefsel of cel. Deze methode scheidt de eiwitten eerst op grootte door middel van elektroforese. De eiwitten worden vervolgens elektroforetisch overgebracht naar een vaste ondersteuning (meestal een membraan) voordat het doeleiwit wordt gemarkeerd met behulp van een specifiek antilichaam. De antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende tags of fluorofoor-geconjugeerde antilichamen die worden gedetecteerd met behulp van colorimetrische, chemiluminescentie of fluorescentiemethoden. Hierdoor kan een specifiek doeleiwit worden gedetecteerd uit een mengsel van eiwitten. Deze techniek is gebruikt om fosfospecifieke locaties van KCCCs1 te karakteriseren en is gebruikt om kinaseremmers te identificeren die KCC3 Thr991/Thr1048 fosforyleringremmen 17. Door dit protocol te volgen, kan men specifiek totaal en gefosforyleerd KCC2 detecteren uit cel/weefsellysaten. In principe is de detectie van eiwit-geconjugeerde antilichamen door deze techniek zeer instrumenteel omdat het helpt om het begrip van samenwerkingsactiviteiten op de fosfo-locaties van KCC2 te verbeteren, wat licht werpt op de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij hun fysiologische regulaties. De kwantitatieve analyse van de totale eiwitexpressie is representatief voor de functie en activiteit van KCC2. Er zijn andere klassieke methoden die worden gebruikt om KCC2-activiteit direct te meten, zoals rubidiumion en thalliumion opname assay. Verdere technieken zoals patch-clamp-elektrofysiologie worden gebruikt om GABA-activiteit te meten; dus indirect reflecterend op geactiveerd en/of geïnactiveerd KCC2 zoals gebaseerd op de beoordeling van intracellulaire chloride-ionhomeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het protocol beschrijft de western blotting-methode om specifieke eiwitten van belang te detecteren.
1. Celkweek en transfectie
- Verwarm alle reagentia in het kralenbad (37 °C) vóór de celkweekprocedure. Bereid kweekmedium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% elk van 2mM L-glutamine, 100x niet-essentieel aminozuur, 100 mM natriumpyruvaat en 100 eenheden / ml penicilline-streptomycine.
- Ontdooi stabiel getransfecteerde rat KCC2b menselijke embryonale nier 293 cellen (HEK293rnKCC2b)18 volledig in het kralenbad (37 °C). Breng de cellen van de cryoviale buis over in een centrifugebuis met 5 ml verse media. Draai de cel op 1200 ×g gedurende 3-5 min.
- Gebruik een aspiratorpipet (bevestigd aan een vacuümpomp) om het supernatant te aspirateren en voeg 10 ml verse media toe om de cellen opnieuw op te hangen. Breng de celsuspensie over op een schotelplaat van 10 cm.
- Plaats het gerecht in de broedmachine en laat het 48 uur groeien bij 37 °С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer. Controleer de incubatietijd om een gezonde celgroei te garanderen. Splits de cellen verder wanneer ze na de incubatietijd meer dan 90% samenvloeiing hebben bereikt.
- Zuig de oude media uit de cellenschaal en spoel de cellen voorzichtig af met 2 ml fosfaatbufferzoutoplossing (PBS). Voeg 2 ml trypsine toe en incubeer gedurende ongeveer 1-2 minuten bij kamertemperatuur.
- Gebruik 2 ml volledige media om de trypsinized cellen in de schaal voorzichtig te wassen. Voeg 9 ml verse media toe aan nieuwe gerechten en voeg 1 ml oplossing van het oude gerecht toe aan elk van de nieuwe gerechten. Breng de gesplitste celschalen gedurende 48 uur terug naar de incubator om ≥ 90% samenvloeiing te bereiken.
- Behandel de cellen met dimethylsulfoxide (DMSO) als controle, 8 μM staurosporine of 0,5 mM N-ethylmaleimide (NEM) gedurende 15 minuten voordat de cellen in lysisbuffer worden geoogst.
2. Bereiding van cellysaten en laden van monsters
- Aspirateer de media op de kweekschaal (van transfectieprocedures). Plaats de celcultuur op ijs en was de cellen met ijskoude PBS.
- Aspirateer de PBS, voeg vervolgens 1,0 ml ijskoude lysisbuffer toe met 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur (EGTA), 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 50 mM natriumfluoride, 5 mM natriumpyrofosfaat, 10 mM natrium-β-glycerofosfaat, 1 mM natriumorthopvanadaat, 1% (w/v) Triton X-100, 0,27 M sucrose, 1 mM benzamine, 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol en 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) in het gerecht.
OPMERKING: Het volume van de lysisbuffer tijdens de celoogst varieert met de grootte van de schotel, bijvoorbeeld 1 ml lysisbuffer is geschikt per 1 x 107 cellen / 100 mm schaal / 150 cm2 kolf, terwijl 0,5 ml geschikt is per 5 x 106 cellen / 60 mm schotel / 75 cm2 kolf. - Gebruik een koude plastic celschraper om de cellen van de bodem van de schaal te schrapen en gebruik vervolgens voorzichtig een pipet om de celsuspensie over te brengen in een microcentrifugebuis die al op ijs staat. Roer de buis constant gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Draai de cellates in een koude centrifuge (4 °C) bij 16.000 x g gedurende 20 minuten, verwijder de buis voorzichtig uit de centrifuge en plaats deze op ijs. Verzamel het supernatant in een voorgekoelde verse buis en gooi de pellet weg.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om de centrifugatiekracht en -tijd te variëren, afhankelijk van het celtype. Algemene richtlijnen moedigen echter centrifugatie aan bij 16.000 x g gedurende 20 minuten. Dit moet echter voor elk experiment worden bepaald. Delicate cellen zoals leukocyten hebben bijvoorbeeld een zeer lichte centrifugatiesnelheid nodig.
3. Bereiding van immunoprecipitanten uit cellysaten
- Pipetteer 300 μL eiwit-G-sepharose in een microcentrifugebuis. Draai de oplossing gedurende 2 minuten op 500 x g en gooi het supernatant weg.
- Voeg 500 μL PBS toe en vortex de oplossing goed. Draai de oplossing gedurende 2 minuten op 500 x g en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap.
- Meng 1 mg anti-KCC2 Thr906 en anti-KCC2 Thr1007 antilichamen met 200 μL eiwit G-sepharose kralen en vul het volume aan tot 500 μL met PBS. Schud op een trilplatform of draaiwiel gedurende 2 uur bij 4 °C. Was 2x met PBS.
- Voer eiwitkwantificering uit op de hele cellysaten en voeg 1 mg van het cellysaat toe aan de gewassen kralen. Incubeer voorzichtig in een end-to-end rotator gedurende 2 uur bij 4 °C. Draai de kralen naar beneden en was ze 3x met PBS dat 150 mM natriumchloride (NaCl) bevat.
- Was immunoprecipitanten (kralen) 3x met 200 μL PBS. Resuspendeer de laatste pellet in 100 μL lithium dodecylsulfaat (LDS) monsterbuffer.
- Schud de buizen in een rotorschudder bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en incubeer ze gedurende 10 minuten in een verwarmingsblok bij 75 °C. Centrifugeer het laadmonster bij 11.000 x g gedurende 2 minuten en gebruik het supernatant voor het laden van gel.
4. Het uitvoeren van de western blot
- Monteer het gietapparaat en giet vers bereide 8% scheidingsgel (zie tabel 1 voor recept/bereiding) om de gel te gieten met ongeveer 2 cm ruimte vanaf de bovenkant van het gietglas. Voeg 200 μL absolute isopropanol toe aan de opstelling en laat het 60 minuten op kamertemperatuur staan.
OPMERKING: Het polyacrylamide gel recept voor natrium dodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) is afhankelijk van de grootte van het eiwit van belang (tabel 2). Noteer daarom de eiwitgrootte voordat u het gewenste gelpercentage bepaalt. - Gebruik een pipet om de isopropanol te verwijderen en spoel de gel voorzichtig af met ongeveer 200 μL gedestilleerd water. Voeg vers bereide 6% stapelgel toe (zie tabel 1 voor recept/bereiding) om de ongeveer 2 cm ruimte op de gietopstelling te vullen. Plaats voorzichtig in de putkam en laat 30 minuten op kamertemperatuur staan.
- Bevestig de gegoten gel in de elektroforesetank.
- Los 30,3 g Tris-base, 144,1 g g glycine en 10 g SDS op in 1000 ml gedestilleerd water om 10x overdrachtsbuffer te bereiden. Bereid 1x lopende buffer voor door 10 ml 10% SDS en 100 ml 10x overdrachtsbuffer toe te voegen aan 890 ml gedestilleerd water.
- Giet 1x lopende buffer in de tank. Laad 5 μL moleculaire gewichtsmarker in de eerste put en een gelijke hoeveelheid eiwit in elke put van de SDS-PAGE-gel (tussen 18-30 μL, afhankelijk van de gebruikte kamgrootte). Vul lege putten met 1x LDS en laat de gel ongeveer 90-120 min op 120 V lopen.
- Los 58,2 g Tris-base en 29,3 g glycine op in 1000 ml gedestilleerd water om 10x transferbuffer te bereiden. Activeer nitrocellulosemembraan met 1x overdrachtsbuffer met 20% methanol. Spoel de gel en het membraan af met de transferbuffer en spreid ze voorzichtig uit op de bereidingsstapel.
OPMERKING: Het is niet nodig om de pH van de loop- en overdrachtsbuffers aan te passen, omdat deze op de optimale pH moeten zijn die vereist is. Ook is het raadzaam om deze buffers voor te bereiden en op kamertemperatuur te bewaren vóór het experiment om tijd te besparen. - Rangschik de over te brengen sandwich in deze volgorde: negatieve elektrode (zwart frame/uiteinde) - sandwichschuim - filterpapier - gespoelde SDS-PAGE-gel - gespoeld nitrocellulosemembraan - filterpapier - sandwichschuim - positieve elektrode (rood frame). Stapel de gemonteerde sandwich in de transfertank en laat 90 V draaien gedurende 90 minuten of 30 V gedurende 360 minuten.
5. Antilichaamkleuring en beeldontwikkeling
- Verwijder het membraan en laat het drogen. Blokkeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een blokkerende buffer gemaakt van 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
- Incubeer de membranen met geschikte verdunningen van primair antilichaam 8,15,19 en bèta-actine (belastingscontrole) in blokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C. Was het membraan in drie wasbeurten van 1x TBS-T gedurende elk 5 minuten.
OPMERKING: De incubatie van het afzonderlijke membraan met belastingscontroles zoals bèta-actine, alfa-tubuline of glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase-antilichamen is om de andere western blotting-resultaten te normaliseren tijdens de daaropvolgende kwantificering. De aanbevolen verdunning voor elk primair antilichaam is beschikbaar in de handleiding van de fabrikant. - Incubeer het gewassen membraan met secundair antilichaam verdund 5000-voudig in blokkerende buffer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Nogmaals, was het membraan 3x in 1x TBS-T gedurende 5 minuten elk.
OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen dat het secundaire antilichaam moet worden verhoogd tegen de soort waarin het primaire antilichaam is verhoogd. Als het primaire antilichaam van totaal KCC2 bijvoorbeeld muis anti-KCC2 is, moet het secundaire antilichaam voor antimuis worden gebruikt. - Plaats het gewassen membraan op de beeldplaat. Meng gelijke volumes van elk verbeterd chemiluminescentie (ECL) reagens en verspreid de gemengde oplossing voorzichtig op het membraan om signalen te ontwikkelen.
6. Beeldacquisitie met behulp van een beeldvormingssysteem en gegevenskwantificering
- Breng de imaging board over naar het juiste compartiment op het imaging systeem voor imaging. Open de beeldbewerkingssoftware op de computer voor beeldverwerking.
- Klik op de werkbalk op Nieuw protocol en kies Eén kanaal. Klik op Selecteren onder het dialoogvenster Gel Imaging/Application, scrol naar Blot en selecteer Chemi Hi Sensitivity of Chemi Hi Resolution. Klik vervolgens op Signal Accumulation Setup om de duur en het aantal te verkrijgen afbeeldingen in te stellen.
- Klik op Gel positioneren onder protocolinstellingen en pas de gel indien nodig aan in het beeldvormingssysteem. Klik op Protocol uitvoeren om de afbeeldingen te verkrijgen.
- Klik met de rechtermuisknop op een van de verkregen afbeeldingen onder het vak imaging-catalogus om de afbeeldingen op de computer op te slaan. Navigeer naar de gewenste afbeelding en klik op Afbeelding selecteren en doorgaan onder het dialoogvenster Uitvoeren.
- Klik op het pictogram Afbeelding transformeren om het contrast en de pixelverzadiging van de afbeelding aan te passen. Klik op het screenshot-pictogram op de algemene werkbalk om de afbeelding op de computer op te slaan, afhankelijk van het gewenste afbeeldingsformaat.
- Meet de banddichtheden met behulp van ImageJ-software en analyseer met behulp van geschikte statistische hulpmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier onderzocht het representatieve resultaat in figuur 1 de impact van staurosporine en NEM op WNK-SPAK/OSR1 gemedieerde fosforylering van KCC2 en NKCC1 in HEK293-cellijnen die KCC2b (HEKrnKCC2b)18 stabiel tot expressie brengen met behulp van de western blotting-techniek. Uitgebreide details over de representatieve resultaten worden besproken in Zhang et al.15. Net als NEM is staurosporine een brede kinaseremmer die de KCC2-transportactiviteit kan verbeteren en NKCC1-activiteitkan remmen 15,20. De behandeling van HEK293-cellen met staurosporine en NEM veroorzaakte verminderde fosforylering op SPAK-doellocaties - Thr233 gelegen in het T-luskinasedomein en de S-lus fosforyleringsplaats Ser373 van hsSPAK. Beide verbindingen verkortten dus de fosforyleringsniveaus van de eerder genoemde SPAK-fosfo-sites. Ook verminderde staurosporine de fosforylering van Ser940 in HEKrnKCC2b, maar NEM verhoogde de fosforylering aanzienlijk. Bovendien vermindert staurosporine de fosforylering op de Thr505-site, terwijl NEM een lichte, maar onbeduidende toename van fosforylering op dezelfde locatie veroorzaakte. De differentiële effecten van beide verbindingen op de fosforylering van eiwitkinase C (PKC) op de Thr505-site en KCC2b op de Ser940-site correleren goed. Het representatieve resultaat toonde ook aan dat beide agenten de expressie van totaal rnKCC2b, hsNKCC1 of hsSPAK veranderden. NEM (maar niet staurosporinebehandeling) veroorzaakte een significante toename van de expressie van de totale KCC2-hoeveelheid, terwijl de expressie van totale NKCC1 en SPAK niet significant veranderde bij behandeling met beide verbindingen. Bovendien veroorzaakten de twee verbindingen een verminderde fosforylering van SPAK op Thr233- en Ser373-locaties, en dit correleerde met de verkorte fosforylering van Thr906/ Thr1007- en Thr203/207/212-locaties in respectievelijk rnKCC2b en hsNKCC1. Bovendien verminderden en verhoogden staurosporine en NEM de fosforylering van PKC op de Ser940-locatie in respectievelijk rnKCC2b, wat correleerde met de vermindering en toename van de fosforylering van PKC-δ op de Thr505-locatie na respectievelijk staurosporine- en NEM-behandeling (figuur 1).
Figuur 1: Kwantitatieve analyses van rnKCC2b en hsNKCC1 fosfo-sites op staurosporine en NEM behandeling in HEKrnKCC2b cellen. (A) Stabiel getransfecteerde HEKrnKCC2b cellen werden behandeld met DMSO (controle), 8 μM staurosporine, of 0,5 mM NEM gedurende 15 min. Cellysaten werden geoogst en onderworpen aan immunoprecipitatie (IP) en immunoblot (IB) met geïndiceerde antilichamen. Afkortingen: D = dimeric KCC2; M = monomeer KCC2. (B) Immunoblot kwantificering van stabiel getransfecteerde HEKrnKCC2b cellen. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ-software. p < 0,001; **p < 0,01; Wilcoxon-Mann Whitney-test (n = 6). Dit cijfer is aangepast van Zhang et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 8 ml 8% scheidingsgel | 5 ml 6% stapelgel | ||
| Benodigde materialen | Volume (μL) | Benodigde materialen | Volume (μL) |
| Gedistilleerd H2O | 4200 | Gedistilleerd H2O | 2900 |
| 40% Acrylamide | 1600 | 40% Acrylamide | 750 |
| 1,5 M Tris pH 8,8 | 2000 | 0,5 M Tris pH 6,8 | 1250 |
| 10% SDS | 80 | 10% SDS | 50 |
| 10% APS | 80 | 10% APS | 50 |
| TEMED | 8 | TEMED | 5 |
| Het maken van de scheidingsgel: | |
| 1) | Begin met 4,2 ml ddH2O |
| 2) | Voeg 1,6 ml acrylamide/bis-acrylamideoplossing toe |
| 3) | Voeg 2 ml 1,5 M Tris pH 8,8 toe en meng |
| 4) | Meng er 80 μL 10% SDS door |
| 5) | Voeg, wanneer het klaar is voor gebruik, 8 μL TEMED toe en meng |
| 6) | Voeg 80 μL 10% APS* toe en meng |
| Het maken van de stapelgel: | |
| 1) | Begin met 2,9 ml ddH2O |
| 2) | Voeg 0,75 ml 40% acrylamide/bis-acrylamide-oplossing toe |
| 3) | Voeg 1,25 ml 0,5 M Tris pH 6,8 toe en meng |
| 4) | Meng er 50 μL van 10% SDS door |
| 5) | Voeg, wanneer klaar voor gebruik, 5 μL TEMED toe en meng |
| 6) | Voeg 50 μL 10% APS* toe en meng |
| SDS = Natriumdodecylsulfaat | |
| APS = Ammonium per sulfaat | |
| TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-tetramethyleendiamine | |
| * Na toevoeging van APS moet de oplossing onmiddellijk in het gietapparaat worden gegoten omdat de oplossing binnen enkele minuten polymeriseert. Daarom is het raadzaam om de scheidings- en stapelgeloplossingen ongeveer voor te bereiden wanneer de oplossingen nodig zijn. | |
Tabel 1: Recept voor het maken van polyacrylamide gelmix (scheiden en stapelen van geloplossingen).
| Gelpercentage (%) | Eiwit Grootte (kDa) |
| Tot 20 | 4 tot 40 |
| 15 | 12 tot 45 |
| 12.5 | 10 tot 70 |
| 10 | 15 tot 100 |
| 8 | 50 tot 200 |
| 4 tot 6 | > 200 |
Tabel 2: Aanbevolen SDS-PAGE gelpercentage voor verschillende groottes van eiwitten
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veel methoden zijn gebruikt om de activiteiten van SLC12 van CCC's te meten die tot expressie komen in de neuronen, waaronder KCC2. Veel van deze technieken hebben bewezen de wetenschappelijke kennis te vergroten over de analyse van de functionele relevantie van deze transporters en hun structuur-functiepatronen in verschillende ziektegerelateerde mutaties. Kritisch zijn er voordelen en kanttekeningen bij de verschillende methoden21. Het hierboven uitgelegde protocol schetste echter hoe KCC2-fosforylering op kinase-regulerende locaties, Thr906 en Thr1007, kan worden beoordeeld met behulp van western blot, wat nuttig kan zijn bij het bestuderen van de functies en activiteiten van KCC2.
De regulatie van KCC2 vindt plaats door fosforylering en defosforylering bij belangrijke serine/threonineresiduen1. Western blotting is een efficiënte techniek die kan worden gebruikt om KCC2-fosforylering te onderzoeken op kinase-regulerende locaties op Thr906 en Thr1007. In principe worden veranderingen in de fosforylering van KCC2 gedetecteerd met behulp van fosfo-specifieke antilichamen gericht tegen fosfo-peptiden van de immunoblotmonsters / eiwitten van belang. Western blot is een methode die wordt gebruikt om het specifieke eiwit van belang uit een monster van weefsel of cel te detecteren. Deze methode scheidt de eiwitten eerst op grootte door middel van elektroforese. De eiwitten worden vervolgens elektroforetisch overgebracht naar een vaste ondersteuning (meestal een membraan) voordat het doeleiwit wordt gemarkeerd met behulp van een specifiek antilichaam. De antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende tags of fluorofoor-geconjugeerde antilichamen die worden gedetecteerd met behulp van colorimetrische, chemiluminescentie of fluorescentiemethoden. Hierdoor kan een specifiek doeleiwit worden gedetecteerd uit een mengsel van eiwitten. Deze techniek is gebruikt om fosfospecifieke plaatsen van KCC2 2,8 te karakteriseren en is gebruikt om remmers van KCC2 te identificeren die KCC2 Thr906/Thr1007 fosforyleringantagoniseren 15. HEK293-lijnen zijn in gebruik geweest voor verschillende experimenten vanwege hun voordeel in moleculaire biologie-experimenten. Ze zijn snel te reproduceren, gemakkelijk te onderhouden en zeer efficiënt voor transfectie en eiwitproductie22. Sommige meningen zijn echter van mening dat het misschien niet de meest geschikte kandidaat is voor het uitvoeren van neurobiologische experimenten omdat het geen cel is die afkomstig is uit de hersenen, en daarom kan de fysiologische specificiteit ervan twijfelachtig zijn in neurowetenschappelijk onderzoek. Eerdere werken hebben echter aangetoond dat vergelijkbare resultaten worden waargenomen bij de expressie van KCC2 in HEK293-cellen en werkelijke neuronale weefsels / cellen15,23. Vandaar dat de relevantie van HEK293 in neurowetenschappelijk onderzoek niet zonder meer kan worden weggegooid.
In studies waarbij eiwitexpressie met behulp van western blotting-techniek wordt geanalyseerd, moet specifieke aandacht worden besteed aan de keuze van de lysisbuffersamenstelling, de aard (type en concentratie) van het te gebruiken detergens24 en de proteaseremmers. De samenstelling van de buffer moet worden geoptimaliseerd om aan het doeleiwit te voldoen om de oplos- en extractieprocessen te vergemakkelijken en om de eenvoudige detectie door western blot25 mogelijk te maken. Mild wasmiddel in lage concentratie is meestal vereist voor oplosbare eiwitten, terwijl membraaneiwitten mogelijk sterkere wasmiddelomstandigheden vereisen. Sterke detergentia kunnen echter interacties verstoren en complexen kunnen verloren gaan. Zowel soorten als concentraties van de detergentia kunnen de aard en activiteit van het eiwit beïnvloeden, daarom is het noodzakelijk om vast te houden aan een beperkt / getolereerd bereik van concentraties voor deze detergentia. De toevoeging van proteaseremmer zal voorkomen dat het doeleiwit wordt afgebroken door endogene eiwitten, en de optimale aanbevolen werktemperatuur is 4 ° C om de proteolytische snelheden effectief te verlagen. Soms, in een poging om hoogwaardige immunoblotsignalen te bereiken voor antilichamen die slechte immunoblotsignalen geven, wordt immunoprecipitatie (IP) uitgevoerd als een upstream-experiment voor western blotting. Deze techniek is voordelig omdat het de interactie tussen antigenen en hun respectieve antilichamen in hun oorspronkelijke conformatie voorafgaand aan hun daaruit voortvloeiende scheiding en kwantificeringvergemakkelijkt 26. Daarom kan IP de kwaliteit van de outputs van western blotting-procedures verbeteren. Voorafgaand aan de toepassing van de IP-techniek is het belangrijk om de aanwezigheid en efficiëntie van expressie van de co-immunoprecipitated partnereiwitten in het lysaat te beoordelen door het hele cellysaat of inputfracties door western blotting te analyseren. Bovendien is voorkennis van het molecuulgewicht van het te onderzoeken eiwit noodzakelijk voordat het gewenste percentage geloplossingen voor SDS-PAGE-elektroforese wordt bereid, aangezien de grootte van het eiwit het zeefeffect van de gelmatrix beïnvloedt.
Hoewel de detectie van eiwit-geconjugeerde antilichamen door deze techniek zeer instrumenteel is, omdat het helpt om het begrip van samenwerkingsactiviteiten op de fosfo-locaties van KCC2 te verbeteren, wat informatie kan verschaffen over de cotransporterfosforylering en de integriteit van de signaalroute die de cotransporters kan reguleren, voor een betrouwbare voorspelling van cotransporteractiviteit. Het is echter belangrijk op te merken dat de western blot-techniek alleen in staat is om semi-kwantitatieve gegevens te produceren, wat betekent dat de techniek alleen de relatieve beoordeling van eiwitexpressies benadrukt, maar geen absolute kwantificering. Dit wordt toegeschreven aan discrepanties in de snelheid van het laden en overbrengen van monsters in afzonderlijke rijstroken, die verschillen op individuele vlekken. Het gegenereerde gedetecteerde signaal is ook niet lineair en weerspiegelt niet het concentratiebereik van monsters27. Bovendien is fosforyleringsstatus mogelijk geen betrouwbare factor voor het rapporteren van eiwitactiviteit, omdat interventies zoals remmers, mutaties en eiwitinteracties met de omgeving de eiwitactiviteit direct kunnen beïnvloeden zonder het fosforyleringsniveau 28,29,30 te veranderen. Het kan dus gunstiger zijn om fosfo-specifieke antilichamen te gebruiken als aanvulling op andere biochemische methoden.
Zoals eerder vermeld, zijn er andere klassieke methoden die worden gebruikt om KCC2-activiteit direct te meten. De beoordeling van KCC2 door het meten van radioactieve 86Rb+ flux door het membraan van homogene celpreparaten is een populaire benadering. Deze methode gebruikt actieve radio-isotopen als tracers door ze door ionische kanalen te laten lopen. Kortom, de cellen van belang worden geïncubeerd in kationvrije oplossingen om endogene KCC2 te remmen, gevolgd door incubatie met specifieke remmers zoals ouabaine, en vervolgens met opnamemedium dat de remmer en 86Rb + bevat. Vloeibare scintillatietellers worden gebruikt om activiteiten te meten/traceren die het gevolg zijn van cellyse. Deze methode is echter robuust, zeer gevoelig en selectief en is minder gevoelig voor verstoringen. De toepassingen ervan strekken zich echter niet uit tot weefsels met meerdere celtypen zoals hersenen of neuronculturen. Bovendien beperkt deze techniek veranderingen in de resolutie van de ionenconcentratie op subcellulair niveau. Bovendien zijn er veiligheidsproblemen met betrekking tot de potentiële toxiciteit en het gezondheidsrisico van het werken met radio-isotopen met een korte halfwaardetijd (18,65 dagen) die worden gekenmerkt door een hoge energie-emissie (max. 1,77 MeV; max 1,08 MeV)31. Dit zou massaal kunnen wijzen op een ongeschiktheid voor neuronale celstudies waarbij meestal een groot aantal cellen nodig is. Deze kwesties leiden tot de ontwikkeling van de niet-radioactieve 85Rb+ effluxtest van Terstappen 1999, als alternatief voor de radioactieve 86Rb+ voor de bepaling van ionenfluxen. De niet-radioactieve benadering heeft de radioactieve 86Rb+ -testen voor de analyse van K+ en niet-selectieve kationkanalen in de farmaceutische industrie sterk verbannen31. Niet-radioactieve 85Rb+ effluxtest omvat twee belangrijke processen, de eerste is celkweek en manipulatie en de tweede is de bepaling van het tracer rubidium door atomaire absorptiespectroscopie (AAS). Deze methode is echter gemakkelijk te gebruiken, het vereist een aantal testvalidatie-experimenten en lijdt aan een slechte temporele resolutie32. Niettemin is de niet-radioactieve 85Rb+ effluxtest geleidelijk een betrouwbare techniek gebleken voor de beoordeling van KCC's en NKCC's33.
De thallium (TI+) fluxtest gebruikt TI+ als surrogaation voor K+ vanwege de hoge bindingsaffiniteit met de K+ site op KCC2 en NKCC2. TI+ instroom in cellen kan worden gedetecteerd met behulp van een thalliumgevoelige fluorescerende kleurstof zoals benzothiazol coumarine en fluozine-2. Eenmaal getransporteerd door het kanaal, kan TI + associëren met de BTC / fluozin-2 kleurstof die een fluorescerende verandering veroorzaakt die kan worden gedetecteerd door fluorometrische beeldplaatlezer31. TI + indicatorkleurstoffen komen cellen binnen als acetoxymethylesters die vervolgens worden gesplitst door cytoplasmatische esterasen om de actieve fluorogene vormen vrij te geven. Om de KCC's te activeren, worden de cellen gestimuleerd met een mengsel van K+ en Tl+ in de aan- of afwezigheid van teststoffen (bijv. KCC2-remmers). Thallium komt binnen en bindt zich aan de fluorescentiekleurstof. De toename van het fluorescerende signaal is evenredig met de instroom van Tl+ in de cel, specifiek via de cotransporter, en vertegenwoordigt daarom een functionele meting van de cotransporteractiviteit. Deze methode is ook goed toegepast bij het meten van KCC2- en NKCC2-activiteit in verschillende soorten celculturen, bijvoorbeeld studies over HEK293-cellijn die stabiel menselijke KCC234 tot expressie brengt. Aan een demerit-einde is er een verscheidenheid aan potentiële off-target pathways-lijnen die de TI + -instroom kunnen verstoren, bijvoorbeeld Na + / K + ATPase in HEK293-cellen kan een hogere vals-positieve of vals-negatieve hit rate35 veroorzaken. Bovendien blijft, net als bij andere fluxtests, de implementatie van een dergelijke benadering in neuronale cellen beperkt vanwege de slechte overleving van neuronale cellen na meerdere wasstappen. De neuronale expressie van meerdere K+ kanalen en transporter kan ook de nauwkeurige beoordeling van KCC2 specifieke K+ fluxen belemmeren. Deze techniek biedt beperkingen voor de studie van kanalen in een klein neuronaal compartiment zoals dendrieten en dendritische stekels, en de axonen die te wijten zijn aan een gebrek aan ruimtelijke resolutie in combinatie met een lage temporele resolutie.
Verdere technieken zoals patch-clamp-elektrofysiologie worden gebruikt om GABA-activiteit te meten; dus indirect reflecterend op geactiveerd en/of geïnactiveerd KCC2 zoals gebaseerd op de beoordeling van intracellulaire chloride-ionhomeostase. Over het algemeen zijn elektrofysiologische metingen van de SLC12-functie gebaseerd op het principe dat de GABAA-receptoren (GABAAR) doorlaatbaar zijn tot chloride36. KCC2 is de sleutel in de modulatie van GABAerge remming. Met name de [Cl-]i extrusieactiviteit van KCC2 ligt ten grondslag aan de hyperpolarisatie van GABAAR6. Intracellulaire opnames bieden cruciale inzichten door de extrapolatie van chloride-extrudeercapaciteit van KCC2 uit de omkering in het potentieel van GABAAR-gemedieerde stromen (EGABA). Een hyperpolariseerde EGABA duidt op een lagere [Cl-]i en dus een toename van de activiteit van KCC2. Gramicidin patch-clamp techniek in de elektrofysiologie is een gouden standaard benadering voor het meten van GABA activiteit. Sommige eerder gepubliceerde studies hebben gramicidin patch-clamp-opname gebruikt om de functies en activiteiten van KCC2 te onderzoeken om [Cl-] i homeostase te beoordelen / monitoren, zijn inderdaad succesvol gebleken 8,9,37,38,39,40 . Tijdens een gramicidin patch-clamp opname wordt een strakke afdichting op het cel/weefseloppervlak gecreëerd met behulp van een glaselektrode met een relatieve patch om de intracellulaire activiteit van ionkanalen te registreren ten opzichte van een andere elektrode in een bad rondom de cel/weefsel. Deze techniek kan worden uitgevoerd door de hoeveelheid stroom te meten die het membraan van een cel kruist bij een vaste spanning in de spanningsklemmodus of door de hoeveelheid spanning te registreren die over het membraan beweegt met een vaste stroom in de huidige klemmodus36. Er kunnen verschillende variaties van de basistechniek worden toegepast die grotendeels afhankelijk zijn van de onderzoeksvraag. De techniek creëert geen relatief grote porie-achtige hele-cel patchregistratie, maar het porievormende antibioticum (gramicidin) dat zich in de elektrode-oplossing bevindt, wordt gebruikt om kleine poriën in het membraan te vormen36. Met name de toevoeging van gramicidin creëert kationselectieve poriën in het membraan, die onbeduidende aniondoorlaatbaarheid vertonen. Spanningshellingprotocollen zijn een effectief en betrouwbaar alternatief voor het registreren van de stroom bij een constante spanning. De stroom/spanning relaties verkregen met spanning ramp protocollen lijken een betere registratie van GABAAR-gemedieerde membraanstromen te geven. In dit protocol wordt een constant veranderende maar bewaakte spanning (met een constante snelheid) toegepast en wordt de stroom constant gelijktijdiggemeten 36,41. Tijdens dit protocol wordt de toepassing van spanningspulsen (meestal in hyperpolariserende richting) gebruikt om de lekstroom te activeren als gevolg van ohmse reacties. Doorgaans worden de GABAAR-gemedieerde membraanstromen berekend op basis van de lekstroom (d.w.z. de omkeerpotentialen van de lek-afgetrokken agonistenstromen)36. De stroomspanningsassociaties verkregen uit dit protocol helpen om een beter begrip te krijgen van waar de veranderingen optreden in ionconcentraties tijdens een experimenteel scenario met GABA A-receptorkanalen. Yelhekar et al.41 gebruikten een computationeel model om aan te tonen dat conclusies over stabiele ionenconcentraties van de interpolatiemethode mogelijk niet te rechtvaardigen zijn omdat het geschatte omkeerpotentieel van de methode onjuist kan zijn.
De gemiddelde weerstand die voor de meeste opnames wordt gebruikt, is 5 MΩ. Pipetten met een lagere weerstand van 3-4 MΩ kunnen resulteren in een lagere serieweerstand, wat de voorkeur verdient voor spanningsklemopnamen. De punt van de pipet zal echter vergelijkbaar breder zijn voor pipetten met een hogere weerstand en vormt als gevolg daarvan een uitdaging in de vorm van moeite bij de vorming van afdichtingen en stabiliteit36,42. Daarom is het noodzakelijk om de GΩ-formatie te volgen om opnames te verkrijgen met een aanzienlijke vermindering van het niveau van gegenereerde luidruchtige gegevens. De robuustheid van deze techniek om de functie en activiteiten van KCC2 te bestuderen, zoals beoordeeld op basis van de geschiktheid en betrouwbaarheid ervan bij het meten van GABA-activiteit, is bevestigd door verschillende studies. Eerdere studies hebben aangetoond dat [Cl-]i stabiel blijven met behulp van deze techniek door de reacties van GABAARs (die in staat zijn om chloridegeleiding af te sluiten) te meten naar hun respectieve agonisten. Impliciet wordt continue elektrische toegang geleverd met weinig of geen wijziging van de intracellulaire chlorideconcentratie43,44. Bovendien vergemakkelijkt deze techniek het omzeilen van kunstmatige veranderingen in membraanpotentiaal en EGABA tijdens GABAAR-activering (die chloride- en bicarbonaatgeleiding opent)45. Het bovenstaande biedt deze techniek een voorsprong op andere soorten elektrofysiologische opnames. De beperkingen van deze techniek omvatten echter het volgende: (1) frequente opnameruis kan optreden als gevolg van de punt van de elektrode die een deel van het membraan inneemt, wat de huidige resolutie kan verminderen, en (2) perforatie van het membraan met gramicidin duurt meestal relatief langer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door The Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) en een Commonwealth Ph.D. Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
References
- de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
- Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
- Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
- Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
- Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
- Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
- Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
- Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
- Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
- Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
- Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
- AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
- Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
- Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
- Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
- Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
- Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
- Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
- Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
- Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
- Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
- Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
- Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
- Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
- Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
- Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
- Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
- Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
- Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
- Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
- Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
- Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
- Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
- Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
- Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
- Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
- Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
- Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
- Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).
