Summary
本プロトコルは、新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンの物理的特性、免疫応答、および インビボ 防御効果を調製および評価する。
Abstract
ナノエマルジョンアジュバントワクチンは、その小さな粒子サイズ、高い熱安定性、および有効な免疫応答を誘導する能力のために広く注目を集めている。しかし、新しいナノエマルジョンアジュバントワクチンの免疫応答を評価するための一連の包括的なプロトコルを確立することが不可欠です。したがって、この記事では、ワクチンの物理化学的特性(透過型電子顕微鏡[TEM]、原子間力顕微鏡[AFM]、および動的光散乱[DLS]による)、ワクチン抗原およびシステムの安定性(高速遠心分離試験、熱力学的安定性試験、SDS-PAGE、およびウェスタンブロットによる)、および特異的免疫応答(IgG1、 IgG2a、およびIgG2b)。このアプローチを使用して、研究者は、致死MRSA252マウスモデルにおける新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンの保護効果 を正確に評価することができる。これらのプロトコルにより、有効なアジュバントの可能性の観点から最も有望なナノエマルジョンワクチンアジュバントを同定することができる。さらに、この方法は、将来の開発のために新しいワクチンを最適化するのに役立ちます。
Introduction
メチシリン耐性 黄色ブドウ球菌 (MRSA)は、世界中の集中治療室(ICU)病棟1、心臓病科、および火傷科で最も高い感染率の1つである日和見病原体です。MRSAは感染率、死亡率が高く、薬剤耐性が広く、臨床治療において大きな困難を示しています2。2017年に世界保健機関(WHO)が発表した抗生物質耐性菌のグローバル優先リストでは、MRSAは最も重要なカテゴリー3にリストされました。したがって、MRSA感染に対するワクチンが緊急に必要とされています。
アルミニウムアジュバントは長い間使用されており、アジュバント補助メカニズムは比較的明確で、安全で、効果的で、忍容性が良好です4。アルミニウムアジュバントは、現在広く使用されているタイプのアジュバントである。一般に、アルミニウム塩粒子に吸着された抗原は、安定性を改善し、注射部位が抗原を取り込む能力を高め、良好な吸収と徐放を提供すると考えられています5。現在、アルミニウムアジュバントの主な欠点は、アジュバント効果を欠くか、またはいくつかのワクチン候補抗原に対して弱いアジュバント効果しか示さないことである6。さらに、アルミニウムアジュバントはIgEを介した過敏反応を誘導します5。したがって、より強力な免疫応答を刺激するための新規アジュバントを開発する必要があります。
ナノエマルジョンアジュバントは、油、水、界面活性剤、および共界面活性剤7で構成されるコロイド分散系である。さらに、アジュバントは熱力学的に安定で等方性であり、オートクレーブ処理または高速遠心分離による安定化が可能で、穏やかな調製条件下で自発的に形成することができます。いくつかのエマルジョンアジュバント(MF59、NB001-002シリーズ、AS01-04シリーズなど)が現在市場に出回っているか、臨床研究段階にありますが、それらの粒子サイズは160nmを超えています8。したがって、ナノスケール(1〜100 nm)の医薬品の利点(すなわち、大きな比表面積、小さな粒子サイズ、表面効果、高い表面エネルギー、小さなサイズの効果、およびマクロ量子トンネル効果)を十分に活用することはできません。本プロトコールでは、直径サイズ1〜100nmのナノエマルジョン技術に基づく新規アジュバントが良好なアジュバント活性を示すことが報告されている9。組換えサブユニットワクチン抗原タンパク質HI(α-ヘモリシン変異体[Hla]およびFeイオン表面決定因子B[IsdB]サブユニットN2活性断片融合タンパク質)をテストしました。物性や安定性の検討、筋肉内投与後の特異的抗体応答の評価、マウス全身感染モデルを用いたワクチンの防御効果の試験など、一連の手順を確立した。
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Protocol
動物実験は、実験動物の使用と管理に関するマニュアルに基づいて行われ、第三軍事医科大学の実験動物福祉倫理委員会によって承認されました。6〜8週齢の雌Balb / cマウスを本研究に使用しました。動物は商業的な情報源から入手した( 材料表を参照)。
1. MRSA HI抗原タンパク質の調製
- 市販のソースからIsdBおよびHlaクローンを取得し(材料表を参照)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を実行してIsdBおよびHla遺伝子を増幅し、それらの産物をPGEX-6P-2プラスミドにライゲーションします(市販、材料表を参照)。大腸菌10のベクターXL /青色株のスクリーン。
- 陽性クローンを 大腸菌 BL21コンピテントセル( 材料表参照)に形質転換し、サメ培養10で増幅します。
- 抗原を発現し、イソプロピル-β-D-1-メルカプトガラクトピラノシドおよびマルチモーダルクロマトグラフィー(MMC)単離キット11( 材料表を参照)による誘導後に単離する。
- 抗原タンパク質の特性評価を行い、全自動精製器で精製します11.
- 市販のアフィニティークロマトグラフィー樹脂を使用して、透明化ライセートからグタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグ付きタンパク質をアフィニティー精製します( 材料表を参照)。
- MMC11により組換えタンパク質を精製する。
- Triton X-114相分離法11によりエンドトキシンを除去した。簡単に説明すると、1% Triton X-114を組換えタンパク質溶出液と0°Cで5分間混合して均一な溶液を確保し、37°Cで5分間インキュベートして2相を形成します。
- Turtleキット(材料表を参照)で細菌性エンドトキシン試験方法11を使用して、エンドトキシン濃度を検出します。タンパク質抗原のエンドトキシンは0.06 EU/μgで、国際標準(1.5 EU/μg)よりも低くなっています10。
- 干渉試験を実施して、エンドトキシン検出11に対する試験生成物の影響の可能性を排除する。
注:中国薬局方2020の付録12によると、エンドトキシン含有量は5 EU /用量未満である必要があります。.リムルスライセート(λ0.25 EU / mL)の感度と33.3の最大有効希釈比は、MVD = cL / λに基づいて12 と計算されました(Lは試験品の細菌性エンドトキシンの限界値、cは試験品溶液の濃度、LをEU/mで表した場合、cは1.0 mg / mLに相当します。λは、ゲル法におけるカブトガニ試薬の標識感度(EU / mL)です。
- 干渉試験を実施して、エンドトキシン検出11に対する試験生成物の影響の可能性を排除する。
- 抗原 (48 kDa、12% ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 [SDS-PAGE]) をエンドトキシンまたはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含まない滅菌水中で 1.5 mg/mL で再結合します (二塩素酸ナトリウム法)11。
注:タンパク質ピーク時間は13.843分、純度は99.4%(高速液体クロマトグラフィー法)であり、タンパク質は-70°Cで保存されました10。 黄色ブドウ球菌 株MRSA252から抽出したゲノムDNA( 材料表参照)をPCRテンプレートとして用いた。 IsdB 遺伝子をフォワードプライマー59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAGCAAGCAGを用いて増幅した
C-39およびリバースプライマー59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATTTTTATTATTTC-39. Hla 遺伝子は、フォワードプライマーPHLAF(GCGGATCCGATTCTGATATTAAACC)およびリバースプライマーPHLAR(TAAGCGGCCGCTTATTAT)を用いて増幅した
CAATTTGTCATTTCTTC)。
2.ナノエマルジョンワクチンの調製
- 1:6:3(w/w)の質量比で、HI抗原タンパク質溶液(10mg/mL)に3種類の賦形剤(ミリスチン酸イソプロピル、ポリオキシエチレンヒマシ油、プロピレングリコール、 材料表参照)を順次添加し、よく攪拌します。その後、徐々に滅菌した純水を最終容量10mLになるまで加え、500rpm、25°Cで約20分間攪拌します。
注:このプロトコルで調製されたナノエマルジョンは10mLの容量を有し、3つの賦形剤の質量はそれぞれ0.34g、2g、および1gである。ここでのタンパク質溶液は作業溶液であり、最終溶液の濃度の10倍です。 - ナノエマルジョンアジュバントワクチン(1mg / mLタンパク質)を低エネルギー乳化法13 によって調製し、透明で透明な液体溶液を得る。
注:ブランクナノエマルジョン(BNE)は、水をHIに置き換えたことを除いて、同様の方法で調製した。通常の乳化法は、外相と内相を約80°Cに加熱して乳化した後、徐々に攪拌して冷却します。このプロセスでは、大量のエネルギーが消費され、最終的にエマルジョンが得られる。
3.ナノエマルジョンアジュバントワクチンの物理的特性と安定性
- 粒子サイズ、ゼータ電位、およびポリマー分散指数の特性評価(PDI)。
- 100μLのナノエマルジョンアジュバントワクチンを調製し、注射用水で50倍に希釈する。検出用に2 mLのサンプルを追加します。
- ナノゼータサイザー(ZS; 材料表参照)を使用して、25°Cでの粒子サイズ、ゼータ電位、およびPDIを観察します。
- 透過型電子顕微鏡(TEM)
- 10μLのナノエマルジョンワクチンを水で50倍に希釈し、カーボンコーティングされた100メッシュの銅グリッド上に置き、室温で5分間1%リンタングステン酸( 材料表を参照)で染色する。
- 余分なリンタングステン酸溶液をろ紙で取り除きます。
- 透過型電子顕微鏡で形態を観察します( 材料表参照)。完成品が電子顕微鏡の視野内でほぼ安定して円形であるかどうか、およびそれらが良好な分散を示すかどうかを調べます。
- 走査型電子顕微鏡(SEM)
- 10μLのナノエマルジョンアジュバントワクチンを水で50倍に希釈し、10μLの予備希釈サンプルをシリコンウェーハ上に滴下し、37°Cの恒温槽制御インキュベーターに24時間入れる。
- 準備したプラチナをシリコンに40秒間スプレーし、室温まで冷却します。
- 調製した試料の形態学的性質を高分解能走査型電子顕微鏡で観察します( 材料表参照)。サンプルがほぼ安定で球状で、電子顕微鏡下の視野内に十分に分散しているかどうかを判断します。
- 形態学的安定性
- 1mLのナノエマルジョンワクチンサンプルをマイクロ遠心チューブに入れ、室温(25°)で13,000 x g で30分間遠心分離することにより、新鮮なサンプルの安定性を評価します。
- これらの新鮮なサンプルの外観を観察してから、6つの温度サイクル(1サイクル:4°Cで48時間、25°Cで48時間、37°Cで48時間保存)の熱力学的安定性試験を実行します。
- 遠心分離後、サンプルを15分間放置して、ティンダル効果があるかどうか(サンプルが光の下で透明で透明であるかどうか)、および解乳化が発生したかどうか(解乳化後の明確な層別化によって示される)を判断します。
- SDSページおよびウェスタンブロット
- サンプルを振とうし、0.6 mLの無水エタノールと0.3 mLのワクチンの溶液を混合し、遠心分離機(13,000 x g、室温、25°Cで30分)します。
- 溶液の上清をきれいなチューブに移し、沈殿物を0.3 mLの水で溶解します。無水エタノールと蒸留水溶液で処理した後の上清と沈殿溶液(ブランクナノエマルジョンとワクチンの両方)を得て、同じ50倍希釈を行う。
- 2.5 mLの分離ゲルAと2.5 mLの分離ゲルB( 材料表を参照)を混合し、50 μLの10%過硫酸アンモニウムを加え、ピペットでガラス板にすばやく溶液を入れます。濃縮ゲルA1 mLと濃縮ゲルB1 mLを混合し、ガラス板に10%過硫酸アンモニウム20 μLを加え、適当な大きさのコームを挿入して固化を待ちます。
- ステップ3.5.2で得られた希釈サンプルに合計5 μLの5xタンパク質ローディングバッファー溶液を加え、サンプルを5分間煮沸します。
- 10 μLの加熱タンパク質を対応するウェルに加え、5 μLのタンパク質マーカーをマーカーウェルに加えます。
- 電極を接続し、電気泳動計( 材料表を参照)をオンにして、電圧を300 Vに調整します。 電気泳動がPAGEゴムの底から1cm離れたら電源を切ります。
- ゲルを取り除き、ddH2Oですすいで、クーマシーブライトブルーG-250染色溶液( 材料表を参照)を10分間加えます。染色液を注ぎ出し、ゲルをddH 2 Oで2回すすぎます。
- 市販の脱色液を加え、ゲルを電子レンジで1分間加熱します。ゲルを10分間振とうし、ゲルの背景が透明になるまで脱色溶液の交換を繰り返します。次に、ゲルイメージングを実行します( 材料表を参照)。
注:ウェスタンブロットは、ステップ3.5.1-3.5.6で説明されているように前処理されました。 - 3つのろ紙ブロックを電気泳動転写バッファーに浸します。ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンをメタノールに30秒間浸し、セミドライゲル転写装置(2層の濾紙、PVDF膜、電気泳動ゲル、および1層の濾紙)で転写します。23 Vの電圧を使用して、メンブレンを23分間転送します。
- PVDFメンブレンを取り外し、転写後にトリス緩衝生理食塩水-Tween 20(TBST)で1回洗浄します。
- PVDFメンブレンをシーリング溶液(5%脱脂粉乳溶液)に入れ、4°Cで一晩シールします。
- PVDFメンブレンを取り外し、TBSTで3回またはそれぞれ10分間洗浄します。
- 一次抗体(血清陽性で免疫したマウスから)でインキュベートします。試験する一次抗体11 ( 材料表参照)をTBSTで500倍(100倍)に希釈する。ブロックしたPVDFメンブレンを一次抗体に入れ、37°Cで1時間インキュベートします。
- PVDFメンブレンを取り外し、TBSTでそれぞれ10分間3回洗浄します。
- 二次抗体とインキュベートします( 材料表を参照)。アルカリホスファターゼ(AP)標識ヤギ抗マウス二次抗体をTBSTで5,000倍に希釈する。PVDFメンブレンを二次抗体に入れ、37°Cで40分間インキュベートします。
- PVDFメンブレンを取り外し、TBSTでそれぞれ10分間4回洗浄します。
- 染色のために、PVDFメンブレンをAP基質ニトロブルーテトラゾール(NBT)とBCIP(5-ブロモ-4-クロロ-3'-インドリホスフェートp-トルイジン塩)の混合物(メンブレンを浸すのにちょうど十分)に浸します( 材料の表を参照)。肯定的な結果は紫色です。
注:結果は明確な紫色のバンドでなければならず、サンプルストリップと抗原の分子量は同じ標識位置にある必要があります。
4.筋肉内投与後のこのワクチンに対する抗体免疫応答の評価
注:マウスは、公表された報告11に続いてナノエマルジョンワクチンの筋肉内注射によって免疫された。マウスには陰性対照としてPBSを投与した。3回の免疫が終了した1週間後に、マウス11から血清を採取した。IgGおよびIgG1、IgG2a、およびIgG2bのサブクラスの血清レベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって定量的に決定されました。
- 抗原コーティング:HIタンパク質抗原をコーティング溶液で10 μg/mLに希釈し、ELISAプレートに100 μL/ウェルで添加します。4°Cで一晩インキュベートします。
注:コーティング溶液は、1.6 gの無水炭酸ナトリウムと2.9 gの重炭酸ナトリウムを1 Lの脱イオン水に溶解することによって調製されます。 - シーリング:プレートを洗浄します(3サイクル、各サイクル300μL)。各ウェルに300 μLのシーリング溶液を加え、37°Cで2時間ウェルを密閉します。
注:シーリング溶液は、Tween-20とウシ血清アルブミン(BSA)をPBSに添加することによって調製されます。PBST溶液中のBSAの含有量は1%である。 - 血清希釈:マウスのサンプル血清をPBSTで100倍に希釈し(血清3μLを採取し、PBSTとボルテックス297μLに加える)、各血清サンプルに100μLを使用します。陽性血清と陰性対照血清をPBSTで100倍に希釈し、4 μLを396 μLのPBSTに加え、ボルテックスで混合します。
- ダブル比希釈:上記の希釈実験血清200 μLをコーティングされたELISAプレートの最初の列に加え、1列目と12列目 を除くすべてのウェルに100 μLのPBSTを追加します。最初の列から連続して1:2希釈を実行します:ピペットを100 μLに調整し、100 μLを最初の列から2列目に移し、ピペットで10回混合します。
- 血清を複数の比率で11列目に希釈し、100 μLの液体を廃棄します。
- 希釈した陰性および陽性の血清を、サンプルテンプレートに従って行12の対応するウェルに追加します( 表1を参照)-100 μL/ウェル。
- ELISAプレートをラップで密封し、37°Cで1時間インキュベートします。
- 二次抗体抗マウスIgG-HRP( 材料表参照)をPBSTで1:10,000で希釈します。
- プレートを洗浄します(3サイクル、各サイクル300μL)。次に、希釈した二次抗体100 μLを各ウェルに加え、プレートを37°Cで40分間インキュベートします。
- 染色および終了:プレートを洗浄する(5サイクル、各サイクル300μL)。3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン(TMB)染色液(100 μL、 材料表参照)を各ウェルに加えます。プレートを37°Cで光から10分間離して置き、50μLの2M H2SO4で反応を直ちに終了させます。
- 酵素マーカーで光学濃度(OD450)値を検出します(終了後15分以内にOD450値を読み取ります)。
5. 新規アジュバントワクチンの 生体内 効果の評価
注:このナノエマルジョンワクチンの保護効果は、商業的に得られた致死MRSA252マウスモデルで評価されました( 材料表を参照)。私たちの研究グループ14の以前の結果によると、1 x 108 コロニー形成単位(CFU)/マウスは、細菌感染の致死モデルの防御効果を評価するのに最適な用量MRSA252。
- 菌株回収:凍結MRSA252のチューブを入手し、「スリーライン法」によりミューラーヒントン(MH)(A)プレート( 材料表参照)に菌を接種し、37°Cで一晩培養した。 下記の「3行方式」の手順を実行します。
- 接種リングを右手に持ち、焼灼して冷却し、細菌液のリングを得る。
- 寒天プレートをアルコールランプの炎の前左領域の上に左手で(テーブルに蓋をしたまま)持ち、プレートが炎に面するようにして、細菌が空気に入るのを防ぎます。右手で、感染細菌の接種リングを寒天表面上で密に、しかし重ならないように前後に動かし、最初のゾーンであるプレート全体の約1/5〜1/6の領域をカバーします。
注意: 接種リングと寒天は、30°〜40°の角度で穏やかに接触している必要があります。寒天の損傷は、手首の力でスライドさせることで回避できます。 - 接種リング上の余分な細菌を焼灼する(各領域を焼灼するか滅菌するかは、検体中の細菌の量に依存する)。冷却後、最後に最後から2番目の行2〜3を繰り返し、2番目の領域(プレート領域の約1/4)を描画します。
- 2番目のゾーンが終了したら、リングを焼灼し、同じ方法で3番目のゾーンを描画してプレート全体を満たします。
- 線が引かれたら、プレートを皿の蓋の上に置き、プレートに印を付け、37°Cのインキュベーターで18〜24時間インキュベートして、寒天表面のコロニーの分布を観察します。単一のコロニーが分離されているかどうかに注意を向け、コロニーの特性(サイズ、形状、透明度、色素沈着など)を観察します。
- 細菌の活性化:翌日、2つの50 mL振とうフラスコを取り、それぞれに20 mLのMH(B)培地( 材料表を参照)を追加します。10 μLのピペットチップで2つの単一コロニーを選び、シェーカーに加えます。コロニーを37°Cで220rpmで一晩インキュベートします。
- 二次活性化:翌日、それぞれ20mLのMH(B)培地を含む2つの50mL振とうフラスコを取ります。最初の活性化細菌を含むシェーカーから200 μLの細菌溶液を取り出し、20 mLのMH(B)培地を含む2つの新しいフラスコに加え、37°Cおよび220 rpmで5時間インキュベートします。
- 2番目の活性化菌液を50 mLの遠沈管に集め、3,000 x g で20分間分離し、上清を廃棄します。
- 沈殿した細菌を40mLの生理食塩水に再懸濁します。.
- 菌液のOD600 値を測定し、生理食塩水で1に調整します。このとき、実験におけるMRSA252の菌量は2 x 109 CFU/mLであった。
- 細菌溶液をOD600 1で1 x 109 CFU / mLの濃度に希釈します。
- 48匹のBalb/cマウスを4つのグループにランダムに分けます(n = 12)。
注:グループI:PBSグループ。グループII:BNEコントロールグループ;グループIII:ナイーブ抗原[タンパク質]グループ;グループIV:ナノエマルジョンアジュバントワクチン群。 - 100 mg / kgの1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけます。.
- マウスに赤外線理学療法ランプ( 材料表を参照)を約1分間照射して、尾静脈の血管拡張を引き起こします。
- 希釈した細菌溶液(ステップ5.7)を尾静脈に1匹あたり100 μL注射してマウスに挑戦します。
- マウスが通常の活動に戻るまで、赤外線理学療法ランプの下に置きます。
- マウスの生存を12時間ごとに10日間観察および記録します。
- 攻撃を生き延びたマウスを100 mg / kgの1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により安楽死させます。.
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Representative Results
ナノエマルジョンアジュバントワクチンを調製するためのプロトコル、ならびにこのワクチンのインビトロおよびインビボ試験を評価した。TEM、AFM、およびDLSを使用して、このサンプルの表面のゼータ電位と粒子サイズの重要な特性を決定しました(図1)。SDS-PAGEとウェスタンブロッティングでは、遠心分離後、沈殿物と上清中の抗原量が有意に分解されず、ワクチンが構造的に無傷で特異的で免疫原性があることが示されました(図2)。ナノエマルジョンアジュバントワクチンは、総IgG、IgG1、およびIgG2a抗体価を有意に増加させた。ワクチンの免疫原性は有意に改善された(図3A-C)。抗原群の450 nmにおける血清IgG2b OD値が最も高かった(1:500 PBSで希釈)(図3D)。致死MRSA252マウスモデルは、ナノエマルジョンアジュバントワクチンが良好な防御効果を示し、MRSA252による細菌感染を効果的に阻害し、感染したマウスの生存率を改善したことを最も直接的に反映しています(図4)。
図1:新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンの物理的特性 。 (a)透過型電子顕微鏡写真。(B)原子間力顕微鏡顕微鏡写真。(C)サイズ、直径、および分布。(D)ゼータ電位と分布。この図は、Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicineから複製されています。10, 7275-7290 (2015)11.もともとDove Medical Press Ltd.によって発行され、許可を得て使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンの物理的安定性 。 (A)抗原タンパク質の構造的完全性。(B)抗原タンパク質の構造特異性。レーン3:ブランクナノエマルジョン処理上清;レーン4:ブランクナノエマルジョン処理沈殿物;レーン5:プレステインマーカー;レーン6:ワクチン上清;レーン7:ワクチン沈殿物;レーン8:ワクチン治療上清;レーン9:ワクチン処理沈殿物;レーン10:天然タンパク質剤;(A)と(B)の混合用語。明確に定義されたタンパク質チャネルは黒い四角でマークされています。黒い矢印は抗原性タンパク質を示す。この図は、Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicineから複製されています。10, 7275-7290 (2015)11.元々はDove Medical Press Ltd.Sunらの許可を得て発行し、この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ナノエマルジョンアジュバントワクチンによる筋肉内注射後のIgGおよびそのサブグループ抗体レベル 。 (A)IgG力価の値をLog2 とする。(B)血清IgG1の450nm光学濃度。(c)血清IgG2aの450 nm光学濃度。(D)血清IgG2bの450 nm光学濃度。この図は、Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicineから複製されています。10, 7275-7290 (2015)11.もともとDove Medical Press Ltd.によって発行され、許可を得て使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MRSA252細菌感染の致死モデルにおける保護効果。 全身性MRSA感染に応答したマウスの生存率。この図は、Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicineから複製されています。10, 7275-7290 (2015)11.もともとDove Medical Press Ltd.によって発行され、許可を得て使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:ELISAスパイク配列および希釈テンプレート。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
細菌の細胞壁に固定され、鉄で調節された表面タンパク質であるIsdBは、ヘム鉄15を得るプロセスにおいて重要な役割を果たします。アルファ毒素であるHlaは、MRSAで知られている最も効果的な細菌毒素の1つであり、真核細胞に細孔を形成し、接着および上皮細胞を妨害する可能性があります16。本研究では、IsdBとHlaの抗原遺伝子をベースに、遺伝子工学技術を用いて新規組換えMRSA抗原タンパク質(HI)を構築し、発現させました。次に、低エネルギー乳化法によるナノエマルジョンワクチンを開発し、このワクチンの安定性と有効性を評価しました。例えば、生体内での長期安定性、構造、形状、吸収、効果などのいくつかの特性は、エマルション液滴7の大きさに大きく影響される。結果は、粒子サイズが、インビボでのナノエマルジョンの輸送および抗原提示細胞によるそれらの食作用に影響を及ぼす重要な因子であることを示した17。細胞貪食に関しては、1μm未満のナノ粒子は樹状細胞(DC)およびマクロファージによってより容易に貪食され、全身免疫を刺激する可能性が最も高い18。
粒子輸送に関しては、100nm未満のナノ粒子は、免疫効果を高めるためにリンパ管を介して伝達される可能性が高くなります。しかし、小さなナノ粒子は血管に浸潤するが、大きなナノ粒子はリンパ管内の輸送速度を遅くする19。したがって、最適な粒径は20〜50nmの範囲である。したがって、形状、サイズ、ゼータ電位など、ナノ粒子の物理的特性を研究することが重要です。TEMは、その高精度により、ナノエマルジョンアジュバントワクチンの特性を理解するための重要かつ基本的なツールとなっています。さらに、この技術は数年前から多くの分野で広く適用されています。3Dおよびナノスケールの高解像度情報を備えた別のナノメカニカル特性評価ツールであるAFMも、ナノエマルジョンワクチンの評価に使用されました13。重要なことに、サイズと電荷20の両方を同時に明らかにするDLSは、溶液中のナノエマルジョンワクチン粒子の凝集状態などの重要な情報を提供できます。文献によれば、大きな反発力が隣接するナノ粒子との時折の衝突によって引き起こされる凝集を防ぐことが多いため、コロイド懸濁液の物理的および化学的安定性には高いゼータ電位値が不可欠です。そこで、本研究では、これらのスキームを設定し、TEM、AFM、DLSを用いてその物理的・化学的特性を評価しました。
タンパク質ワクチンは、主要な感染症の予防と治療に重要な役割を果たします21。近年、タンパク質ワクチンは急速に発展していますが、免疫の有効性と持続性には深刻な課題が残っています。この基本的な理由は、タンパク質の安定性が低く、分布係数が小さく、抗原の生物学的半減期が短く、in vivoでクリアランス率が高いことです22。このプロトコルでは、新規ナノエマルジョンワクチンの安定性が評価され、SDS-PAGEまたはウェスタンブロットによって抗原分解は観察されませんでした。
安全で効果的で市場性のあるタンパク質ワクチンは、最適なワクチン免疫防御を得るために、タンパク質抗原の免疫原性および防御免疫応答のタイプ20 を有意に増強するために、適切な免疫アジュバントで補充されなければならない。タンパク質ワクチンによって刺激される抗体レベルは、感染の効果的な予防と治療のための重要な指標の一つであり、抗体価は、新規ナノエマルジョンアジュバントが裸の抗原の免疫原性を改善できるかどうかを評価するための重要な指標です。新規免疫アジュバントは、体液を著しく刺激して体液性および細胞性免疫応答レベルを高めることができ、ワクチンの免疫応答の種類と免疫防御効果を強化することは、重要な開発方向であり、将来の研究と新規ワクチンの開発の構成要素です23。したがって、このプロトコルでは、新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンによるマウス血清特異的IgG、IgG1、IgG2a、およびIgG2bの抗体価が検出されました。致死マウスモデル24 はワクチンを評価するためのゴールドスタンダードであり、私たちのプロトコルでは、致死MRSA252マウスモデルを使用して防御効果を評価しました。結果は、新規ナノエマルジョンアジュバントワクチンがMRSAに感染したBalb / cマウスの生存率を効果的に改善することを示しました。
このプロトコルは、ナノエマルジョンワクチンの安定性評価には十分ではない。円二色性は、ワクチンタンパク質の空間構造を簡便かつ迅速な方法で検出するために適用できる場合に適した方法です。攻撃によってテストされたマウスの生存率は、 in vivo テストとワクチンの有効性を評価するためのゴールドスタンダードですが、攻撃後のマウスの臓器への細菌コロニー形成の量を測定できれば、より説得力があります。したがって、ナノエマルジョンアジュバントワクチンの免疫応答を評価するための本プロトコルには依然としていくつかの欠点があり、上記の実験は、評価のためのその後の関連実験において補足される必要がある。
結論として、物理的特性、安定性、特異的免疫応答、およびチャレンジ防御の一連の評価を確立する必要があります。これらのスキームを完了すると、新しいナノエマルジョンアジュバントワクチンの適用と開発のための重要な実験の基礎が提供されます。
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Disclosures
著者は、この作業に利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、中国の国家重点研究開発プログラムのNo.2021YFC2302603、NSFCの第32070924および32000651、および重慶の自然科学財団プロジェクトプログラムのNo.2019jcyjA-msxmx0159によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
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