Summary
הפרוטוקול הנוכחי מכין ומעריך את התכונות הפיזיקליות, התגובה החיסונית וההשפעה המגנה in vivo של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב חדשני.
Abstract
חיסונים אדג'ובנטיים של ננו-תחליב משכו תשומת לב נרחבת בגלל גודל החלקיקים הקטן שלהם, יציבות תרמית גבוהה ויכולתם לגרום לתגובות חיסוניות תקפות. עם זאת, קביעת סדרה של פרוטוקולים מקיפים להערכת התגובה החיסונית של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב חדשני היא חיונית. לכן, מאמר זה כולל הליך קפדני לקביעת המאפיינים הפיזיקוכימיים של חיסון (על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור [TEM], מיקרוסקופ כוח אטומי [AFM], ופיזור אור דינמי [DLS]), יציבות האנטיגן והמערכת של החיסון (על ידי בדיקת צנטריפוגה במהירות גבוהה, בדיקת יציבות תרמודינמית, SDS-PAGE וכתם מערבי), והתגובה החיסונית הספציפית (IgG1, IgG2a, ו- IgG2b). באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים להעריך במדויק את ההשפעה המגנה של חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב חדשני במודל קטלני של עכבר MRSA252. בעזרת פרוטוקולים אלה, ניתן לזהות את האדג'ובנט המבטיח ביותר של חיסון ננו-תחליב במונחים של פוטנציאל אדג'ובנטי יעיל. בנוסף, השיטות יכולות לסייע באופטימיזציה של חיסונים חדשים לפיתוח עתידי.
Introduction
סטפילוקוקוס זהוב עמיד למתיצילין (MRSA) הוא פתוגן אופורטוניסטי עם אחד משיעורי הזיהום הגבוהים ביותר ביחידה לטיפול נמרץ (ICU) מחלקות1, מחלקות קרדיולוגיה ומחלקות כוויות ברחבי העולם. MRSA מציג שיעורים גבוהים של זיהום, תמותה ועמידות רחבה לתרופות, מה שמציג קשיים גדולים בטיפול קליני2. ברשימת העדיפות העולמית של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה שפורסמה על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) בשנת 2017, MRSA היה רשום בקטגוריה3 הקריטית ביותר. לכן יש צורך דחוף בחיסון נגד זיהום MRSA.
אדג'ובנט אלומיניום נמצא בשימוש מזה זמן רב, ומנגנון העזר האדג'ובנטי ברור יחסית, בטוח, יעיל ונסבל היטב4. אדג'ובנטים מאלומיניום הם כיום סוג נפוץ של אדג'ובנט. מקובל לחשוב כי אנטיגנים הנספחים על חלקיקי מלח אלומיניום יכולים לשפר את היציבות ולשפר את היכולת של אתר ההזרקה לספוג אנטיגנים, לספק ספיגה טובה ושחרור איטי5. נכון לעכשיו, החיסרון העיקרי של אדג'ובנטים מאלומיניום הוא שהם חסרים אפקט אדג'ובנטי או מציגים רק השפעה אדג'ובנטית חלשה על חלק מהאנטיגנים המועמדים לחיסון6. בנוסף, אדג'ובנטים מאלומיניום גורמים לתגובות רגישות יתר בתיווך IgE5. לכן, יש צורך לפתח אדג'ובנטים חדשים כדי לעורר תגובה חיסונית חזקה יותר.
אדג'ובנטים של ננו-תחליב הם מערכות פיזור קולואידיות המורכבות מנפט, מים, חומרים פעילי שטח וקוסורפקטנטים7. בנוסף, האדג'ובנטים יציבים מבחינה תרמודינמית ואיזוטרופיים, ניתנים לאוטוקלאבינג או לייצוב על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה, ויכולים להיווצר באופן ספונטני בתנאי הכנה מתונים. מספר אדג'ובנטים של תחליב (כגון MF59, סדרת NB001-002, סדרת AS01-04 וכו ') נמצאים כיום בשוק או בשלב המחקר הקליני, אך גודל החלקיקים שלהם גדול מ -160 ננומטר8. לכן, היתרונות של תכשירים רפואיים ננומטריים (1-100 ננומטר) (כלומר, שטח פנים ספציפי גדול, גודל חלקיקים קטנים, אפקט פני שטח, אנרגיית שטח גבוהה, אפקט גודל קטן ואפקט מנהור קוונטי מאקרו) אינם ניתנים לניצול מלא. בפרוטוקול הנוכחי, אדג'ובנט חדשני המבוסס על טכנולוגיית ננו-תחליב בקוטר של 1-100 ננומטר דווח כבעל פעילות אדג'ובנטית טובה9. בדקנו את חלבון האנטיגן של החיסון מסוג רקומבינציה HI (מוטנט α-המוליזין [Hla] ומשטח יון Fe הקובע גורם B [IsdB] תת-יחידה N2 חלבון היתוך מקטע פעיל); סדרה של נהלים נקבעו כדי לבחון את התכונות הפיזיות והיציבות, להעריך את תגובת הנוגדנים הספציפית שלו לאחר מתן תוך שרירי, ולבחון את ההשפעה המגנה של החיסון באמצעות מודל זיהום מערכתי בעכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים בבעלי חיים נערכו על בסיס המדריך לשימוש וטיפול בחיות ניסוי ואושרו על ידי הוועדה לרווחת חיות מעבדה ואתיקה של האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית. נקבות עכברי Balb/c, בנות 6-8 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת חלבון האנטיגן MRSA HI
- להשיג שיבוטים של IsdB ו-Hla ממקורות מסחריים (ראה טבלת חומרים), לבצע הגברה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את הגנים IsdB ו-Hla, ולשייך את מוצריהם לפלסמיד PGEX-6P-2 (המתקבל באופן מסחרי; ראה טבלת חומרים). מסך עם זן Xl/כחול וקטורי של Escherichia coli10.
- הפוך את השיבוט החיובי לתאים מוכשרים של E. coli BL21 (ראה טבלת חומרים) והגבר עם תרבית כרישים10.
- לבטא את האנטיגן ולבודד לאחר אינדוקציה עם isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside וכרומטוגרפיה multimodal (MMC) לבודד ערכות11 (ראה טבלה של חומרים).
- לאפיין את חלבון האנטיגן ולטהר אותו עם מטהר אוטומציה מלאה11.
- חלבונים מתויגים ב-Affinity-purify gutathione S-transferase (GST) מליזטים מנוקים באמצעות שרף כרומטוגרפיית זיקה זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- לטהר את החלבונים הרקומביננטיים על ידי MMC11.
- הסר את האנדוטוקסין בשיטת הפרדת הפאזה Triton X-11411. בקצרה, יש לערבב 1% Triton X-114 עם חלבון רקומביננטי בטמפרטורה של 0°C למשך 5 דקות כדי להבטיח תמיסה הומוגנית, ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות כדי לאפשר היווצרות של שני שלבים.
- השתמש בשיטת בדיקת אנדוטוקסיןחיידקי 11 עם ערכות צבים (ראה טבלת חומרים) כדי לזהות את ריכוז האנדוטוקסין. האנדוטוקסין לאנטיגן חלבוני הוא 0.06 EU/μg, נמוך מהתקן הבינלאומי (1.5 EU/μg)10.
- בצע בדיקת הפרעה כדי למנוע את ההשפעה האפשרית של מוצר הבדיקה על זיהוי אנדוטוקסין11.
הערה: על פי נספח 2020 של הפרמקופיאההסינית 12, תכולת האנדוטוקסין צריכה להיות פחות מ- 5 האיחוד האירופי למנה. הרגישות של לימולוס ליזט (λ0.25 EU/mL) ויחס הדילול האפקטיבי המרבי של 33.3 חושבו12 בהתבסס על MVD = cL/λ, כאשר L הוא ערך הגבול של אנדוטוקסין חיידקי עבור מאמר הבדיקה, c הוא הריכוז של תמיסת מאמר הבדיקה, וכאשר L מבוטא ב- EU/m, c שווה ל- 1.0 mg/mL. λ היא הרגישות המסומנת (EU/mL) של מגיב סרטן הפרסה בשיטת הג'ל.
- בצע בדיקת הפרעה כדי למנוע את ההשפעה האפשרית של מוצר הבדיקה על זיהוי אנדוטוקסין11.
- שלב מחדש את האנטיגן (48 kDa, נקבע על ידי 12% אלקטרופורזה ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד [SDS-PAGE]) ב 1.5 מ"ג / מ"ל במים סטריליים ללא אנדוטוקסין או מלח חוצץ פוספט (PBS) (שיטת נתרן dichlorate)11.
הערה: זמן שיא החלבון היה 13.843 דקות, הטוהר היה 99.4% (שיטת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים), והחלבון אוחסן ב -70 ° C10. DNA גנומי שהופק מזן S. aureus MRSA252 (ראה טבלת חומרים) שימש כתבנית PCR. הגן IsdB הוגבר באמצעות פריימר קדמי 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 והפריימר ההפוך 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTCT-39. הגן Hla הוגבר באמצעות פריימר קדמי PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) והפריימר ההפוך PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTCTTC).
2. הכנת חיסון ננו-תחליב
- לפי יחס המסה של 1:6:3 (w/w), הוסיפו שלושה סוגים של חומרים פעילים ברצף (איזופרופיל מיריסטט, שמן קיק פוליאוקסאתילן ופרופילן גליקול; ראו טבלת חומרים) לתמיסת חלבון האנטיגן HI (10 מ"ג/מ"ל) וערבבו היטב. לאחר מכן, הוסיפו מים טהורים מעוקרים בהדרגה כדי להגיע לנפח סופי של 10 מ"ל וערבבו במהירות 500 סל"ד ו-25 מעלות צלזיוס במשך כ-20 דקות.
הערה: הננו-תחליב שהוכן בפרוטוקול זה הוא בעל נפח של 10 מ"ל, והמסות של שלושת החומרים הפעילים הן 0.34 גרם, 2 גרם ו-1 גרם, בהתאמה. הפתרון החלבוני כאן הוא פתרון העבודה, פי 10 מהריכוז של התמיסה הסופית. - הכן את החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב (1 מ"ג/מ"ל חלבון) בשיטות תחליב באנרגיה נמוכה13 כדי לקבל תמיסה נוזלית ברורה ושקופה.
הערה: ננו-תחליב ריק (BNE) הוכן בשיטות דומות, אלא שמים הוחלפו ב-HI. שיטת התחליב הרגילה כוללת חימום הפאזה החיצונית והפנימית לכ-80 מעלות צלזיוס לצורך תחליב ולאחר מכן ערבוב וקירור הדרגתיים. בתהליך זה, כמות גדולה של אנרגיה נצרכת, ולבסוף, תחליב מתקבל.
3. אפיון פיזי ויציבות של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב
- גודל חלקיקים, פוטנציאל זטה ואפיון אינדקס פיזור פולימרים (PDI).
- הכינו 100 μL של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב ודללו פי 50 במים להזרקה. הוסף 2 מ"ל של דגימה לזיהוי.
- שימו לב לגודל החלקיקים, פוטנציאל הזטה וה-PDI ב-25°C באמצעות ננו זטסייזר (ZS; ראו טבלת חומרים).
- מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
- לדלל 10 μL של חיסון ננו-תחליב 50 פעמים עם מים, להניח על רשת נחושת מצופה פחמן 100-mesh, ולהכתים עם 1% חומצה phosphotungstic (ראה טבלה של חומרים) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר תמיסת חומצה פוספוטונגסטית עודפת עם נייר סינון.
- התבוננו במורפולוגיה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (ראו טבלת חומרים). בדקו האם המוצרים המוגמרים כמעט יציבים ומעגליים בתוך שדה הראייה של מיקרוסקופ האלקטרונים והאם הם מפגינים פיזור טוב.
- מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
- לדלל 10 μL של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב פי 50 עם מים, להטיל 10 μL של דגימות מדוללות מראש על פרוסת סיליקון, ומניחים באינקובטור מבוקר תרמוסטט 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- מרססים את הפלטינה המוכנה על הסיליקון למשך 40 שניות ומצננים לטמפרטורת החדר.
- התבונן בתכונות המורפולוגיות של הדגימות המוכנות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים). קבע אם הדגימות כמעט יציבות, כדוריות ומפוזרות היטב בתוך שדה הראייה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.
- יציבות מורפולוגית
- מניחים 1 מ"ל של דגימות חיסון ננו-תחליב בצינורות מיקרוצנטריפוגה, ומעריכים את יציבות הדגימות הטריות על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 13,000 x גרם בטמפרטורת החדר (25 °).
- שימו לב למראה של דגימות טריות אלה ולאחר מכן בצעו בדיקת יציבות תרמודינמית של שישה מחזורי טמפרטורה (מחזור אחד: אחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות, 25°C במשך 48 שעות ו-37°C במשך 48 שעות).
- לאחר הצנטריפוגה, יש לאפשר לדגימות לעמוד במשך 15 דקות כדי לקבוע אם קיים אפקט טינדל (האם הדגימה שקופה ושקופה תחת אור) ואם התרחשה דה-מולסיפיקציה (מוצג על ידי ריבוד ברור לאחר הדמולסיפיקציה).
- SDS-PAGE וכתם מערבי
- נערו את הדגימות, ערבבו תמיסה של 0.6 מ"ל אתנול מוחלט ו-0.3 מ"ל חיסון, וצנטריפוגה (13,000 x גרם, 30 דקות בטמפרטורת החדר, 25 מעלות צלזיוס).
- מעבירים את הסופרנאטנט של התמיסה לצינור נקי וממיסים את המשקע עם 0.3 מ"ל מים. להשיג את תמיסות הסופרנאטנט והזירוז (הן ננו-תחליב ריק והן חיסון) לאחר הטיפול באתנול מוחלט ותמיסת מים מזוקקים, ולבצע את אותו דילול פי 50.
- מערבבים 2.5 מ"ל של ג'ל הפרדה A ו-2.5 מ"ל של ג'ל הפרדה B (ראו טבלת חומרים), מוסיפים 50 מיקרוליטר של 10% אמוניום פרסולפט, ומניחים במהירות את התמיסה בצלחת הזכוכית עם פיפטה. מערבבים 1 מ"ל ג'ל מרוכז A ו-1 מ"ל ג'ל B מרוכז, מוסיפים 20 מיקרוליטר של 10% אמוניום פרסולפט לצלחת הזכוכית, מכניסים מסרק בגודל מתאים ומחכים להתמצקות.
- הוסף סך של 5 μL של תמיסת חיץ העמסת חלבון 5x לדגימה המדוללת שהתקבלה בשלב 3.5.2, והרתיח את הדגימה במשך 5 דקות.
- מוסיפים 10 μL חלבון מחומם לבאר המתאימה, ומוסיפים 5 μL של סמן חלבון לסמן היטב.
- חבר את האלקטרודה, הפעל את מד האלקטרופורזה (ראה טבלת חומרים) וכוונן את המתח ל- 300 V. כבה את החשמל כאשר האלקטרופורזה מגיעה למרחק של 1 ס"מ מתחתית גומי PAGE.
- הסר את הג'ל ושטוף עם ddH2O. הוסף תמיסת צביעה G-250 בצבע כחול בהיר של קומאסי (ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות. יוצקים את תמיסת הצביעה, ושוטפים את הג'ל פעמיים עם ddH2O.
- הוסיפו את תמיסת הסרת הצבע המסחרית וחממו את הג'ל במיקרוגל למשך דקה אחת. נערו את הג'ל במשך 10 דקות, ושנו שוב ושוב את תמיסת הסרת הצבע עד שרקע הג'ל ברור. לאחר מכן, בצע הדמיית ג'ל (ראה טבלת חומרים).
הערה: הכתם המערבי עובד מראש, כמתואר בשלבים 3.5.1-3.5.6. - השרו שלושה בלוקי נייר מסנן עם מאגר העברת אלקטרופורזה. משרים את קרום הפוליווינילידן פלואוריד (PVDF) במתנול למשך 30 שניות ומעבירים באמצעות מכשיר העברת ג'ל חצי יבש (שתי שכבות של נייר סינון, קרום PVDF, ג'ל אלקטרופורזה ושכבה אחת של נייר סינון). השתמש במתח של 23 V כדי להעביר את הממברנה למשך 23 דקות.
- יש להסיר את קרום ה-PVDF ולשטוף פעם אחת במי מלח-טווין 20 (TBST) לאחר ההעברה.
- יש להניח את קרום PVDF בתמיסת איטום (תמיסת אבקת חלב דל שומן 5%) ולאטום למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- הסירו את קרום ה-PVDF ושטפו שלוש פעמים עם TBST או 10 דקות כל אחת.
- לדגור עם הנוגדן הראשוני (מעכברים מחוסנים עם סרום חיובי). יש לדלל את הנוגדן הראשוני11 (ראו טבלת חומרים) כדי להיבדק פי 500 (פי 100) עם TBST. הניחו את קרום PVDF החסום בנוגדן הראשוני ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
- הסירו את קרום ה-PVDF ושטפו שלוש פעמים עם TBST במשך 10 דקות כל אחת.
- לדגור עם הנוגדן המשני (ראה טבלת חומרים). לדלל פוספטאז אלקליין (AP) - שכותרתו נוגדן משני עז נגד עכבר פי 5,000 עם TBST. מניחים את קרום ה-PVDF בנוגדן המשני ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 40 דקות.
- הסר את קרום PVDF ושטוף ארבע פעמים עם TBST במשך 10 דקות כל אחת.
- יש לטבול את קרומי PVDF בתערובת (בדיוק מספיק כדי לספוג את הממברנה) של מצע AP ניטרו כחול טטרזול (NBT) ו-BCIP (5-ברומו-4-כלורו-3'-אינדוליפפוספט p-toluidine salt) (ראו טבלת חומרים) לצורך צביעה. תוצאה חיובית היא סגולה.
הערה: התוצאות חייבות להיות פס סגול ברור, ורצועת הדגימה והמשקל המולקולרי של האנטיגן צריכים להיות באותו מיקום מסומן.
4. הערכת התגובה החיסונית של נוגדנים לחיסון זה לאחר מתן תוך שרירי
הערה: העכברים חוסנו על ידי הזרקה תוך שרירית של חיסון ננו-תחליב בעקבות דו"חשפורסם 11. העכברים קיבלו PBS כביקורת שלילית. שבוע לאחר השלמת שלושה חיסונים, נאסף הסרום מהעכברים11. רמות IgG בסרום ותת-הקבוצות של IgG1, IgG2a ו-IgG2b נקבעו כמותית על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA).
- ציפוי אנטיגן: לדלל אנטיגן חלבון HI ל 10 מיקרוגרם / מ"ל עם תמיסת ציפוי ולהוסיף לצלחת ELISA ב 100 μL / באר. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: תמיסת הציפוי מוכנה על ידי המסת 1.6 גרם של נתרן פחמתי נטול מים ו -2.9 גרם של סודיום ביקרבונט ב -1 ליטר של מים נטולי יונים. - איטום: שטפו את הצלחת (שלושה מחזורים, כל מחזור 300 מיקרוליטר). הוסף 300 μL של תמיסת האיטום לכל באר, ואטם את הבארות במשך 2 שעות ב 37 ° C.
הערה: פתרון האיטום מוכן על ידי הוספת Tween-20 ואלבומין בסרום בקר (BSA) ל- PBS. התוכן של BSA בפתרון PBST הוא 1%. - דילול בסרום: דללו את סרום הדגימה של עכברים 100 פעמים עם PBST (קחו 3 מיקרוליטר של סרום והוסיפו אותו ל-297 מיקרוליטר של PBST ומערבולת), והשתמשו ב-100 מיקרוליטר לכל דגימת סרום. לדלל את הסרום החיובי ואת סרום הבקרה השלילית 100 פעמים עם PBST על ידי הוספת 4 μL ל 396 μL של PBST, ולאחר מכן ערבוב על ידי מערבולת.
- דילול יחס כפול: הוסף 200 μL של הסרום הניסיוני המדולל לעיל לשורה הראשונה של צלחת ELISA המצופה והוסף 100 μL של PBST לכל הבארות למעט השורה הראשונה וה- 12. בצע דילול 1:2 ברציפות מהשורה הראשונה: כוונן את הפיפטה ל 100 μL, העבר 100 μL מהשורה הראשונה לשורה השנייה, וערבב עם פיפטה 10 פעמים.
- לדלל את הסרום לשורה 11 ביחסים מרובים ולהשליך 100 μL של נוזל.
- הוסף סרום שלילי וחיובי מדולל לבארות המתאימות בשורה 12 בהתאם לתבנית לדוגמה (ראה טבלה 1)-100 μL/well.
- אטמו את צלחות ELISA בניילון נצמד ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
- לדלל נוגדנים משניים נגד עכבר IgG-HRP (ראה טבלת חומרים) עם PBST בקנ"מ 1:10,000.
- לשטוף את הצלחת (שלושה מחזורים, כל מחזור 300 μL). לאחר מכן, להוסיף 100 μL של נוגדן משני מדולל לכל באר, לדגור את הצלחת ב 37 ° C במשך 40 דקות.
- צביעה וסיום: שטפו את הצלחת (חמישה מחזורים, כל מחזור 300 מיקרוליטר). הוסף תמיסת צביעה 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) (100 μL; ראה טבלת חומרים) לכל באר. הניחו את הלוחות בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות הרחק מהאור, ולאחר מכן סיימו את התגובה מיד עם 50 μL של 2 M H2SO4.
- זהה את ערך הצפיפות האופטית (OD 450) על-ידי סמן אנזים (קרא את הערך OD450 תוך 15 דקות לאחר הסיום).
5. הערכת ההשפעות in vivo של החיסונים האדג'ובנטיים החדשים
הערה: ההשפעה המגנה של חיסון ננו-תחליב זה הוערכה במודל עכבר MRSA252 קטלני שהושג מסחרית (ראה טבלת חומרים). על פי התוצאות הקודמות של קבוצת המחקר שלנו14, 1 x 108 יחידות יוצרות מושבה (CFU) / עכבר הוא המינון הטוב ביותר כדי להעריך את ההשפעה המגנה של המודל הקטלני של זיהום חיידקי MRSA252.
- התאוששות הזן: להשיג צינור של MRSA252 קפואים, לחסן את החיידקים על לוחות מולר הינטון (MH) (A) (ראה טבלת חומרים) על ידי "שיטת שלושת הקווים", ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס. בצע את השלבים של "שיטת שלוש שורות" כמפורט להלן:
- מחזיקים את טבעת החיסון ביד ימין, צורבים ומקררים אותה כדי לקבל טבעת של נוזל חיידקי.
- החזיקו את צלחת האגר ביד שמאל (תוך שמירה על המכסה על השולחן) מעל האזור השמאלי הקדמי של להבת מנורת האלכוהול כך שהצלחת פונה ללהבה ומונעת מהחיידקים להיכנס לאוויר. ביד ימין, הזיזו את טבעת החיסון של חיידקים נגועים קדימה ואחורה על משטח האגר בצורה צפופה אך לא חופפת, המכסה שטח של כ 1/5-1/6 מהצלחת כולה, שהוא האזור הראשון.
הערה: טבעת החיסון והאגר צריכים להיות במגע עדין בזווית של 30°-40°; ניתן למנוע פגיעה באגר על ידי החלקה בכוח שורש כף היד. - לצרוב את עודפי החיידקים על טבעת החיסון (האם לצרוב או לעקר כל אזור תלוי בכמות החיידקים בדגימה). לאחר הקירור, חוזרים על השורות הלפני אחרונה 2-3 בסוף ומציירים אזור שני (כרבע משטח הצלחת).
- לאחר סיום האזור השני, צרוב את הטבעת, וצייר את האזור השלישי באותו אופן כדי למלא את הצלחת כולה.
- לאחר שרטוט הקווים, מניחים את הצלחת על מכסה המנה, מסמנים את הצלחת ודגרים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות כדי לבחון את התפלגות המושבות על משטח האגר. מקדו את תשומת הלב בשאלה האם מושבה בודדת מבודדת, והתבוננו במאפייני המושבה (כגון גודל, צורה, שקיפות ופיגמנטציה).
- הפעלת חיידקים: למחרת, קח שתי צלוחיות שייקר של 50 מ"ל והוסף 20 מ"ל של MH (B) בינוני (ראה טבלת חומרים) לכל אחת. בחרו שתי מושבות בודדות עם קצה פיפטה של 10 μL והוסיפו אותן לשייקר. לדגור את המושבות לילה ב 220 סל"ד ב 37 °C (77 °F).
- הפעלה משנית: למחרת, קח שתי צלוחיות שייקר של 50 מ"ל, שכל אחת מהן מכילה 20 מ"ל של MH (B) בינוני. הסר 200 μL של תמיסה חיידקית מהשייקר המכיל את החיידקים הפעילים הראשונים, הוסף לשתי הצלוחיות החדשות המכילות 20 מ"ל של MH (B) בינוני, ודגר ב 37 ° C ו 220 סל"ד במשך 5 שעות.
- אספו את התמיסה החיידקית הפעילה השנייה בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, הפרידו בטמפרטורה של 3,000 x גרם למשך 20 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.
- להשעות את החיידקים המושקעים ב 40 מ"ל של מלוחים.
- מדוד את ערך OD600 של תמיסת החיידקים והתאם ל-1 עם מי מלח. באותו זמן, כמות החיידקים של MRSA252 בניסוי שלנו הייתה 2 x 109 CFU/mL.
- לדלל את הפתרון החיידקי עם OD600 של 1 לריכוז של 1 x 109 CFU/mL.
- חלקו באופן אקראי 48 עכברי Balb/c לארבע קבוצות (n=12).
הערה: קבוצה I: קבוצת PBS; קבוצה II: קבוצת ביקורת BNE; קבוצה III: קבוצת אנטיגן נאיבית; קבוצה IV: קבוצת חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב. - מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 100 מ"ג/ק"ג של 1% נתרן פנטוברביטל.
- הקרינו את העכברים עם מנורת פיזיותרפיה אינפרא אדומה (ראו טבלת חומרים) למשך כדקה אחת כדי לגרום להרחבת כלי הדם של וריד הזנב.
- אתגרו את העכברים עם הזרקת התמיסה החיידקית המדוללת (שלב 5.7) לווריד הזנב, 100 מיקרוליטר לעכבר.
- הניחו את העכברים מתחת למנורת הפיזיותרפיה האינפרא אדומה עד שיוכלו לחזור לפעילות רגילה.
- צפו ותיעדו את הישרדותם של עכברים כל 12 שעות במשך 10 ימים.
- להרדים את העכברים ששרדו את ההתקפה על ידי הזרקה intraperitoneal של 100 מ"ג / ק"ג של 1% pentobarbital נתרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נבדק הפרוטוקול להכנת החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב ובדיקות in vitro ו-in vivo של חיסון זה. TEM, AFM ו-DLS שימשו כדי לקבוע את המאפיינים החשובים של פוטנציאל הזטה וגודל החלקיקים על פני השטח של הדגימה הזו (איור 1). SDS-PAGE ו-Western Blotting הראו שכמות האנטיגן במשקע ובסופרנאטנט לא ירדה משמעותית לאחר הצנטריפוגה, מה שמצביע על כך שהחיסון היה שלם מבחינה מבנית, ספציפי ואימונוגני (איור 2). החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב הגדיל משמעותית את סך נוגדני IgG, IgG1 ו-IgG 2a. האימונוגניות של החיסון השתפרה משמעותית (איור 3A-C). ערכי IgG2b OD בסרום ב-450 ננומטר בקבוצת האנטיגן היו הגבוהים ביותר (מדולל ב-1:500 PBS) (איור 3D). מודל עכבר MRSA252 קטלני שיקף באופן הישיר ביותר שהחיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב הראה אפקט מגן טוב ועיכב ביעילות זיהום חיידקי עם MRSA252, מה ששיפר את שיעור ההישרדות של עכברים נגועים (איור 4).
איור 1: המאפיינים הפיזיים של החיסון האדג'ובנטי החדש נגד ננו-תחליב . (A) מיקרוגרף אלקטרונים תמסורת. (B) מיקרוגרף מיקרוסקופ כוח אטומי. (ג) גודל, קוטר והתפלגות. (ד) פוטנציאל Zeta והפצתו. האיור משוכפל מתוך Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. פורסם במקור על ידי Dove Medical Press Ltd. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: יציבות פיזית של החיסון האדג'ובנטי החדש נגד ננו-תחליב . (A) שלמות מבנית של החלבונים האנטיגניים. (B) ספציפיות מבנית של חלבון האנטיגן. נתיב 3: סופרנטנט ריק המטופל בננו-אמולסיה; נתיב 4: משקע טיפול ננו-תחליב ריק; נתיב 5: סמן מוכתם; נתיב 6: מפקח חיסונים; נתיב 7: זירוז חיסון; נתיב 8: סופרנטנט לטיפול בחיסונים; נתיב 9: זירוז הטיפול בחיסון; נתיב 10: סוכן חלבון טבעי; (א) ו-(ב) מונח מעורב. תעלות חלבון מוגדרות בבירור מסומנות בריבועים שחורים. חצים שחורים מצביעים על חלבונים אנטיגניים. האיור משוכפל מתוך Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. פורסם במקור על ידי Dove Medical Press Ltd.Sun et al. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: IgG ותת-הקבוצה שלו רמות נוגדנים לאחר הזרקה תוך-שרירית עם החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב. (A) רישום2 ערך של titers IgG. (B) צפיפות אופטית של 450 ננומטר של IgG1 בסרום. (C) צפיפות אופטית של 450 ננומטר של IgG2a בסרום. (D) צפיפות אופטית של 450 ננומטר של IgG2b בסרום. האיור משוכפל מתוך Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. פורסם במקור על ידי Dove Medical Press Ltd. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אפקט מגן במודל הקטלני של זיהום חיידקי MRSA252. יחס ההישרדות של עכברים בתגובה לזיהום MRSA מערכתי. האיור משוכפל מתוך Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. פורסם במקור על ידי Dove Medical Press Ltd. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: תבנית רצף קוצים ודילול של ELISA. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IsdB, חלבון פני השטח מעוגן דופן תא חיידקי ומווסת ברזל, ממלא תפקיד חשוב בתהליך קבלת ברזל הם15. HLA, רעלן אלפא, הוא בין הרעלנים החיידקיים היעילים ביותר הידועים ב- MRSA, והוא יכול ליצור נקבוביות בתאים איקריוטים ולהפריע להידבקות ולתאי אפיתל16. במחקר שלנו, חלבון אנטיגן MRSA חדשני (HI) נבנה ובא לידי ביטוי בטכנולוגיית הנדסה גנטית המבוססת על גני האנטיגן של IsdB ו - HLA. לאחר מכן, פותח חיסון ננו-תחליב בשיטת תחליב דל אנרגיה, והוערכו יציבותו ויעילותו. לדוגמה, מאפיינים מסוימים, כגון יציבות, מבנה, צורה, ספיגה והשפעה in vivo לטווח ארוך, מושפעים מאוד מגודל טיפת התחליב7. התוצאות הראו כי גודל החלקיקים היה גורם חשוב שהשפיע על הובלת ננו-תחליבים in vivo ופאגוציטוזה שלהם על ידי תאים מציגי אנטיגן17. לגבי ציטופהגוציטוזה, ננו-חלקיקים הקטנים ממיקרומטר 1 הם פגוציטוזים בקלות רבה יותר על ידי תאים דנדריטיים (DCs) ומקרופאגים, והם בעלי הסיכוי הגבוה ביותר לעורר חסינות מערכתית18.
לגבי הובלת חלקיקים, ננו-חלקיקים קטנים מ-100 ננומטר נוטים יותר להיות מועברים דרך כלי הלימפה כדי לשפר את ההשפעה החיסונית; עם זאת, ננו-חלקיקים קטנים חודרים לכלי הדם, בעוד שננו-חלקיקים גדולים מאטים את מהירות ההובלה שלהם בכלי הלימפה19. לפיכך, גודל החלקיקים האופטימלי הוא בטווח של 20-50 ננומטר. לכן, חיוני לחקור את המאפיינים הפיזיקליים של ננו-חלקיקים, כולל צורה, גודל ופוטנציאל זטה. TEM, בדיוק הגבוה שלו, הפך לכלי חשוב ובסיסי להבנת התכונות של חיסונים אדג'ובנטיים ננו-תחליב. בנוסף, הטכנולוגיה מיושמת באופן נרחב בתחומים רבים מזה מספר שנים. כלי אפיון ננומכני נוסף עם מידע תלת-ממדי וננומטרי ברזולוציה גבוהה, AFM, שימש גם הוא להערכת חיסון ננו-תחליב13. חשוב לציין, DLS, אשר חושף בו זמנית הן גודל והן מטען20, יכול לספק מידע מפתח, כגון מצב הצבירה של חלקיקי חיסון ננו-תחליב בתמיסה. על פי הספרות, ערך פוטנציאלי גבוה של זטה הוא הכרחי ליציבות הפיזיקלית והכימית של מתלים קולואידים, שכן כוח דחייה גדול מונע לעתים קרובות צבירה הנגרמת על ידי התנגשויות מזדמנות עם ננו-חלקיקים סמוכים. לכן, במחקר שלנו, הקמנו את התוכניות האלה והערכנו את התכונות הפיזיקליות והכימיות שלהן באמצעות TEM, AFM ו-DLS.
חיסונים חלבוניים ממלאים תפקיד חשוב במניעה וטיפול במחלות זיהומיות עיקריות21. חיסונים חלבוניים התפתחו במהירות בשנים האחרונות, אך נותרו אתגרים רציניים ביעילות החיסון ובהתמדה. הסיבות הבסיסיות לכך הן יציבות חלבון ירודה, מקדם הפצה קטן, זמן מחצית חיים ביולוגי קצר של אנטיגנים, ושיעורי פינוי גבוהים in vivo22. בפרוטוקול זה הוערכה יציבות החיסון הננו-תחליב החדש, ולא נצפתה התפרקות אנטיגן על ידי SDS-PAGE או כתם מערבי.
חיסון חלבוני בטוח, יעיל וסחיר חייב להיות בתוספת אדג'ובנט חיסוני מתאים כדי לשפר באופן משמעותי את האימונוגניות של אנטיגן החלבון ואת סוג התגובה החיסונית המגנה20 כדי להשיג את ההגנה החיסונית האופטימלית של החיסון. רמת הנוגדנים המגורה על ידי חיסון חלבון היא בין המדדים החשובים למניעה וטיפול יעילים בזיהום, וטיטר הנוגדנים הוא מדד חשוב כדי להעריך אם האדג'ובנט ננו-תחליב החדש יכול לשפר את האימונוגניות של האנטיגן העירום. אדג'ובנטים חיסוניים חדשים יכולים לעורר באופן משמעותי את הגוף כדי לשפר את רמות התגובה החיסונית ההומורלית והתאית, והעשרת סוגי התגובה החיסונית ויעילות ההגנה החיסונית של חיסונים היא כיוון פיתוח חשוב והמרכיב במחקר עתידי ופיתוח חיסונים חדשים23. לכן, בפרוטוקול זה, זוהו טיטרים נוגדנים של IgG ספציפי לסרום עכברים, IgG1, IgG2a ו- IgG2b עם החיסון האדג'ובנטי החדש ננו-תחליב. מודל העכבר הקטלני24 הוא תקן הזהב להערכת חיסונים, ובפרוטוקול שלנו נעשה שימוש במודל עכבר MRSA252 קטלני כדי להעריך את אפקט ההגנה. התוצאות הראו כי החיסון האדג'ובנטי החדש ננו-תחליב שיפר ביעילות את שיעור ההישרדות של עכברי Balb/c שנדבקו ב-MRSA.
פרוטוקול זה אינו מספיק בהערכת היציבות של חיסוני ננו-תחליב. דיכרואיזם מעגלי הוא שיטה מתאימה אם ניתן ליישם אותה כדי לזהות את המבנה המרחבי של חלבוני החיסון בשיטה פשוטה ומהירה. למרות ששיעור ההישרדות של עכברים שנבדקו על ידי ההתקפה הוא תקן הזהב להערכת בדיקת in vivo ויעילות החיסון, זה יהיה משכנע יותר אם ניתן יהיה למדוד את כמות התיישבות החיידקים של איברי עכברים לאחר ההתקפה. לכן, ישנם עדיין כמה חסרונות בפרוטוקול הנוכחי להערכת התגובה החיסונית של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב, ויש להשלים את הניסוי הנ"ל בניסויים הרלוונטיים הבאים להערכה.
לסיכום, יש צורך לקבוע סדרה של הערכות של תכונות פיזיות, יציבות, תגובה חיסונית ספציפית, ואתגר הגנה. השלמת תוכניות אלה תספק יסודות ניסיוניים חיוניים ליישום ופיתוח של חיסונים אדג'ובנטיים חדשניים של ננו-תחליב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים בעבודה זו.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מס '2021YFC2302603 של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין, מס '32070924 ו -32000651 של NSFC, ומס '2019jcyjA-msxmx0159 של תוכנית פרויקט הקרן למדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia. , China Medical Science and Technology Press. Beijing. 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D.
- Saeed, K., et al.
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J.
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
