Summary
Das vorliegende Protokoll bereitet die physikalischen Eigenschaften, die Immunantwort und die In-vivo-Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs vor und bewertet sie.
Abstract
Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffe haben aufgrund ihrer geringen Partikelgröße, ihrer hohen thermischen Stabilität und ihrer Fähigkeit, gültige Immunreaktionen zu induzieren, große Aufmerksamkeit erregt. Die Etablierung einer Reihe umfassender Protokolle zur Bewertung der Immunantwort eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs ist jedoch von entscheidender Bedeutung. Daher wird in diesem Artikel ein strenges Verfahren zur Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Impfstoffs (mittels Transmissionselektronenmikroskopie [TEM], Rasterkraftmikroskopie [AFM] und dynamischer Lichtstreuung [DLS]), der Stabilität des Impfstoffantigens und -systems (durch einen Hochgeschwindigkeitszentrifugentest, einem thermodynamischen Stabilitätstest, SDS-PAGE und Western Blot) und der spezifischen Immunantwort (IgG1, IgG2a und IgG2b). Mit diesem Ansatz können Forscher die Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs in einem tödlichen MRSA252-Mausmodell genau bewerten. Mit diesen Protokollen kann das vielversprechendste Nanoemulsions-Impfstoff-Adjuvans in Bezug auf das effektive Adjuvanspotenzial identifiziert werden. Darüber hinaus können die Methoden dazu beitragen, neuartige Impfstoffe für die zukünftige Entwicklung zu optimieren.
Introduction
Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) ist ein opportunistischer Erreger mit einer der höchsten Infektionsraten auf einer Intensivstation (ICU) Station1, kardiologischen Abteilungen und Verbrennungsabteilungen weltweit. MRSA weist hohe Infektionsraten, Mortalität und breite Arzneimittelresistenzen auf, was eine große klinische Behandlung erschwert2. In der 2017 von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) veröffentlichten globalen Prioritätenliste antibiotikaresistenter Bakterien wurde MRSA in die kritischste Kategorie3 eingestuft. Ein Impfstoff gegen eine MRSA-Infektion wird daher dringend benötigt.
Aluminium-Adjuvans wird seit langem verwendet, und der Hilfsmechanismus des Adjuvans ist relativ klar, sicher, wirksam und gut verträglich4. Aluminium-Adjuvantien sind derzeit eine weit verbreitete Art von Adjuvans. Es wird allgemein angenommen, dass Antigene, die an Aluminiumsalzpartikeln adsorbiert werden, die Stabilität und die Fähigkeit der Injektionsstelle, Antigene aufzunehmen, verbessern können, was zu einer guten Absorption und langsamen Freisetzung führt5. Derzeit besteht der Hauptnachteil von Aluminium-Adjuvantien darin, dass ihnen eine adjuvante Wirkung fehlt oder sie nur eine schwache adjuvante Wirkung auf einige Antigene von Impfstoffkandidaten aufweisen6. Darüber hinaus induzieren Aluminium-Adjuvantien IgE-vermittelte Überempfindlichkeitsreaktionen5. Daher ist es notwendig, neuartige Adjuvantien zu entwickeln, um eine stärkere Immunantwort zu stimulieren.
Nanoemulsions-Adjuvantien sind kolloidale Dispersionssysteme, die aus Öl, Wasser, Tensiden und Cotensiden bestehen7. Darüber hinaus sind die Adjuvantien thermodynamisch stabil und isotrop, können autoklaviert oder durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation stabilisiert werden und können unter milden Präparationsbedingungen spontan gebildet werden. Mehrere Emulsionshilfsstoffe (z. B. MF59, NB001-002-Serie, AS01-04-Serie usw.) sind derzeit auf dem Markt oder befinden sich in der klinischen Forschung, aber ihre Partikelgrößen sind größer als 160 nm8. Daher können die Vorteile nanoskaliger (1-100 nm) medizinischer Zubereitungen (d. h. große spezifische Oberfläche, kleine Partikelgröße, Oberflächeneffekt, hohe Oberflächenenergie, kleiner Größeneffekt und Makro-Quantentunneleffekt) nicht voll ausgeschöpft werden. Im vorliegenden Protokoll wurde berichtet, dass ein neuartiges Adjuvans auf Basis der Nanoemulsionstechnologie mit einem Durchmesser von 1-100 nm eine gute Adjuvansaktivität aufweist9. Wir testeten die Rekombinationsuntereinheit Impfstoff-Antigen-Protein HI (α-Hämolysin-Mutante [Hla] und Fe-Ionen-Oberflächen-bestimmender Faktor B [IsdB] Untereinheit N2 aktives Fragment-Fusionsprotein); Es wurde eine Reihe von Verfahren etabliert, um die physikalischen Eigenschaften und die Stabilität zu untersuchen, die spezifische Antikörperantwort nach intramuskulärer Verabreichung zu bewerten und die Schutzwirkung des Impfstoffs anhand eines systemischen Infektionsmodells der Maus zu testen.
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Protocol
Die Tierversuche wurden auf der Grundlage des Handbuchs zur Verwendung und Pflege von Versuchstieren durchgeführt und von der Versuchstierschutz- und Ethikkommission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet. Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Herstellung des MRSA-HI-Antigen-Proteins
- Sie beziehen IsdB- und Hla-Klone aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle), führen eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation durch, um IsdB- und Hla-Gene zu amplifizieren, und ligieren ihre Produkte an das PGEX-6P-2-Plasmid (kommerziell erhältlich; siehe Materialtabelle). Sieb mit dem Vektor Xl/blauer Stamm von Escherichia coli10.
- Transformieren Sie den positiven Klon in E. coli BL21-kompetente Zellen (siehe Materialtabelle) und amplifizieren Sie ihn mit Haikultur10.
- Exprimieren des Antigens und Isolats nach Induktion mit Isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranosid und multimodalen Chromatographie-Isolatkits (MMC)11 (siehe Materialtabelle).
- Charakterisieren Sie das Antigenprotein und reinigen Sie es mit einem vollautomatischen Aufreiniger11.
- Affinitätsreinigung von Gutathion-S-Transferase (GST)-markierten Proteinen aus geklärten Lysaten unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Affinitätschromatographieharzes (siehe Materialtabelle).
- Reinigen Sie die rekombinanten Proteine mit MMC11.
- Entfernen Sie das Endotoxin mit der Triton X-114 Phasentrennungsmethode11. Mischen Sie kurz 1 % Triton X-114 mit rekombinantem Proteineluat bei 0 °C für 5 min, um eine homogene Lösung zu gewährleisten, und inkubieren Sie es 5 min lang bei 37 °C, damit sich zwei Phasen bilden können.
- Verwenden Sie die bakterielle Endotoxin-Testmethode11 mit Turtle-Kits (siehe Materialtabelle), um die Endotoxinkonzentration nachzuweisen. Das Endotoxin für Proteinantigen liegt mit 0,06 EU/μg unter dem internationalen Standard (1,5 EU/μg)10.
- Führen Sie einen Interferenztest durch, um den möglichen Einfluss des Testprodukts auf den Endotoxinnachweisauszuschließen 11.
HINWEIS: Gemäß Anhang 2020 des chinesischen Arzneibuchs12 sollte der Endotoxingehalt weniger als 5 EU/Dosis betragen. Die Sensitivität von Limuluslysat (λ0,25 EU/ml) und das maximale effektive Verdünnungsverhältnis von 33,3 wurden12 auf der Grundlage von MVD = cL/λ berechnet, wobei L der Grenzwert für bakterielles Endotoxin für den Prüfgegenstand ist, c die Konzentration der Prüflingslösung ist und wenn L in EU/m ausgedrückt wird, c gleich 1,0 mg/ml ist. λ ist die markierte Sensitivität (EU/ml) des Pfeilschwanzkrebsreagenzes in der Gelmethode.
- Führen Sie einen Interferenztest durch, um den möglichen Einfluss des Testprodukts auf den Endotoxinnachweisauszuschließen 11.
- Rekombinieren Sie das Antigen (48 kDa, bestimmt durch 12%ige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese [SDS-PAGE]) bei 1,5 mg/ml in sterilem Wasser ohne Endotoxin oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Natriumdichloratmethode)11.
HINWEIS: Die Proteinspitzenzeit betrug 13,843 min, die Reinheit betrug 99,4 % (Hochleistungsflüssigkeitschromatographiemethode) und das Protein wurde bei -70 °C10 gelagert. Als PCR-Template wurde genomische DNA verwendet, die aus dem S. aureus-Stamm MRSA252 extrahiert wurde (siehe Materialtabelle). Das IsdB-Gen wurde mit dem Vorwärtsprimer 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAAG amplifiziert
C-39 und der umgekehrte Primer 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. Das Hla-Gen wurde mit dem Forward-Primer PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) und dem Reverse-Primer PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC).
2. Herstellung des Nanoemulsionsimpfstoffs
- Entsprechend dem Massenverhältnis von 1:6:3 (w/w) drei Arten von Hilfsstoffen nacheinander (Isopropylmyristat, Polyoxyethylen-Rizinusöl und Propylenglykol; siehe Materialtabelle) in die HI-Antigen-Proteinlösung (10 mg/ml) geben und gut umrühren. Fügen Sie dann allmählich sterilisiertes reines Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 10 ml zu erreichen, und rühren Sie bei 500 U/min und 25 °C etwa 20 Minuten lang.
ANMERKUNG: Die in diesem Protokoll hergestellte Nanoemulsion hat ein Volumen von 10 ml, und die Massen der drei Hilfsstoffe betragen 0,34 g, 2 g bzw. 1 g. Die Proteinlösung ist hier die Arbeitslösung, die 10-fache Konzentration der. - Der Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoff (1 mg/ml Protein) wird mit niederenergetischen Emulgiermethoden13 hergestellt, um eine klare und transparente flüssige Lösung zu erhalten.
HINWEIS: Die Blank-Nanoemulsion (BNE) wurde mit ähnlichen Methoden hergestellt, mit der Ausnahme, dass Wasser durch HI ersetzt wurde. Bei der üblichen Emulgierungsmethode werden die äußere und innere Phase zur Emulgierung auf ca. 80 °C erhitzt und anschließend gerührt und nach und nach abgekühlt. Bei diesem Prozess wird eine große Menge an Energie verbraucht und schließlich die Emulsion erhalten.
3. Physikalische Charakterisierung und Stabilität des Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs
- Charakterisierung der Partikelgröße, des Zetapotenzials und des Polymerdispersionsindex (PDI).
- Bereiten Sie 100 μl des Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs vor und verdünnen Sie ihn 50-fach mit Wasser für Injektionszwecke. Fügen Sie 2 ml Probe zum Nachweis hinzu.
- Beobachten Sie die Partikelgrößen, das Zetapotenzial und den PDI bei 25 °C mit einem Nano-Zetasizer (ZS; siehe Materialtabelle).
- Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
- 10 μl Nanoemulsionsimpfstoff 50-fach mit Wasser verdünnen, auf ein kohlenstoffbeschichtetes 100-Mesh-Kupfergitter legen und mit 1%iger Phosphowolframsäure (siehe Materialtabelle) 5 min bei Raumtemperatur färben.
- Überschüssige Phosphowolframsäurelösung mit Filterpapier entfernen.
- Beobachten Sie die Morphologie unter dem Transmissionselektronenmikroskop (siehe Materialtabelle). Untersuchen Sie, ob die fertigen Produkte im Sichtfeld des Elektronenmikroskops nahezu stabil und kreisförmig sind und ob sie eine gute Dispersion aufweisen.
- Rasterelektronenmikroskopie (REM)
- 10 μl des Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs 50-fach mit Wasser verdünnen, 10 μl vorverdünnte Proben auf einen Siliziumwafer tropfen lassen und für 24 h in einen thermostatgesteuerten Inkubator bei 37 °C geben.
- Das vorbereitete Platin 40 s lang auf das Silikon sprühen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Beobachten Sie die morphologischen Eigenschaften der präparierten Proben unter einem hochauflösenden Rasterelektronenmikroskop (siehe Materialtabelle). Bestimmen Sie, ob die Proben unter dem Elektronenmikroskop nahezu stabil, kugelförmig und gut im Sichtfeld verteilt sind.
- Morphologische Stabilität
- Geben Sie 1 ml Nanoemulsions-Impfstoffproben in Mikrozentrifugenröhrchen und bewerten Sie die Stabilität frischer Proben, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 13.000 x g bei Raumtemperatur (25 °) zentrifugieren.
- Beobachten Sie das Aussehen dieser frischen Proben und führen Sie dann einen thermodynamischen Stabilitätstest mit sechs Temperaturzyklen durch (ein Zyklus: 48 h bei 4 °C, 48 h bei 25 °C und 48 h bei 37 °C lagern).
- Lassen Sie die Proben nach der Zentrifugation 15 Minuten stehen, um festzustellen, ob ein Tyndall-Effekt vorliegt (ob die Probe unter Licht klar und transparent ist) und ob eine Demulgierung stattgefunden hat (dargestellt durch eine klare Schichtung nach der Demulgierung).
- SDS-PAGE und Western Blot
- Schütteln Sie die Proben, mischen Sie eine Lösung aus 0,6 ml absolutem Ethanol und 0,3 ml Impfstoff und zentrifugieren Sie sie (13.000 x g, 30 min bei Raumtemperatur, 25 °C).
- Übertragen Sie den Überstand der Lösung in ein sauberes Röhrchen und lösen Sie den Niederschlag mit 0,3 ml Wasser auf. Nach der Behandlung mit absolutem Ethanol und destillierter Wasserlösung erhalten Sie den Überstand und die Fällungslösungen (sowohl Blind-Nanoemulsion als auch Impfstoff) und führen Sie die gleiche 50-fache Verdünnung durch.
- Mischen Sie 2,5 ml Trenngel A und 2,5 ml Trenngel B (siehe Materialtabelle), fügen Sie 50 μl 10%iges Ammoniumpersulfat hinzu und geben Sie die Lösung mit einer Pipette schnell in die Glasplatte. Mischen Sie 1 ml konzentriertes Gel A und 1 ml konzentriertes Gel B, fügen Sie 20 μl 10%iges Ammoniumpersulfat in die Glasplatte hinzu, setzen Sie einen Kamm in geeigneter Größe ein und warten Sie auf die Erstarrung.
- Zu der in Schritt 3.5.2 erhaltenen verdünnten Probe werden insgesamt 5 μl 5x Proteinladepufferlösung gegeben und die Probe 5 min lang gekocht.
- Geben Sie 10 μl erhitztes Protein in die entsprechende Vertiefung und fügen Sie 5 μl Proteinmarker in die Markervertiefung hinzu.
- Schließen Sie die Elektrode an, schalten Sie das Elektrophoresemessgerät ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie die Spannung auf 300 V ein. Schalten Sie die Stromversorgung aus, wenn die Elektrophorese 1 cm von der Unterseite des PAGE-Gummis entfernt ist.
- Entfernen Sie das Gel und spülen Sie es mit ddH2O ab. Fügen Sie Coomassie hellblaue G-250-Färbelösung (siehe Materialtabelle) für 10 Minuten hinzu. Gießen Sie die Färbelösung aus und spülen Sie das Gel zweimal mit ddH2O aus.
- Fügen Sie die handelsübliche Entfärbungslösung hinzu und erhitzen Sie das Gel 1 Minute lang in der Mikrowelle. Schütteln Sie das Gel 10 Minuten lang und wechseln Sie die Entfärbungslösung wiederholt, bis der Gelhintergrund klar ist. Führen Sie dann eine Gel-Bildgebung durch (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Der Western-Blot wurde vorverarbeitet, wie in den Schritten 3.5.1-3.5.6 beschrieben. - Tränken Sie drei Filterpapierblöcke mit einem Elektrophorese-Transferpuffer. Die Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran wird 30 s lang in Methanol eingeweicht und mit einem halbtrockenen Geltransfergerät (zwei Schichten Filterpapier, PVDF-Membran, Elektrophoresegel und eine Schicht Filterpapier) übertragen. Verwenden Sie eine Spannung von 23 V, um die Membran 23 Minuten lang zu übertragen.
- Entfernen Sie die PVDF-Membran und waschen Sie sie nach dem Transfer einmal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung-Tween 20 (TBST).
- Legen Sie die PVDF-Membran in eine Versiegelungslösung (5%ige Magermilchpulverlösung) und verschließen Sie sie über Nacht bei 4 °C.
- Entfernen Sie die PVDF-Membran und waschen Sie sie dreimal mit TBST oder jeweils 10 Minuten.
- Inkubation mit dem Primärantikörper (von immunisierten Mäusen mit positivem Serum). Den zu testenden Primärantikörper11 (siehe Materialtabelle) 500-fach (100-fach) mit TBST verdünnen. Die blockierte PVDF-Membran in den Primärantikörper einsetzen und bei 37 °C 1 h inkubieren.
- Entfernen Sie die PVDF-Membran und waschen Sie sie dreimal mit TBST für jeweils 10 Minuten.
- Inkubation mit dem Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle). 5.000-fach verdünnter Anti-Maus-Antikörper gegen die Alkalische Phosphatase (AP) mit TBST. Die PVDF-Membran wird in den Sekundärantikörper eingesetzt und bei 37 °C für 40 min inkubiert.
- Entfernen Sie die PVDF-Membran und waschen Sie sie viermal mit TBST für jeweils 10 Minuten.
- Tauchen Sie die PVDF-Membranen zum Färben in eine Mischung (gerade genug, um die Membran einzuweichen) aus dem AP-Substrat Nitroblautetrazol (NBT) und BCIP (5-Brom-4-chlor-3'-indolyphosphat-p-toluidinsalz) (siehe Materialtabelle). Ein positives Ergebnis ist Lila.
Anmerkungen: Die Ergebnisse müssen eine klare violette Bande sein, und der Probenstreifen und das Molekulargewicht des Antigens sollten sich an derselben markierten Position befinden.
4. Beurteilung der Antikörper-Immunantwort auf diesen Impfstoff nach intramuskulärer Verabreichung
HINWEIS: Die Mäuse wurden nach einem veröffentlichten Bericht durch intramuskuläre Injektion des Nanoemulsionsimpfstoffs immunisiert11. Den Mäusen wurde PBS als Negativkontrolle verabreicht. 1 Woche nach Abschluss von drei Impfungen wurde den Mäusen Serum entnommen11. Die Serumspiegel von IgG und Subklassen von IgG1, IgG2a und IgG2b wurden mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) quantitativ bestimmt.
- Antigen-Beschichtung: HI-Protein-Antigen mit Überzugslösung auf 10 μg/ml verdünnen und bei 100 μl/Well auf die ELISA-Platte geben. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
Anmerkungen: Die Beschichtungslösung wird hergestellt, indem 1,6 g wasserfreies Natriumcarbonat und 2,9 g Natriumbicarbonat in 1 l deionisiertem Wasser gelöst werden. - Versiegelung: Waschen Sie die Platte (drei Zyklen, jeder Zyklus 300 μL). Geben Sie 300 μl der Versiegelungslösung in jede Vertiefung und verschließen Sie die Vertiefungen 2 h lang bei 37 °C.
Anmerkungen: Die Versiegelungslösung wird durch Zugabe von Tween-20 und Rinderserumalbumin (BSA) zu PBS hergestellt. Der BSA-Gehalt in der PBST-Lösung beträgt 1 %. - Serumverdünnung: Verdünnen Sie das Probenserum von Mäusen 100 Mal mit PBST (nehmen Sie 3 μl Serum und fügen Sie es zu 297 μl PBST und Vortex hinzu) und verwenden Sie 100 μl für jede Serumprobe. Verdünnen Sie das positive Serum und das Negativkontrollserum 100 Mal mit PBST, indem Sie 4 μl bis 396 μl PBST hinzufügen und dann durch Vortexen mischen.
- Verdünnung des doppelten Verhältnisses: Geben Sie 200 μl des oben genannten verdünnten experimentellen Serums in die erste Reihe der beschichteten ELISA-Platte und fügen Sie 100 μl PBST in alle Vertiefungen außer der ersten und 12. Reihe hinzu . Führen Sie eine 1:2-Verdünnung nacheinander ab der ersten Reihe durch: Stellen Sie die Pipette auf 100 μl ein, übertragen Sie 100 μl von der ersten Reihe in die zweite Reihe und mischen Sie 10 Mal mit der Pipette.
- Verdünnen Sie das Serum in mehreren Verhältnissen auf Reihe 11 und verwerfen Sie 100 μl Flüssigkeit.
- Verdünntes negatives und positives Serum gemäß der Probenvorlage (siehe Tabelle 1) in die entsprechenden Vertiefungen in Zeile 12 geben (siehe Tabelle 1)-100 μl/Well.
- Die ELISA-Platten mit Frischhaltefolie verschließen und bei 37 °C 1 h inkubieren.
- Sekundärer Antikörper Anti-Maus-IgG-HRP (siehe Materialtabelle) mit PBST im Verhältnis 1:10.000 verdünnen.
- Waschen Sie die Platte (drei Zyklen, jeder Zyklus 300 μl). Geben Sie dann 100 μl des verdünnten Sekundärantikörpers in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 40 Minuten lang bei 37 °C.
- Färbung und Abschluss: Waschen Sie die Platte (fünf Zyklen, jeder Zyklus 300 μl). 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)-Färbelösung (100 μl; siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung geben. Platzieren Sie die Platten bei 37 °C für 10 min lichtgeschützt und beenden Sie die Reaktion sofort mit 50 μl 2 M H2SO4.
- Ermitteln Sie den Wert der optischen Dichte (OD 450) mit einem Enzymmarker (lesen Sie den OD450-Wert innerhalb von 15 Minuten nach dem Abschluss ab).
5. Evaluierung der In-vivo-Effekte der neuartigen adjuvanten Impfstoffe
HINWEIS: Die Schutzwirkung dieses Nanoemulsionsimpfstoffs wurde in einem kommerziell hergestellten tödlichen MRSA252 Mausmodell bewertet (siehe Materialtabelle). Nach den bisherigen Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe 14 ist 1 x10 8 koloniebildende Einheiten (KBE)/Maus die beste Dosis, um die Schutzwirkung des letalen Modells der MRSA252 bakteriellen Infektion zu bewerten.
- Stammrückgewinnung: Besorgen Sie sich ein Röhrchen mit gefrorenem MRSA252, beimpfen Sie die Bakterien auf Mueller Hinton (MH) (A)-Platten (siehe Materialtabelle) mit der "Drei-Linien-Methode" und kultivieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Führen Sie die Schritte der "Drei-Linien-Methode" wie unten beschrieben aus:
- Halten Sie den Impfring in der rechten Hand, verätzen und kühlen Sie ihn ab, um einen Ring aus bakterieller Flüssigkeit zu erhalten.
- Halten Sie die Agarplatte in der linken Hand (halten Sie den Deckel auf dem Tisch) über den vorderen linken Bereich der Flamme der Alkohollampe, so dass die Platte der Flamme zugewandt ist und verhindert, dass die Bakterien in die Luft gelangen. Bewegen Sie mit der rechten Hand den Impfring der infizierten Bakterien dicht, aber nicht überlappend auf der Agaroberfläche hin und her, wobei Sie eine Fläche von etwa 1/5-1/6 der gesamten Platte, der ersten Zone, abdecken.
Anmerkungen: Der Impfring und der Agar sollten in einem Winkel von 30°-40° in leichtem Kontakt stehen. Eine Beschädigung des Agars kann durch Gleiten mit Kraft aus dem Handgelenk vermieden werden. - Kauterisieren Sie die überschüssigen Bakterien auf dem Impfring (ob Sie jeden Bereich kauterisieren oder sterilisieren, hängt von der Menge der Bakterien in der Probe ab). Nach dem Abkühlen die vorletzten Reihen 2-3 am Ende wiederholen und eine zweite Fläche (ca. 1/4 der Tellerfläche) einzeichnen.
- Nachdem die zweite Zone fertig ist, kauterisieren Sie den Ring und zeichnen Sie die dritte Zone auf die gleiche Weise, um die gesamte Platte zu füllen.
- Nachdem die Linien gezeichnet sind, stellen Sie die Platte auf den Deckel der Schale, markieren Sie die Platte und inkubieren Sie sie 18-24 h lang in einem 37 °C-Inkubator, um die Verteilung der Kolonien auf der Agaroberfläche zu beobachten. Konzentrieren Sie sich darauf, ob eine einzelne Kolonie isoliert ist, und beobachten Sie die Eigenschaften der Kolonie (wie Größe, Form, Transparenz und Pigmentierung).
- Bakterielle Aktivierung: Nehmen Sie am nächsten Tag zwei 50-ml-Shaker-Flaschen und fügen Sie jeweils 20 ml MH (B)-Medium (siehe Materialtabelle) hinzu. Wählen Sie zwei einzelne Kolonien mit einer 10-μl-Pipettenspitze aus und geben Sie sie in die Shaker. Inkubieren Sie die Völker über Nacht bei 220 U/min bei 37 °C.
- Sekundäre Aktivierung: Nehmen Sie am nächsten Tag zwei 50-ml-Schüttelkolben mit jeweils 20 ml MH(B)-Medium ein. 200 μl Bakterienlösung aus dem Schüttler mit den ersten aktivierten Bakterien entnehmen, in die beiden neuen Kolben mit 20 ml MH (B)-Medium geben und 5 h bei 37 °C und 220 U/min inkubieren.
- Sammeln Sie die zweite aktivierte Bakterienlösung in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen, trennen Sie sie 20 Minuten lang bei 3.000 x g und entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die ausgefällten Bakterien in 40 ml Kochsalzlösung.
- Messen Sie den OD600-Wert der Bakterienlösung und stellen Sie ihn mit Kochsalzlösung auf 1 ein. Zu diesem Zeitpunkt betrug die bakterielle Menge an MRSA252 in unserem Experiment 2 x 109 KBE/ml.
- Verdünnen Sie die Bakterienlösung mit einem OD600 von 1 auf eine Konzentration von 1 x 109 KBE/ml.
- Teilen Sie 48 Balb/c-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen (n=12) ein.
HINWEIS: Gruppe I: PBS-Gruppe; Gruppe II: BNE-Kontrollgruppe; Gruppe III: naive Antigen-[Protein]-Gruppe; Gruppe IV: Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffgruppe. - Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1%igem Pentobarbital-Natrium.
- Bestrahlen Sie die Mäuse ca. 1 Minute lang mit einer Infrarot-Physiotherapielampe (siehe Materialtabelle), um eine Vasodilatation der Schwanzvene zu bewirken.
- Fordern Sie die Mäuse heraus, indem Sie die verdünnte Bakterienlösung (Schritt 5.7) in die Schwanzvene injizieren, 100 μl pro Maus.
- Legen Sie die Mäuse unter die Infrarot-Physiotherapielampe, bis sie wieder normal aktiv sind.
- Beobachte und zeichne das Überleben von Mäusen 10 Tage lang alle 12 Stunden auf.
- Euthanasieren Sie die Mäuse, die den Angriff überlebt haben, durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital.
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Representative Results
Das Protokoll für die Herstellung des Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs und In-vitro- und In-vivo-Tests dieses Impfstoffs wurde evaluiert. TEM, AFM und DLS wurden verwendet, um die wichtigen Eigenschaften des Zetapotenzials und der Partikelgröße auf der Oberfläche dieser Probe zu bestimmen (Abbildung 1). SDS-PAGE und Western Blot zeigten, dass die Menge des Antigens im Niederschlag und Überstand nach der Zentrifugation nicht signifikant abnahm, was darauf hindeutete, dass der Impfstoff strukturell intakt, spezifisch und immunogen war (Abbildung 2). Der Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoff erhöhte die Gesamttiter der IgG-, IgG1- und IgG2a-Antikörper signifikant. Die Immunogenität des Impfstoffs wurde signifikant verbessert (Abbildung 3A-C). Die Serum-IgG2b-OD-Werte bei 450 nm der Antigengruppe waren am höchsten (verdünnt bei 1:500 PBS) (Abbildung 3D). Das tödliche MRSA252 Mausmodell spiegelte am deutlichsten wider, dass der Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoff eine gute Schutzwirkung zeigte und eine bakterielle Infektion mit MRSA252 wirksam hemmte, was die Überlebensrate infizierter Mäuse verbesserte (Abbildung 4).
Abbildung 1: Physikalische Eigenschaften des neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs . (A) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme. (B) Rasterkraftmikroskopie-Mikroskopie. (C) Größe, Durchmesser und Verteilung. (D) Zeta-Potential und -Verteilung. Die Abbildung stammt aus Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Ursprünglich veröffentlicht und mit Genehmigung von Dove Medical Press Ltd. verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Physikalische Stabilität des neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs . (A) Strukturelle Integrität der antigenen Proteine. (B) Strukturelle Spezifität des Antigenproteins. Spur 3: leerer, mit Nanoemulsion behandelter Überstand; Spur 4: Ausfällung einer leeren Nanoemulsionsbehandlung; Spur 5: vorgefärbte Markierung; Bahn 6: Impfstoffüberstand; Spur 7: Niederschlag des Impfstoffs; Bahn 8: Überstand der Impfstoffbehandlung; Spur 9: Ausschlag der Impfbehandlung; Bahn 10: nativer Proteinwirkstoff; (A) und (B) gemischter Begriff. Klar definierte Proteinkanäle sind durch schwarze Quadrate gekennzeichnet. Schwarze Pfeile weisen auf antigene Proteine hin. Die Abbildung stammt aus Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Ursprünglich veröffentlicht und verwendet mit Genehmigung von Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: IgG- und seine Untergruppen-Antikörperspiegel nach intramuskulärer Injektion mit dem Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoff. (A)Log-2-Wert der IgG-Titer. (B) 450 nm optische Dichte von Serum-IgG1. (C) 450 nm optische Dichte von Serum-IgG2a. (D) 450 nm optische Dichte des Serums IgG2b. Die Abbildung stammt aus Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Ursprünglich veröffentlicht und mit Genehmigung von Dove Medical Press Ltd. verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Schutzwirkung im letalen Modell der MRSA252 bakteriellen Infektion. Die Überlebensrate von Mäusen als Reaktion auf eine systemische MRSA-Infektion. Die Abbildung stammt aus Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Ursprünglich veröffentlicht und mit Genehmigung von Dove Medical Press Ltd. verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: ELISA-Spiking-Sequenz und Verdünnungsvorbild. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
IsdB, ein bakterielles, zellwandverankertes und eisenreguliertes Oberflächenprotein, spielt eine wichtige Rolle bei der Gewinnung von Hämeisen15. Hla, Alpha-Toxin, gehört zu den wirksamsten bakteriellen Toxinen, die bei MRSA bekannt sind, und kann Poren in eukaryotischen Zellen bilden und Adhäsions- und Epithelzellen stören16. In unserer Arbeit wurde ein neuartiges Rekombinations-MRSA-Antigen-Protein (HI) konstruiert und gentechnisch auf Basis der Antigengene von IsdB und Hla exprimiert. Anschließend wurde ein Nanoemulsionsimpfstoff nach der Niederenergie-Emulgiermethode entwickelt und die Stabilität und Wirksamkeit dieses Impfstoffs bewertet. Beispielsweise werden einige Eigenschaften, wie Langzeitstabilität, Struktur, Form, Absorption und Wirkung in vivo, stark von der Größe des Emulsionströpfchens7 beeinflusst. Die Ergebnisse zeigten, dass die Partikelgröße ein wichtiger Faktor ist, der den Transport von Nanoemulsionen in vivo und deren Phagozytose durch antigenpräsentierende Zellen beeinflusst17. In Bezug auf die Zytophagozytose werden Nanopartikel, die kleiner als 1 μm sind, leichter von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen phagozytiert und stimulieren am ehesten die systemische Immunität18.
Was den Partikeltransport betrifft, so werden Nanopartikel, die kleiner als 100 nm sind, eher durch Lymphgefäße übertragen, um die Immunwirkung zu verstärken. Kleine Nanopartikel dringen jedoch in Blutgefäße ein, während große Nanopartikel ihre Transportgeschwindigkeit in Lymphgefäßen verlangsamen19. Somit liegt die optimale Partikelgröße im Bereich von 20-50 nm. Daher ist es wichtig, die physikalischen Eigenschaften von Nanopartikeln zu untersuchen, einschließlich Form, Größe und Zetapotenzial. TEM ist mit seiner hohen Präzision zu einem wichtigen und grundlegenden Werkzeug geworden, um die Eigenschaften von adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffen zu verstehen. Darüber hinaus wird die Technologie seit einigen Jahren in vielen Bereichen eingesetzt. Ein weiteres nanomechanisches Charakterisierungswerkzeug mit hochauflösenden 3D- und nanoskaligen Informationen, AFM, wurde ebenfalls verwendet, um den Nanoemulsionsimpfstoff13 zu evaluieren. Wichtig ist, dass DLS, das gleichzeitig sowohl die Größe als auch die Ladung20 anzeigt, wichtige Informationen liefern kann, wie z. B. den Aggregationszustand von Nanoemulsions-Impfstoffpartikeln in Lösung. Laut Literatur ist ein hoher Zetapotentialwert für die physikalische und chemische Stabilität kolloidaler Suspensionen unabdingbar, da eine große Abstoßungskraft oft eine Aggregation verhindert, die durch gelegentliche Kollisionen mit benachbarten Nanopartikeln verursacht wird. Daher haben wir in unserer Forschung diese Schemata aufgebaut und ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften mit TEM, AFM und DLS bewertet.
Proteinimpfstoffe spielen eine wichtige Rolle bei der Prävention und Behandlung schwerer Infektionskrankheiten21. Proteinimpfstoffe haben sich in den letzten Jahren rasant entwickelt, aber es gibt nach wie vor ernsthafte Herausforderungen bei der Wirksamkeit und Persistenz des Immunsystems. Die Hauptgründe dafür sind eine schlechte Proteinstabilität, ein kleiner Verteilungskoeffizient, eine kurze biologische Halbwertszeit der Antigene und hohe Clearanceraten in vivo22. In diesem Protokoll wurde die Stabilität des neuartigen Nanoemulsionsimpfstoffs bewertet, und es wurde kein Antigenabbau durch SDS-PAGE oder Western Blot beobachtet.
Ein sicherer, wirksamer und marktfähiger Proteinimpfstoff muss durch ein geeignetes Immunadjuvans ergänzt werden, um die Immunogenität des Proteinantigens und die Art der schützenden Immunantwort signifikant zu verbessern20 , um den optimalen Immunschutz des Impfstoffs zu erhalten. Der durch einen Proteinimpfstoff stimulierte Antikörperspiegel gehört zu den wichtigen Indikatoren für die effektive Prävention und Behandlung von Infektionen, und der Antikörpertiter ist ein wichtiger Index, um zu beurteilen, ob das neuartige Nanoemulsions-Adjuvans die Immunogenität des nackten Antigens verbessern kann. Neuartige Immunadjuvantien können den Körper erheblich stimulieren, um die humorale und zelluläre Immunantwort zu verbessern, und die Anreicherung der Arten der Immunantwort und der immunschützenden Wirksamkeit von Impfstoffen ist eine wichtige Entwicklungsrichtung und Bestandteil der zukünftigen Forschung und der Entwicklung neuartiger Impfstoffe23. Daher wurden in diesem Protokoll Antikörpertiter von Mausserum-spezifischem IgG, IgG1, IgG2a und IgG2b mit dem neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoff nachgewiesen. Das letale Mausmodell24 ist der Goldstandard für die Bewertung von Impfstoffen, und in unserem Protokoll wurde ein tödliches MRSA252 Mausmodell verwendet, um die Schutzwirkung zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass der neuartige Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoff die Überlebensrate von mit MRSA infizierten Balb/c-Mäusen effektiv verbesserte.
Dieses Protokoll ist für die Stabilitätsbewertung von Nanoemulsionsimpfstoffen nicht ausreichend. Der Zirkulardichroismus ist eine geeignete Methode, wenn es gelingt, die räumliche Struktur von Impfstoffproteinen auf einfache und schnelle Weise zu detektieren. Obwohl die Überlebensrate der Mäuse, die durch den Angriff getestet wurden, der Goldstandard für die Bewertung des In-vivo-Tests und der Wirksamkeit des Impfstoffs ist, wäre es überzeugender, wenn das Ausmaß der bakteriellen Besiedlung der Organe von Mäusen nach dem Angriff gemessen werden könnte. Daher gibt es noch einige Unzulänglichkeiten im vorliegenden Protokoll zur Bewertung der Immunantwort des Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs, und das obige Experiment muss in nachfolgenden relevanten Experimenten zur Bewertung ergänzt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es notwendig ist, eine Reihe von Bewertungen der physikalischen Eigenschaften, der Stabilität, der spezifischen Immunantwort und des Challenge-Schutzes zu erstellen. Die Vervollständigung dieser Programme wird wichtige experimentelle Grundlagen für die Anwendung und Entwicklung neuartiger Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffe liefern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dieser Arbeit haben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von Nr. 2021YFC2302603 des National Key Research and Development Program of China, No. 32070924 und 32000651 des NSFC und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
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