Summary
Detta protokoll förbereder och utvärderar de fysikaliska egenskaperna, immunsvaret och in vivo-skyddande effekten av ett nytt nanoemulsionsadjuvansvaccin.
Abstract
Nanoemulsionsadjuvansvacciner har väckt stor uppmärksamhet på grund av deras lilla partikelstorlek, höga termiska stabilitet och förmåga att inducera giltiga immunsvar. Det är dock viktigt att upprätta en serie omfattande protokoll för att utvärdera immunsvaret hos ett nytt nanoemulsionsadjuvansvaccin. Därför innehåller denna artikel ett rigoröst förfarande för att bestämma de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos ett vaccin (genom transmissionselektronmikroskopi [TEM], atomkraftmikroskopi [AFM] och dynamisk ljusspridning [DLS]), stabiliteten hos vaccinantigenet och systemet (genom ett höghastighetscentrifugtest, ett termodynamiskt stabilitetstest, SDS-PAGE och western blot) och det specifika immunsvaret (IgG1, IgG2a och IgG2b). Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan forskare noggrant utvärdera den skyddande effekten av ett nytt nanoemulsionsadjuvansvaccin i en dödlig MRSA252 musmodell. Med dessa protokoll kan det mest lovande nanoemulsionsvaccinadjuvansen när det gäller effektiv adjuvanspotential identifieras. Dessutom kan metoderna hjälpa till att optimera nya vacciner för framtida utveckling.
Introduction
Meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) är en opportunistisk patogen med en av de högsta infektionshastigheterna på en intensivvårdsavdelning (ICU) avdelning1, kardiologiska avdelningar och brännavdelningar över hela världen. MRSA uppvisar höga infektionsnivåer, dödlighet och bred läkemedelsresistens, vilket medför stora svårigheter vid klinisk behandling2. I den globala prioriteringslistan över antibiotikaresistenta bakterier som släpptes av Världshälsoorganisationen (WHO) 2017 listades MRSA i den mest kritiska kategori3. Det finns därför ett akut behov av ett vaccin mot MRSA-infektion.
Aluminiumadjuvans har använts under lång tid, och adjuvanshjälpmekanismen är relativt tydlig, säker, effektiv och väl tolererad4. Aluminiumadjuvans är för närvarande en allmänt använd typ av adjuvans. Det anses allmänt att antigener adsorberade på aluminiumsaltpartiklar kan förbättra stabiliteten och förbättra injektionsställets förmåga att ta upp antigener, vilket ger god absorption och långsam frisättning5. För närvarande är den största nackdelen med aluminiumadjuvans att de saknar en adjuvanseffekt eller endast uppvisar en svag adjuvanseffekt på vissa vaccinkandidatantigener6. Dessutom inducerar aluminiumadjuvans IgE-medierade överkänslighetsreaktioner5. Därför är det nödvändigt att utveckla nya adjuvans för att stimulera ett starkare immunsvar.
Nanoemulsionsadjuvans är kolloidala dispersionssystem som består av olja, vatten, ytaktiva ämnen och kosurakter7. Dessutom är adjuvanserna termodynamiskt stabila och isotropa, kan autoklaveras eller stabiliseras genom höghastighetscentrifugering och kan bildas spontant under milda beredningsförhållanden. Flera emulsionsadjuvans (såsom MF59, NB001-002-serien, AS01-04-serien, etc.) finns för närvarande på marknaden eller i det kliniska forskningsstadiet, men deras partikelstorlekar är större än 160 nm8. Därför kan fördelarna med läkemedel i nanoskala (1-100 nm) (dvs. stor specifik yta, liten partikelstorlek, yteffekt, hög ytenergi, liten storlekseffekt och makrokvanttunneleffekt) inte utnyttjas fullt ut. I det aktuella protokollet har ett nytt adjuvans baserat på nanoemulsionsteknik med en diameterstorlek på 1-100 nm rapporterats uppvisa god adjuvansaktivitet9. Vi testade rekombinationssubenhetsvaccinantigenproteinet HI (α-hemolysinmutant [Hla] och Fe-jonytbestämmande faktor B [IsdB] subenhet N2 aktivt fragmentfusionsprotein); En rad procedurer fastställdes för att undersöka de fysikaliska egenskaperna och stabiliteten, utvärdera dess specifika antikroppssvar efter intramuskulär administrering och testa vaccinets skyddande effekt med hjälp av en mussystemisk infektionsmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöken utfördes utifrån handboken om användning och skötsel av försöksdjur och godkändes av Försöksdjurens välfärds- och etikkommitté vid Tredje Militärmedicinska Högskolan. Kvinnliga Balb / c-möss, 6-8 veckor gamla, användes för den aktuella studien. Djuren erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning).
1. Beredning av MRSA HI-antigenproteinet
- Skaffa IsdB- och Hla-kloner från kommersiella källor (se materialförteckning), utföra polymeraskedjereaktion (PCR) amplifiering för att förstärka IsdB- och Hla-gener och ligera deras produkter till PGEX-6P-2-plasmiden (erhållen kommersiellt; se materialtabell). Skärm med vektorn Xl/blå stam av Escherichia coli10.
- Omvandla den positiva klonen till E. coli BL21 kompetenta celler (se materialförteckning) och förstärk med hajkultur10.
- Uttryck antigenet och isolera efter induktion med isopropyl-β-D-1-merkaptogalaktospyranosid- och multimodalkromatografi (MMC) isolatsatser11 (se materialtabell).
- Karakterisera antigenproteinet och rena det med en fullautomationsrenare11.
- Affinitetsrenade gutation-S-transferas (GST)-märkta proteiner från clearade lysater med användning av ett kommersiellt tillgängligt affinitetskromatografiharts (se materialtabell).
- Rena de rekombinanta proteinerna med MMC11.
- Ta bort endotoxinet med Triton X-114-fasseparationsmetoden11. Blanda kortfattat 1% Triton X-114 med rekombinant proteineluat vid 0 °C i 5 minuter för att säkerställa en homogen lösning och inkubera vid 37 °C i 5 minuter så att två faser bildas.
- Använd testmetod11 för bakteriellt endotoxin med sköldpaddssatser (se materialförteckning) för att detektera endotoxinkoncentrationen. Endotoxinet för proteinantigen är 0,06 EU/μg, lägre än den internationella standarden (1,5 EU/μg)10.
- Utför ett interferenstest för att eliminera testproduktens eventuella påverkan på endotoxindetektion11.
OBS: Enligt bilaga 2020 till kinesisk farmakopé12 ska endotoxinhalten vara mindre än 5 EU/dos. Känsligheten för limuluslysat (λ0,25 EU/ml) och den maximala effektiva utspädningsfaktorn på 33,3 beräknades12 baserat på MVD = cL/λ, där L är gränsvärdet för bakteriellt endotoxin för testartikeln, c är koncentrationen av testartikelns lösning och när L uttrycks i EU/m är c lika med 1,0 mg/ml. λ är den märkta känsligheten (EU/ml) hos hästskokrabbreagenset i gelmetoden.
- Utför ett interferenstest för att eliminera testproduktens eventuella påverkan på endotoxindetektion11.
- Rekombinera antigenet (48 kDa, bestämt med 12 % natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores [SDS-PAGE]) vid 1,5 mg/ml i sterilt vatten utan endotoxin- eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (natriumdikloratmetod)11.
OBS: Proteinets topptid var 13.843 min, renheten var 99.4% (Högpresterande vätskekromatografimetod) och proteinet lagrades vid -70 ° C10. Genomiskt DNA extraherat från S. aureus-stam MRSA252 (se materialförteckning) användes som PCR-mall. IsdB-genen amplifierades med hjälp av den främre primern 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 och omvänd primer 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. HLA-genen amplifierades med hjälp av den främre primern PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) och den omvända primern PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC).
2. Beredning av nanoemulsionsvaccinet
- Enligt massförhållandet 1: 6: 3 (w / w), tillsätt tre typer av hjälpämnen i följd (isopropylmyristat, polyoxietylenricinolja och propylenglykol; se materialtabell) till HI-antigenproteinlösningen (10 mg / ml) och rör om väl. Tillsätt sedan gradvis steriliserat rent vatten för att nå en slutlig volym på 10 ml och rör om vid 500 rpm och 25 °C i cirka 20 minuter.
OBS: Nanoemulsionen framställd i detta protokoll har en volym av 10 ml och massorna av de tre hjälpämnena är 0,34 g, 2 g respektive 1 g. Proteinlösningen här är arbetslösningen, 10 gånger koncentrationen av den slutliga lösningen. - Bered nanoemulsionsadjuvansvaccinet (1 mg/ml protein) med lågenergiemulgeringsmetoder13 för att erhålla en klar och transparent flytande lösning.
OBS: Den tomma nanoemulsionen (BNE) framställdes med liknande metoder, förutom att vatten ersattes med HI. Den vanliga emulgeringsmetoden innebär att de yttre och inre faserna upphettas till cirka 80 °C för emulgering och sedan omrörs och kyls gradvis. I denna process förbrukas en stor mängd energi, och slutligen erhålles emulsionen.
3. Fysisk karakterisering och stabilitet hos nanoemulsionsadjuvansvaccinet
- Partikelstorlek, zetapotential och polymerdispersionsindexkarakterisering (PDI).
- Bered 100 μl av nanoemulsionsadjuvansvaccinet och späd 50 gånger med vatten för injektion. Tillsätt 2 ml prov för detektion.
- Observera partikelstorlekar, zetapotential och PDI vid 25 °C med hjälp av en Nano Zetasizer (ZS; se materialtabell).
- Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Späd 10 μL nanoemulsionsvaccin 50 gånger med vatten, placera på ett kolbelagt kopparnät med 100 maskor och färga med 1% fosfotungstiksyra (se materialtabell) i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort överskott av fosfotungstiksyralösning med filterpapper.
- Observera morfologin under ett transmissionselektronmikroskop (se materialtabell). Undersök om de färdiga produkterna är nästan stabila och cirkulära inom elektronmikroskopets synfält och om de uppvisar god dispersion.
- Svepelektronmikroskopi (SEM)
- Späd 10 μl nanoemulsionsadjuvansvaccin 50 gånger med vatten, släpp 10 μL förspädda prover på en kiselskiva och placera i en termostatstyrd inkubator på 37 °C i 24 timmar.
- Spraya den beredda platina på kisel i 40 sekunder och svalna till rumstemperatur.
- Observera de morfologiska egenskaperna hos de beredda proverna under ett högupplöst svepelektronmikroskop (se materialtabell). Bestäm om proverna är nästan stabila, sfäriska och väl spridda inom synfältet under elektronmikroskopet.
- Morfologisk stabilitet
- Placera 1 ml nanoemulsionsvaccinprover i mikrocentrifugrör och utvärdera stabiliteten hos färska prover genom centrifugering i 30 minuter vid 13 000 x g vid rumstemperatur (25 °).
- Observera utseendet på dessa färska prover och utför sedan ett termodynamiskt stabilitetstest av sex temperaturcykler (en cykel: förvaras vid 4 °C i 48 timmar, 25 °C i 48 timmar och 37 °C i 48 timmar).
- Låt proverna stå i 15 minuter efter centrifugering för att avgöra om Tyndall-effekten är (om provet är klart och transparent i ljus) och om demulsifiering har skett (visas genom tydlig skiktning efter demulgering).
- SDS-PAGE och western blot
- Skaka proverna, blanda en lösning av 0,6 ml absolut etanol och 0,3 ml vaccin och centrifugera (13 000 x g, 30 min vid rumstemperatur, 25 °C).
- Överför lösningens supernatant till ett rent rör och lös upp fällningen med 0,3 ml vatten. Erhåll supernatanten och fällningslösningarna (både blank nanoemulsion och vaccin) efter behandling med absolut etanol och destillerat vattenlösning och utför samma 50-faldiga utspädning.
- Blanda 2,5 ml separationsgel A och 2,5 ml separationsgel B (se materialtabell), tillsätt 50 μl 10% ammoniumpersulfat och placera snabbt lösningen i glasplattan med en pipett. Blanda 1 ml koncentrerad gel A och 1 ml koncentrerad gel B, tillsätt 20 μL 10% ammoniumpersulfat i glasplattan, sätt in en kam av lämplig storlek och vänta på stelning.
- Tillsätt totalt 5 μl 5x proteinladdande buffertlösning till det utspädda provet som erhållits i steg 3.5.2 och koka provet i 5 minuter.
- Tillsätt 10 μL uppvärmt protein till motsvarande brunn och tillsätt 5 μL proteinmarkör till markörbrunnen.
- Anslut elektroden, slå på elektroforesmätaren (se materialtabell) och justera spänningen till 300 V. Stäng av strömmen när elektroforesen når 1 cm från botten av PAGE-gummit.
- Ta bort gelen och skölj med ddH2O. Tillsätt Coomassie ljusblå G-250 färgningslösning (se materialtabell) i 10 minuter. Häll ut färgningslösningen och skölj gelén två gånger medddH2O.
- Tillsätt den kommersiellt tillgängliga avfärgningslösningen och mikrovågsugn gelen i 1 min. Skaka gelen i 10 minuter och byt avfärgningslösningen upprepade gånger tills gelbakgrunden är klar. Utför sedan gelavbildning (se materialförteckning).
OBS: Den västra blotet förbehandlades, enligt beskrivningen i steg 3.5.1-3.5.6. - Blötlägg tre filterpappersblock med en elektroforesöverföringsbuffert. Blötlägg polyvinylidenfluoridmembranet (PVDF) i metanol i 30 s och överför med ett halvtorrt gelöverföringsinstrument (två lager filterpapper, PVDF-membran, elektroforesgel och ett lager filterpapper). Använd en spänning på 23 V för att överföra membranet i 23 minuter.
- Ta bort PVDF-membranet och tvätta en gång med trisbuffrad saltlösning-Tween 20 (TBST) efter överföring.
- Placera PVDF-membranet i tätningslösning (5 % skummjölkspulverlösning) och försegla över natten vid 4 °C.
- Ta bort PVDF-membranet och tvätta tre gånger med TBST eller 10 min vardera.
- Inkubera med den primära antikroppen (från immuniserade möss med positivt serum). Späd den primära antikroppen11 (se Materialtabell) som ska testas 500 gånger (100 gånger) med TBST. Placera det blockerade PVDF-membranet i den primära antikroppen och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
- Ta bort PVDF-membranet och tvätta tre gånger med TBST i 10 minuter vardera.
- Inkubera med den sekundära antikroppen (se Materialförteckning). Utspädd alkalisk fosfatas (AP)-märkt sekundär anti-musantikropp hos goat 5 000 gånger med TBST. Placera PVDF-membranet i den sekundära antikroppen och inkubera vid 37 °C i 40 minuter.
- Ta bort PVDF-membranet och tvätta fyra gånger med TBST i 10 minuter vardera.
- Sänk ner PVDF-membranen i en blandning (precis tillräckligt för att blötlägga membranet) av AP-substratet nitroblått tetrazol (NBT) och BCIP (5-brom-4-klor-3'-indolyfosfat p-toluidinsalt) (se materialförteckning) för färgning. Ett positivt resultat är lila.
OBS: Resultaten måste vara ett klart lila band, och provremsan och antigenets molekylvikt bör vara i samma märkta position.
4. Bedömning av antikroppsimmunsvar mot detta vaccin efter intramuskulär administrering
OBS: Mössen immuniserades genom intramuskulär injektion av nanoemulsionsvaccinet efter en publicerad rapport11. Mössen administrerades PBS som en negativ kontroll. Vid 1 vecka efter att tre immuniseringar slutförts samlades serum från mössen11. Serumnivåerna av IgG och underklasserna av IgG1, IgG2a och IgG2b bestämdes kvantitativt genom enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA).
- Antigenbeläggning: Späd HI-proteinantigen till 10 μg/ml med beläggningslösning och tillsätt till ELISA-plattan vid 100 μl/brunn. Inkubera vid 4 °C över natten.
OBS: Beläggningslösningen framställs genom upplösning av 1,6 g vattenfritt natriumkarbonat och 2,9 g natriumbikarbonat i 1 liter avjoniserat vatten. - Tätning: Tvätta plattan (tre cykler, varje cykel 300 μl). Tillsätt 300 μL tätningslösning till varje brunn och försegla brunnarna i 2 timmar vid 37 °C.
OBS: Tätningslösningen bereds genom tillsats av Tween-20 och bovint serumalbumin (BSA) till PBS. Innehållet av BSA i PBST-lösningen är 1%. - Serumspädning: Späd provserumet från möss 100 gånger med PBST (ta 3 μl serum och tillsätt det till 297 μl PBST och virvel) och använd 100 μl för varje serumprov. Späd det positiva serumet och det negativa kontrollserumet 100 gånger med PBST genom att tillsätta 4 μl till 396 μl PBST och blanda sedan genom virvelning.
- Utspädning med dubbelt förhållande: Tillsätt 200 μl av ovanstående utspädda experimentserum till första raden av den belagda ELISA-plattan och tillsätt 100 μL PBST till alla brunnar utom den första och den 12:e raden. Utför en utspädning 1:2 successivt från första raden: justera pipetten till 100 μl, överför 100 μl från första raden till andra raden och blanda med pipetten 10 gånger.
- Späd serumet till rad 11 i flera förhållanden och kassera 100 μl vätska.
- Tillsätt utspätt negativt och positivt serum till motsvarande brunnar på rad 12 enligt provmallen (se tabell 1)-100 μl/brunn.
- Försegla ELISA-plattorna med plastfolie och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
- Späd sekundär antikroppsanti-mus IgG-HRP (se Materialtabell) med PBST vid 1:10 000.
- Tvätta plattan (tre cykler, varje cykel 300 μL). Tillsätt sedan 100 μl av den utspädda sekundära antikroppen till varje brunn och inkubera plattan vid 37 °C i 40 minuter.
- Färgning och avslutning: Tvätta plattan (fem cykler, varje cykel 300 μL). Tillsätt 3,3′,5,5′-tetrametylbensidinfärgningslösning (TMB) (100 μl; se materialförteckning) till varje brunn. Placera plattorna vid 37 °C i 10 minuter från ljus och avsluta sedan reaktionen omedelbart med 50 μL 2 MH2SO4.
- Detektera värdet för optisk densitet (OD 450) med en enzymmarkör (läs OD450-värdet inom 15 minuter efter avslutning).
5. Utvärdering av in vivo-effekterna av de nya adjuvansvaccinerna
OBS: Den skyddande effekten av detta nanoemulsionsvaccin utvärderades i en kommersiellt erhållen dödlig MRSA252 musmodell (se materialtabell). Enligt tidigare resultat från vår forskargrupp 14 är 1 x10 8 kolonibildande enheter (CFU)/mus den bästa dosen för att utvärdera den skyddande effekten av den dödliga modellen av MRSA252 bakterieinfektion.
- Stamåtervinning: Skaffa ett rör med fryst MRSA252, inokulera bakterierna på Mueller Hinton (MH) (A)-plattorna (se materialtabell) med "trelinjemetoden" och odla över natten vid 37 °C. Utför stegen i "treradsmetoden" som nämns nedan:
- Håll inokuleringsringen i höger hand, cauterize och kyla den för att få en ring av bakteriell vätska.
- Håll agarplattan i vänster hand (håll locket på bordet) ovanför det främre vänstra området av alkohollampans låga så att plattan vetter mot lågan och förhindrar att bakterierna kommer in i luften. Med höger hand flyttar inokuleringsringen av infekterade bakterier fram och tillbaka på agarytan på ett tätt men icke-överlappande sätt och täcker ett område på ungefär 1/5-1/6 av hela plattan, som är den första zonen.
OBS: Inokuleringsringen och agarn ska vara i mild kontakt i 30°-40° vinkel; Skada agar kan undvikas genom att glida med handledskraft. - Cauterize överskottsbakterierna på inokuleringsringen (om man ska cauterize eller sterilisera varje område beror på mängden bakterier i provet). Efter kylning, upprepa de näst sista raderna 2-3 i slutet och rita ett andra område (cirka 1/4 av plattområdet).
- När den andra zonen är klar, cauterize ringen och dra den tredje zonen på samma sätt för att fylla hela plattan.
- När linjerna har dragits placerades plattan på skålens lock, märk plattan och inkubera i en 37 °C inkubator i 18-24 timmar för att observera fördelningen av kolonier på agarytan. Fokusera uppmärksamheten på om en enda koloni är isolerad och observera koloniegenskaper (såsom storlek, form, transparens och pigmentering).
- Bakteriell aktivering: Nästa dag, ta två 50 ml shakerkolvar och tillsätt 20 ml MH (B) medium (se materialtabell) till varje. Välj två enkla kolonier med en 10 μL pipettspets och lägg dem i shakersna. Inkubera kolonierna över natten vid 220 rpm vid 37 °C.
- Sekundär aktivering: Nästa dag, ta två 50 ml skakkolvar, var och en innehållande 20 ml MH (B) medium. Avlägsna 200 μl bakterielösning från skakapparaten som innehåller de första aktiverade bakterierna, tillsätt till de två nya kolvarna som innehåller 20 ml MH(B)-medium och inkubera vid 37 °C och 220 rpm i 5 timmar.
- Samla upp den andra aktiverade bakterielösningen i ett 50 ml centrifugrör, separera vid 3 000 x g i 20 minuter och kassera supernatanten.
- Resuspendera de utfällda bakterierna i 40 ml saltlösning.
- Mät OD600-värdet för bakterielösningen och justera till 1 med saltlösning. Vid denna tidpunkt var bakteriemängden MRSA252 i vårt experiment 2 x 109 CFU / ml.
- Späd bakterielösningen med en OD600 av 1 till en koncentration av 1 x 109 CFU/ml.
- Dela slumpmässigt 48 Balb / c-möss i fyra grupper (n = 12).
OBS: Grupp I: PBS-grupp; Grupp II: BNE-kontrollgrupp. Grupp III: naiv antigengrupp [protein]. Grupp IV: nanoemulsionsadjuvansvaccingrupp. - Bedöva mössen genom intraperitoneal injektion av 100 mg/kg 1% pentobarbitalnatrium.
- Bestråla mössen med en infraröd fysioterapilampa (se materialförteckning) i cirka 1 minut för att orsaka vasodilatation av svansvenen.
- Utmana mössen med injektion av den utspädda bakterielösningen (steg 5.7) i svansvenen, 100 μL per mus.
- Placera mössen under den infraröda fysioterapilampan tills de kan återgå till normal aktivitet.
- Observera och registrera överlevnaden hos möss var 12: e timme i 10 dagar.
- Avliva mössen som överlevde attacken genom intraperitoneal injektion av 100 mg / kg 1% natriumpentobarbital.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet för beredning av nanoemulsionsadjuvansvaccinet och in vitro- och in vivo-tester av detta vaccin utvärderades. TEM, AFM och DLS användes för att bestämma de viktiga egenskaperna hos zetapotentialen och partikelstorleken på ytan av detta prov (figur 1). SDS-PAGE och western blotting visade att mängden antigen i fällningen och supernatanten inte signifikant försämrades efter centrifugering, vilket indikerade att vaccinet var strukturellt intakt, specifikt och immunogent (figur 2). Adjuvansvaccinet mot nanoemulsion ökade signifikant de totala antikroppstitrarna IgG, IgG1 och IgG 2a. Vaccinets immunogenicitet förbättrades signifikant (figur 3A-C). Serumvärdena för IgG2b OD vid 450 nm i antigengruppen var de högsta (utspädda vid 1:500 PBS) (figur 3D). Den dödliga MRSA252 musmodellen återspeglade mest direkt att nanoemulsionsadjuvansvaccinet visade en god skyddande effekt och effektivt hämmade bakteriell infektion med MRSA252, vilket förbättrade överlevnadsgraden hos infekterade möss (figur 4).
Figur 1: Fysiska egenskaper hos det nya nanoemulsionsadjuvansvaccinet . (A) Transmissionselektronmikrografi. (B) Atomkraftsmikroskopi, mikrografi. (C) Storlek, diameter och fördelning. (D) Zetas potential och distribution. Figuren är reproducerad från Sun, HW et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Ursprungligen publicerad av och använd med tillstånd från Dove Medical Press Ltd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Fysisk stabilitet hos det nya nanoemulsionsadjuvansvaccinet . (A) De antigena proteinernas strukturella integritet. B) Antigenproteinets strukturella specificitet. Bana 3: blank nanoemulsionsbehandlad supernatant. Bana 4: utfällning för behandling av blanknanoemulsion; Körfält 5: färgad markör; Bana 6: vaccin supernatant; Bana 7: vaccinfällning; Bana 8: Vaccinbehandlingsledare. Bana 9: utfällning av vaccinbehandling. Lane 10: naturligt proteinmedel; (A) och (B) blandad term. Tydligt definierade proteinkanaler markeras med svarta rutor. Svarta pilar indikerar antigena proteiner. Figuren är reproducerad från Sun, HW et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Ursprungligen publicerad av och använd med tillstånd från Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: IgG och dess subgrupps antikroppsnivåer efter intramuskulär injektion med nanoemulsionsadjuvansvaccinet. (A) Log2-värdet för IgG-titrarna. b) 450 nm optisk densitet av serum IgG1. (C) 450 nm optisk densitet av serum IgG2a. d) 450 nm optisk densitet av serum IgG2b. Figuren är reproducerad från Sun, HW et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Ursprungligen publicerad av och använd med tillstånd från Dove Medical Press Ltd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Skyddande effekt i den dödliga modellen av MRSA252 bakteriell infektion. Överlevnadsförhållandet hos möss som svar på systemisk MRSA-infektion. Figuren är reproducerad från Sun, HW et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Ursprungligen publicerad av och använd med tillstånd från Dove Medical Press Ltd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: ELISA-spikningssekvens och utspädningsmall. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IsdB, ett bakteriecellväggförankrat och järnreglerat ytprotein, spelar en viktig roll i processen att erhålla hemjärn15. Hla, alfatoxin, är bland de mest effektiva bakterietoxiner som är kända i MRSA och kan bilda porer i eukaryota celler och störa vidhäftning och epitelceller16. I vår studie konstruerades och uttrycktes ett nytt rekombinations-MRSA-antigenprotein (HI) med genteknik baserad på antigengenerna IsdB och Hla. Därefter utvecklades ett nanoemulsionsvaccin med lågenergiemulgeringsmetoden, och stabiliteten och effektiviteten hos detta vaccin utvärderades. Till exempel påverkas vissa egenskaper, såsom långsiktig stabilitet, struktur, form, absorption och effekt in vivo, kraftigt av storleken på emulsionsdroppen7. Resultaten visade att partikelstorlek var en viktig faktor som påverkade transporten av nanoemulsioner in vivo och deras fagocytos av antigenpresenterande celler17. När det gäller cytofagocytos fagocyteras nanopartiklar mindre än 1 μm lättare av dendritiska celler (DC) och makrofager och är mest benägna att stimulera systemisk immunitet18.
När det gäller partikeltransport är nanopartiklar mindre än 100 nm mer benägna att överföras genom lymfkärl för att förbättra immuneffekten; Små nanopartiklar infiltrerar dock i blodkärl, medan stora nanopartiklar saktar ner sin transporthastighet i lymfkärl19. Således ligger den optimala partikelstorleken i intervallet 20-50 nm. Därför är det viktigt att studera de fysiska egenskaperna hos nanopartiklar, inklusive form, storlek och zetapotential. TEM har med sin höga precision blivit ett viktigt och grundläggande verktyg för att förstå egenskaperna hos nanoemulsionsadjuvansvacciner. Dessutom har tekniken tillämpats i stor utsträckning inom många områden i flera år. Ett annat nanomekaniskt karakteriseringsverktyg med högupplöst information i 3D- och nanoskala, AFM, användes också för att utvärdera nanoemulsionsvaccinet13. Viktigt är att DLS, som samtidigt avslöjar både storlek och laddning20, kan ge viktig information, såsom aggregeringstillståndet för nanoemulsionsvaccinpartiklar i lösning. Enligt litteraturen är ett högt zetapotentialvärde oumbärligt för den fysiska och kemiska stabiliteten hos kolloidala suspensioner, eftersom en stor repulsiv kraft ofta förhindrar aggregering orsakad av tillfälliga kollisioner med intilliggande nanopartiklar. Därför inrättade vi i vår forskning dessa system och utvärderade deras fysikaliska och kemiska egenskaper med TEM, AFM och DLS.
Proteinvacciner spelar en viktig roll i förebyggande och behandling av stora infektionssjukdomar21. Proteinvacciner har utvecklats snabbt de senaste åren, men allvarliga utmaningar kvarstår i immuneffektivitet och uthållighet. De grundläggande orsakerna till detta är dålig proteinstabilitet, liten distributionskoefficient, kort biologisk halveringstid för antigener och höga clearancehastigheter in vivo22. I detta protokoll utvärderades stabiliteten hos det nya nanoemulsionsvaccinet och ingen antigennedbrytning observerades av SDS-PAGE eller western blot.
Ett säkert, effektivt och säljbart proteinvaccin måste kompletteras med ett lämpligt immunadjuvans för att signifikant förbättra proteinantigenets immunogenicitet och typen av skyddande immunsvar20 för att uppnå det optimala vaccinets immunskydd. Antikroppsnivån stimulerad av ett proteinvaccin är bland de viktiga indikatorerna för effektivt förebyggande och behandling av infektion, och antikroppstitern är ett viktigt index för att utvärdera om det nya nanoemulsionsadjuvansen kan förbättra immunogeniciteten hos det nakna antigenet. Nya immunadjuvans kan avsevärt stimulera kroppen att förbättra de humorala och cellulära immunsvarsnivåerna, och att berika typerna av immunsvar och immunskyddande effekt hos vacciner är en viktig utvecklingsriktning och komponenten i framtida forskning och utveckling av nya vacciner23. Därför detekterades i detta protokoll antikroppstitrar av musserumspecifikt IgG, IgG1, IgG2a och IgG2b med det nya nanoemulsionsadjuvansvaccinet. Den dödliga musmodellen24 är guldstandarden för utvärdering av vacciner, och i vårt protokoll användes en dödlig MRSA252 musmodell för att utvärdera den skyddande effekten. Resultaten visade att det nya adjuvansvaccinet mot nanoemulsion effektivt förbättrade överlevnaden hos Balb/c-möss infekterade med MRSA.
Detta protokoll är inte tillräckligt vid stabilitetsutvärderingen av nanoemulsionsvacciner. Cirkulär dikroism är en lämplig metod om den kan tillämpas för att detektera den rumsliga strukturen hos vaccinproteiner på ett enkelt och snabbt sätt. Även om överlevnadsgraden för möss som testats av attacken är guldstandarden för utvärdering av in vivo-testet och vaccinets effektivitet, skulle det vara mer övertygande om mängden bakteriekolonisering av organen hos möss efter attack kunde mätas. Därför finns det fortfarande vissa brister i det nuvarande protokollet för att utvärdera immunsvaret hos nanoemulsionsadjuvansvaccinet, och ovanstående experiment måste kompletteras i efterföljande relevanta experiment för utvärdering.
Sammanfattningsvis är det nödvändigt att upprätta en serie utvärderingar av fysikaliska egenskaper, stabilitet, specifikt immunsvar och utmaningsskydd. Att slutföra dessa system kommer att ge viktiga experimentella grunder för tillämpning och utveckling av nya nanoemulsionsadjuvansvacciner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter i detta arbete.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av nr 2021YFC2302603 i Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram, nr 32070924 och 32000651 i NSFC och nr 2019jcyjA-msxmx0159 i Natural Science Foundation Project Program of Chongqing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia. , China Medical Science and Technology Press. Beijing. 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D.
- Saeed, K., et al.
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J.
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
