Summary
Denne protokol forbereder og evaluerer de fysiske egenskaber, immunrespons og in vivo beskyttende virkning af en ny nanoemulsionsadjuvansvaccine.
Abstract
Nanoemulsionsadjuvansvacciner har tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af deres lille partikelstørrelse, høj termisk stabilitet og evne til at fremkalde gyldigt immunrespons. Imidlertid er etablering af en række omfattende protokoller til evaluering af immunresponset af en ny nanoemulsionsadjuvansvaccine afgørende. Derfor indeholder denne artikel en streng procedure til bestemmelse af en vaccines fysisk-kemiske egenskaber (ved transmissionselektronmikroskopi [TEM], atomkraftmikroskopi [AFM] og dynamisk lysspredning [DLS]), stabiliteten af vaccineantigenet og systemet (ved en højhastighedscentrifugetest, en termodynamisk stabilitetstest, SDS-PAGE og western blot) og det specifikke immunrespons (IgG1, IgG2a og IgG2b). Ved hjælp af denne tilgang kan forskere nøjagtigt evaluere den beskyttende virkning af en ny nanoemulsionsadjuvansvaccine i en dødelig MRSA252 musemodel. Med disse protokoller kan den mest lovende nanoemulsionsvaccineadjuvans med hensyn til effektivt adjuvanspotentiale identificeres. Derudover kan metoderne hjælpe med at optimere nye vacciner til fremtidig udvikling.
Introduction
Methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) er et opportunistisk patogen med en af de højeste infektionsrater på en intensivafdeling (ICU) afdeling1, kardiologiske afdelinger og brandsårsafdelinger over hele verden. MRSA udviser høje infektionsrater, dødelighed og bred lægemiddelresistens, hvilket giver store vanskeligheder ved klinisk behandling2. På den globale prioritetsliste over antibiotikaresistente bakterier, der blev frigivet af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) i 2017, blev MRSA opført i den mest kritiske kategori3. Der er derfor et presserende behov for en vaccine mod MRSA-infektion.
Aluminiumadjuvans er blevet brugt i lang tid, og adjuvanshjælpemekanismen er relativt klar, sikker, effektiv og godt tolereret4. Aluminium adjuvanser er i øjeblikket en meget anvendt type adjuvans. Det antages generelt, at antigener adsorberet på aluminiumsaltpartikler kan forbedre stabiliteten og forbedre injektionsstedets evne til at optage antigener, hvilket giver god absorption og langsom frigivelse5. I øjeblikket er den største ulempe ved aluminiumadjuvanser, at de mangler en adjuvansvirkning eller kun udviser en svag adjuvansvirkning på nogle vaccinekandidatantigener6. Derudover inducerer aluminiumadjuvanser IgE-medierede overfølsomhedsreaktioner5. Derfor er det nødvendigt at udvikle nye adjuvanser for at stimulere et stærkere immunrespons.
Nanoemulsionsadjuvanser er kolloide dispersionssystemer sammensat af olie, vand, overfladeaktive stoffer og cosuraktive stoffer7. Derudover er adjuvanserne termodynamisk stabile og isotrope, kan autoklaveres eller stabiliseres ved højhastighedscentrifugering og kan dannes spontant under milde præparationsbetingelser. Flere emulsionsadjuvanser (såsom MF59, NB001-002-serien, AS01-04-serien osv.) er i øjeblikket på markedet eller i klinisk forskningsfase, men deres partikelstørrelser er større end 160 nm8. Derfor kan fordelene ved lægemidler i nanoskala (1-100 nm) (dvs. stort specifikt overfladeareal, lille partikelstørrelse, overfladeeffekt, høj overfladeenergi, lille størrelseseffekt og makrokvantetunneleffekt) ikke udnyttes fuldt ud. I denne protokol er det rapporteret, at en ny adjuvans baseret på nanoemulsionsteknologi med en diameterstørrelse på 1-100 nm udviser god adjuvansaktivitet9. Vi testede rekombinationsunderenheden vaccine antigenprotein HI (α-hæmolysinmutant [Hla] og Fe ion overflade bestemmelse faktor B [IsdB] underenhed N2 aktivt fragmentfusionsprotein); En række procedurer blev etableret for at undersøge de fysiske egenskaber og stabilitet, evaluere dets specifikke antistofrespons efter intramuskulær administration og teste vaccinens beskyttende virkning ved hjælp af en musesystemisk infektionsmodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøgene blev udført på baggrund af manualen om brug og pleje af forsøgsdyr og blev godkendt af laboratoriedyrs velfærd og etiske komité ved det tredje militære medicinske universitet. Hunmus med Balb/c, 6-8 uger gamle, blev anvendt til nærværende undersøgelse. Dyrene blev hentet fra kommercielle kilder (se materialetabel).
1. Fremstilling af MRSA HI antigenproteinet
- Få IsdB- og Hla-kloner fra kommercielle kilder (se materialetabel), udfør polymerasekædereaktion (PCR) amplifikation for at amplificere IsdB- og Hla-gener og ligere deres produkter til PGEX-6P-2-plasmidet (opnået kommercielt; se materialetabel). Skærm med vektoren Xl/blå stamme af Escherichia coli10.
- Omdan den positive klon til E. coli BL21 kompetente celler (se materialetabel) og forstærk med hajkultur10.
- Antigenet udtrykkes, og isolatet udtrykkes og isolat efter induktion med isolatsæt af isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranosid og multimodal kromatografi (MMC)11 (se materialetabellen).
- Karakteriser antigenproteinet og rens det med en fuldautomatiseringsrenser11.
- Affinitets-rense gutathion S-transferase (GST)-mærkede proteiner fra clearede lysater ved hjælp af en kommercielt tilgængelig affinitetskromatografiharpiks (se materialetabel).
- De rekombinante proteiner renses med MMC11.
- Fjern endotoksinet ved Triton X-114 faseseparationsmetode11. Kort fortalt blandes 1% Triton X-114 med rekombinant proteineluat ved 0 °C i 5 minutter for at sikre en homogen opløsning og inkuberes ved 37 °C i 5 minutter for at tillade dannelse af to faser.
- Brug bakteriel endotoksin testmetode11 med skildpaddesæt (se tabel over materialer) til at detektere endotoksinkoncentrationen. Endotoksinet for proteinantigen er 0,06 EU/μg, lavere end den internationale standard (1,5 EU/μg)10.
- Der udføres en interferenstest for at eliminere testproduktets mulige indflydelse på detektion af endotoksin11.
BEMÆRK: I henhold til tillægget 2020 til kinesisk farmakopé12 skal endotoksinindholdet være mindre end 5 EU / dosis. Limuluslysats følsomhed (λ0,25 EU/ml) og det maksimale effektive fortyndingsforhold på 33,3 blev beregnet12 baseret på MVD = cL/λ, hvor L er grænseværdien for bakterielt endotoksin for testartiklen, c er koncentrationen af testartikelopløsningen, og når L udtrykkes i EU/m, er c lig med 1,0 mg/ml. λ er den mærkede følsomhed (EU / ml) af hesteskokrabbereagenset i gelmetoden.
- Der udføres en interferenstest for at eliminere testproduktets mulige indflydelse på detektion af endotoksin11.
- Antigenet (48 kDa, bestemt ved 12 % natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese [SDS-PAGE]) rekombineres ved 1,5 mg/ml i sterilt vand uden endotoksin eller fosfatbufret saltvand (PBS) (natriumdichloratmetode)11.
BEMÆRK: Proteinspidstiden var 13,843 min, renheden var 99,4% (højtydende væskekromatografimetode), og proteinet blev opbevaret ved -70 °C10. Genomisk DNA ekstraheret fra S. aureus-stamme MRSA252 (se materialetabel) blev brugt som PCR-skabelon. IsdB-genet blev amplificeret ved hjælp af den fremadrettede primer 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 og den omvendte primer 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTATATTCTTC-39. Hla-genet blev amplificeret ved hjælp af den fremadrettede primer PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) og den omvendte primer PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC).
2. Fremstilling af nanoemulsionsvaccinen
- I henhold til masseforholdet på 1:6:3 (w/w) tilsættes tre slags hjælpestoffer i rækkefølge (isopropylmyristat, polyoxyethylenricinusolie og propylenglycol; se materialetabel) til HI-antigenproteinopløsningen (10 mg/ml) og omrøres godt. Derefter tilsættes gradvist steriliseret rent vand for at nå et endeligt volumen på 10 ml og omrøres ved 500 rpm og 25 °C i ca. 20 min.
BEMÆRK: Nanoemulsionen fremstillet i denne protokol har et volumen på 10 ml, og masserne af de tre hjælpestoffer er henholdsvis 0,34 g, 2 g og 1 g. Proteinopløsningen her er arbejdsløsningen, 10 gange koncentrationen af den endelige opløsning. - Forbered nanoemulsionsadjuvansvaccinen (1 mg / ml protein) ved lavenergiemulgeringsmetoder13 for at opnå en klar og gennemsigtig flydende opløsning.
BEMÆRK: Den tomme nanoemulsion (BNE) blev fremstillet ved lignende metoder, bortset fra at vand blev erstattet med HI. Den sædvanlige emulgeringsmetode indebærer opvarmning af de ydre og indre faser til ca. 80 °C med henblik på emulgering og derefter omrøring og afkøling gradvist. I denne proces forbruges en stor mængde energi, og endelig opnås emulsionen.
3. Fysisk karakterisering og stabilitet af nanoemulsionsadjuvansvaccinen
- Partikelstørrelse, zetapotentiale og karakterisering af polymerdispersionsindeks (PDI).
- Der fremstilles 100 μL nanoemulsionsadjuvansvaccine, og fortyndes 50 gange med vand til injektion. Tilsæt 2 ml prøve til detektion.
- Overhold partikelstørrelser, zetapotentiale og PDI ved 25 °C ved hjælp af en Nano Zetasizer (ZS; se materialetabel).
- Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Fortynd 10 μL nanoemulsionsvaccine 50 gange med vand, læg den på et kulstofbelagt kobbergitter med 100 masker, og pletter med 1% phosphowolframsyre (se materialetabellen) i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern overskydende phosphowolframsyreopløsning med filterpapir.
- Overhold morfologien under et transmissionselektronmikroskop (se materialetabel). Undersøg, om de færdige produkter er næsten stabile og cirkulære inden for elektronmikroskopets synsfelt, og om de udviser god spredning.
- Scanning elektronmikroskopi (SEM)
- 10 μL af nanoemulsionsadjuvansvaccinen fortyndes 50 gange med vand, 10 μL forfortyndede prøver dryppes på en siliciumskive, og anbringes i en 37 °C termostatstyret inkubator i 24 timer.
- Sprøjt det tilberedte platin på silicium i 40 s og afkøles til stuetemperatur.
- Overhold de morfologiske egenskaber af de forberedte prøver under et scanningelektronmikroskop med høj opløsning (se materialetabel). Bestem, om prøverne er næsten stabile, sfæriske og godt spredt inden for synsfeltet under elektronmikroskopet.
- Morfologisk stabilitet
- Anbring 1 ml nanoemulsionsvaccineprøver i mikrocentrifugerør, og evaluer stabiliteten af friske prøver ved centrifugering i 30 minutter ved 13.000 x g ved stuetemperatur (25 °).
- Disse friske prøver ser ud, og udfør derefter en termodynamisk stabilitetstest af seks temperaturcyklusser (en cyklus: opbevares ved 4 °C i 48 timer, 25 °C i 48 timer og 37 °C i 48 timer).
- Efter centrifugering henstår prøverne i 15 minutter for at bestemme, om der er en Tyndall-effekt (om prøven er klar og gennemsigtig under lys), og om der er foretaget demulgering (vist ved tydelig lagdeling efter demulgering).
- SDS-PAGE og western blot
- Prøverne rystes, blandes en opløsning af 0,6 ml absolut ethanol og 0,3 ml vaccine, og centrifugeres (13.000 x g, 30 minutter ved stuetemperatur, 25 °C).
- Opløsningens supernatant overføres til et rent glas og bundfaldet opløses med 0,3 ml vand. Supernatant- og bundfaldsopløsningerne (både blind nanoemulsion og vaccine) udtages efter behandling med absolut ethanol og destilleret vandopløsning, og der udføres samme 50 gange fortynding.
- Bland 2,5 ml separationsgel A og 2,5 ml separationsgel B (se materialetabel), tilsæt 50 μL 10% ammoniumpersulfat, og anbring hurtigt opløsningen i glaspladen med en pipette. Bland 1 ml koncentreret gel A og 1 ml koncentreret gel B, tilsæt 20 μL 10% ammoniumpersulfat i glaspladen, indsæt en kam af passende størrelse, og vent på størkning.
- Der tilsættes i alt 5 μL 5x proteinpåfyldningsbufferopløsning til den fortyndede prøve opnået i trin 3.5.2, og prøven koges i 5 min.
- Tilsæt 10 μL opvarmet protein til det tilsvarende hul, og tilsæt 5 μL proteinmarkør til markørbrønden.
- Tilslut elektroden, tænd elektroforesemåleren (se materialetabellen), og juster spændingen til 300 V. Sluk for strømmen, når elektroforesen når 1 cm væk fra bunden af PAGE-gummiet.
- Fjern gelen og skyl med ddH2O. Tilsæt Coomassie lyseblå G-250 farvningsopløsning (se materialetabel) i 10 minutter. Hæld farvningsopløsningen ud, og skyl gelen to gange med ddH2O.
- Tilsæt den kommercielt tilgængelige affarvningsopløsning og mikrobølge gelen i 1 min. Ryst gelen i 10 min, og skift affarvningsopløsningen gentagne gange, indtil gelens baggrund er klar. Udfør derefter gelbilleddannelse (se materialetabel).
BEMÆRK: Western blot blev forbehandlet som beskrevet i trin 3.5.1-3.5.6. - Sug tre filterpapirblokke i blød med en elektroforeseoverførselsbuffer. Blødgør polyvinylidenfluorid (PVDF) membranen i methanol i 30 s og overfør med et halvtørt geloverførselsinstrument (to lag filterpapir, PVDF-membran, elektroforesegel og et lag filterpapir). Brug en spænding på 23 V til at overføre membranen i 23 min.
- Fjern PVDF-membranen og vask en gang med tris-bufret saltvand-Tween 20 (TBST) efter overførsel.
- PVDF-membranen anbringes i tætningsopløsning (5 % skummetmælkspulveropløsning) og forsegles natten over ved 4 °C.
- Fjern PVDF-membranen og vask tre gange med TBST eller 10 min hver.
- Inkuber med det primære antistof (fra immuniserede mus med positivt serum). Det primære antistof11 (se materialetabellen) fortyndes 500 gange (100 gange) med TBST. Den blokerede PVDF-membran anbringes i det primære antistof og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Fjern PVDF-membranen og vask tre gange med TBST i 10 minutter hver.
- Inkuber med det sekundære antistof (se materialetabel). Fortyndet alkalisk fosfatase (AP)-mærket ged anti-mus sekundært antistof 5.000 gange med TBST. PVDF-membranen anbringes i det sekundære antistof og inkuberes ved 37 °C i 40 minutter.
- Fjern PVDF-membranen og vask fire gange med TBST i 10 minutter hver.
- Nedsænk PVDF-membranerne i en blanding (lige nok til at suge membranen) af AP-substratet nitroblå tetrazol (NBT) og BCIP (5-brom-4-chlor-3'-indolyphosphat p-toluidinsalt) (se materialetabel) til farvning. Et positivt resultat er lilla.
BEMÆRK: Resultaterne skal være et klart lilla bånd, og prøvestrimlen og antigenets molekylvægt skal være i samme mærkede position.
4. Vurdering af antistofimmunrespons på denne vaccine efter intramuskulær administration
BEMÆRK: Musene blev immuniseret ved intramuskulær injektion af nanoemulsionsvaccinen efter en offentliggjort rapport11. Musene fik PBS som en negativ kontrol. 1 uge efter tre vaccinationer var afsluttet, blev serum indsamlet fra musene11. Serumniveauerne af IgG og underklasserne af IgG1, IgG2a og IgG2b blev kvantitativt bestemt ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA).
- Antigenbelægning: Hi-proteinantigen fortyndes til 10 μg/ml med coatingopløsning, og der tilsættes ELISA-pladen ved 100 μL/hul. Der inkuberes ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Belægningsopløsningen fremstilles ved at opløse 1,6 g vandfrit natriumcarbonat og 2,9 g natriumbicarbonat i 1 liter deioniseret vand. - Forsegling: Pladen vaskes (tre cyklusser, hver cyklus 300 μL). Der tilsættes 300 μL af tætningsopløsningen til hvert hul, og hullerne forsegles i 2 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Forseglingsopløsningen fremstilles ved tilsætning af Tween-20 og bovin serumalbumin (BSA) til PBS. Indholdet af BSA i PBST-opløsningen er 1%. - Serumfortynding: Prøveserummet fra mus fortyndes 100 gange med PBST (der udtages 3 μL serum og tilsættes til 297 μL PBST og hvirvel), og der anvendes 100 μL til hver serumprøve. Det positive serum og det negative kontrolserum fortyndes 100 gange med PBST ved at tilsætte 4 μL til 396 μL PBST og derefter blandes ved hvirvelstrøm.
- Fortynding med dobbelt forhold: Der tilsættes 200 μL af ovennævnte fortyndede forsøgsserum til første række af den coatede ELISA-plade, og der tilsættes 100 μL PBST til alle huller undtagen første og 12. række. Udfør en 1:2 fortynding successivt fra første række: juster pipetten til 100 μL, overfør 100 μL fra første til anden række, og bland med pipetten 10 gange.
- Serumet fortyndes til række 11 i flere forhold, og 100 μl væske kasseres.
- Der tilsættes fortyndet negativt og positivt serum til de tilsvarende huller i række 12 i overensstemmelse med prøveskabelonen (se tabel 1)-100 μL/hul.
- ELISA-pladerne forsegles med plastfolie og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Fortynd sekundært antistof anti-mus IgG-HRP (se materialetabel) med PBST ved 1:10.000.
- Pladen vaskes (tre cyklusser, hver cyklus 300 μL). Derefter tilsættes 100 μL af det fortyndede sekundære antistof til hvert hul, og pladen inkuberes ved 37 °C i 40 minutter.
- Farvning og afslutning: Vask pladen (fem cyklusser, hver cyklus 300 μL). Der tilsættes 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB) farvningsopløsning (100 μL; se materialetabel) til hvert hul. Pladerne anbringes ved 37 °C i 10 minutter væk fra lyset, og reaktionen afsluttes straks med 50 μL 2 MH2SO4.
- Detekter den optiske densitet (OD 450) ved hjælp af en enzymmarkør (aflæs OD450-værdien inden for 15 minutter efter afslutning).
5. Evaluering af in vivo-virkningerne af de nye adjuvansvacciner
BEMÆRK: Den beskyttende virkning af denne nanoemulsionsvaccine blev evalueret i en kommercielt opnået dødelig MRSA252 musemodel (se materialetabel). Ifølge de tidligere resultater fra vores forskningsgruppe 14 er 1 x10 8 kolonidannende enheder (CFU) / mus den bedste dosis til at evaluere den beskyttende virkning af den dødelige model af MRSA252 bakteriel infektion.
- Stammegenvinding: Få et rør frosne MRSA252, pod bakterierne på Mueller Hinton (MH) (A) plader (se materialetabel) ved "trelinjemetoden" og kultur natten over ved 37 ° C. Udfør trinene i "tre-linjemetoden" som nævnt nedenfor:
- Hold podningsringen i højre hånd, cauterize og afkøl den for at opnå en ring af bakteriel væske.
- Hold agarpladen i venstre hånd (hold låget på bordet) over det forreste venstre område af alkohollampens flamme, så pladen vender mod flammen og forhindrer bakterierne i at komme ind i luften. Med højre hånd flyttes podningsringen af inficerede bakterier frem og tilbage på agaroverfladen på en tæt, men ikke-overlappende måde, der dækker et område på ca. 1/5-1/6 af hele pladen, som er den første zone.
BEMÆRK: Poderingen og agaren skal være i let kontakt i en vinkel på 30 ° -40 °; Beskadigelse af agar kan undgås ved at glide med håndledskraft. - Cauterize de overskydende bakterier på podningsringen (om hvert område skal cauterize eller sterilisere afhænger af mængden af bakterier i prøven). Efter afkøling gentages de næstsidste rækker 2-3 i slutningen og tegner et andet område (ca. 1/4 af pladeområdet).
- Når den anden zone er færdig, skal du cauterize ringen og tegne den tredje zone på samme måde for at fylde hele pladen.
- Når linjerne er tegnet, anbringes pladen på skålens låg, mærkes pladen og inkuberes i en inkubator på 37 °C i 18-24 timer for at observere fordelingen af kolonier på agaroverfladen. Fokuser opmærksomheden på, om en enkelt koloni er isoleret, og observer koloniegenskaber (såsom størrelse, form, gennemsigtighed og pigmentering).
- Bakteriel aktivering: Den næste dag skal du tage to 50 ml rystekolber og tilføje 20 ml MH (B) medium (se tabel over materialer) til hver. Vælg to enkelte kolonier med en 10 μL pipettespids, og tilsæt dem til rysteapparaterne. Kolonierne inkuberes natten over ved 220 o/min ved 37 °C.
- Sekundær aktivering: Næste dag tages to 50 ml rystekolber, der hver indeholder 20 ml MH (B) medium. 200 μL bakterieopløsning fjernes fra rysteapparatet med de første aktiverede bakterier, tilsættes til de to nye kolber, der indeholder 20 ml MH (B) medium, og der inkuberes ved 37 °C og 220 rpm i 5 timer.
- Den anden aktiverede bakterieopløsning opsamles i et 50 ml centrifugeglas, der adskilles ved 3.000 x g i 20 minutter, og supernatanten kasseres.
- Resuspender de udfældede bakterier i 40 ml saltvand.
- Mål OD600-værdien af bakterieopløsningen og juster til 1 med saltvand. På dette tidspunkt var bakteriemængden af MRSA252 i vores eksperiment 2 x 109 CFU/ml.
- Bakterieopløsningen fortyndes med en OD600 på 1 til en koncentration på 1 x 109 CFU/ml.
- Del tilfældigt 48 Balb/c-mus i fire grupper (n=12).
BEMÆRK: Gruppe I: PBS-gruppe; Gruppe II: BNE-kontrolgruppe Gruppe III: naiv antigen [protein] gruppe; Gruppe IV: nanoemulsionsadjuverende vaccinegruppe. - Bedøv musene ved intraperitoneal injektion af 100 mg / kg 1% pentobarbitalnatrium.
- Bestråle musene med en infrarød fysioterapilampe (se materialetabel) i ca. 1 minut for at forårsage vasodilatation af halevenen.
- Anvend musene med injektion af den fortyndede bakterieopløsning (trin 5.7) i halevenen, 100 μL pr. mus.
- Placer musene under den infrarøde fysioterapilampe, indtil de kan vende tilbage til normal aktivitet.
- Overhold og registrer musenes overlevelse hver 12. time i 10 dage.
- Aflive musene, der overlevede angrebet ved intraperitoneal injektion af 100 mg / kg 1% natriumpentobarbital.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen til fremstilling af nanoemulsionsadjuvansvaccinen og in vitro- og in vivo-test af denne vaccine blev evalueret. TEM, AFM og DLS blev brugt til at bestemme de vigtige egenskaber ved zetapotentialet og partikelstørrelsen på overfladen af denne prøve (figur 1). SDS-PAGE og western blotting viste, at mængden af antigen i bundfaldet og supernatanten ikke nedbrydes signifikant efter centrifugering, hvilket indikerede, at vaccinen var strukturelt intakt, specifik og immunogen (figur 2). Nanoemulsionsadjuvansvaccinen øgede signifikant de samlede IgG-, IgG1- og IgG 2a-antistoftitere. Vaccinens immunogenicitet blev signifikant forbedret (figur 3A-C). Serum-IgG2b OD-værdierne ved 450 nm af antigengruppen var de højeste (fortyndes ved 1:500 PBS) (figur 3D). Den dødelige MRSA252 musemodel afspejlede mest direkte, at nanoemulsionsadjuvansvaccinen viste en god beskyttende virkning og effektivt hæmmede bakteriel infektion med MRSA252, hvilket forbedrede overlevelsesraten for inficerede mus (figur 4).
Figur 1: Fysiske egenskaber ved den nye nanoemulsionsadjuvansvaccine . (A) Transmissionselektronmikrografi. (B) Atomkraftmikroskopi mikrografi. (C) Størrelse, diameter og fordeling. D) Zeta-potentiale og -fordeling. Figuren er gengivet fra Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Oprindeligt udgivet af og brugt med tilladelse fra Dove Medical Press Ltd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fysisk stabilitet af den nye nanoemulsionsadjuvansvaccine . A) De antigene proteiners strukturelle integritet. B) antigenproteinets strukturelle specificitet. bane 3: blank nanoemulsionsbehandlet supernatant Bane 4: bundfald i blank nanoemulsionsbehandling; Bane 5: forudbestemt markør; Bane 6: vaccinesupernatant Bane 7: vaccinebundfald; Bane 8: supernatant til vaccinebehandling Bane 9: vaccinebehandling udfældes; Bane 10: naturligt proteinmiddel; (A) og (B) blandet udtryk. Klart definerede proteinkanaler er markeret med sorte firkanter. Sorte pile angiver antigene proteiner. Figuren er gengivet fra Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Oprindeligt udgivet af og brugt med tilladelse fra Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: IgG og dets undergruppeantistofniveauer efter intramuskulær injektion med nanoemulsionsadjuvansvaccinen. (A) Log2-værdien af IgG-titerne. B) 450 nm optisk densitet af serum IgG1. C) 450 nm optisk densitet af serum IgG2a. D) 450 nm optisk densitet af serum IgG2b. Figuren er gengivet fra Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Oprindeligt udgivet af og brugt med tilladelse fra Dove Medical Press Ltd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Beskyttende virkning i den dødelige model af MRSA252 bakteriel infektion. Mus' overlevelsesrate som reaktion på systemisk MRSA-infektion. Figuren er gengivet fra Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Oprindeligt udgivet af og brugt med tilladelse fra Dove Medical Press Ltd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: ELISA-spidssekvens og fortyndingsskabelon. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IsdB, et bakterielt cellevægforankret og jernreguleret overfladeprotein, spiller en vigtig rolle i processen med at opnå hæmjern15. Hla, alfa-toksin, er blandt de mest effektive bakterielle toksiner, der er kendt i MRSA, og kan danne porer i eukaryote celler og forstyrre vedhæftning og epitelceller16. I vores undersøgelse blev et nyt rekombinations-MRSA-antigenprotein (HI) konstrueret og udtrykt med genteknologiteknologi baseret på antigengenerne fra IsdB og Hla. Derefter blev en nanoemulsionsvaccine udviklet ved lavenergiemulgeringsmetoden, og stabiliteten og effektiviteten af denne vaccine blev evalueret. For eksempel påvirkes nogle egenskaber, såsom langsigtet stabilitet, struktur, form, absorption og virkning in vivo, stærkt af størrelsen af emulsionsdråben7. Resultaterne viste, at partikelstørrelse var en vigtig faktor, der påvirker transporten af nanoemulsioner in vivo og deres fagocytose af antigenpræsenterende celler17. Med hensyn til cytofagocytose er nanopartikler mindre end 1 μm lettere fagocytoseret af dendritiske celler (DC'er) og makrofager og er mest tilbøjelige til at stimulere systemisk immunitet18.
Med hensyn til partikeltransport er nanopartikler mindre end 100 nm mere tilbøjelige til at blive overført gennem lymfekar for at forbedre immuneffekten; Imidlertid infiltrerer små nanopartikler i blodkarrene, mens store nanopartikler sænker deres transporthastighed i lymfekar19. Således ligger den optimale partikelstørrelse i området 20-50 nm. Derfor er det afgørende at studere nanopartiklernes fysiske egenskaber, herunder form, størrelse og zetapotentiale. TEM er med sin høje præcision blevet et vigtigt og grundlæggende værktøj til forståelse af egenskaberne ved nanoemulsionsadjuvansvacciner. Derudover har teknologien været bredt anvendt på mange områder i flere år. Et andet nanomekanisk karakteriseringsværktøj med 3D og nanoskala højopløsningsinformation, AFM, blev også brugt til at evaluere nanoemulsionsvaccinen13. Det er vigtigt, at DLS, som samtidig afslører både størrelse og ladning20, kan give nøgleoplysninger, såsom aggregeringstilstanden for nanoemulsionsvaccinepartikler i opløsning. Ifølge litteraturen er en høj zeta-potentiel værdi uundværlig for kolloide suspensioners fysiske og kemiske stabilitet, da en stor frastødende kraft ofte forhindrer aggregering forårsaget af lejlighedsvise kollisioner med tilstødende nanopartikler. Derfor oprettede vi i vores forskning disse ordninger og evaluerede deres fysiske og kemiske egenskaber med TEM, AFM og DLS.
Proteinvacciner spiller en vigtig rolle i forebyggelse og behandling af alvorlige infektionssygdomme21. Proteinvacciner har udviklet sig hurtigt i de senere år, men der er stadig alvorlige udfordringer med immuneffektivitet og persistens. De grundlæggende årsager til dette er dårlig proteinstabilitet, lille fordelingskoefficient, kort biologisk halveringstid for antigener og høje clearance i vivo22. I denne protokol blev stabiliteten af den nye nanoemulsionsvaccine evalueret, og der blev ikke observeret antigennedbrydning ved SDS-PAGE eller western blot.
En sikker, effektiv og salgbar proteinvaccine skal suppleres med en passende immunadjuvans for signifikant at forbedre immunogeniciteten af proteinantigenet og typen af beskyttende immunrespons20 for at opnå den optimale vaccineimmunbeskyttelse. Antistofniveauet stimuleret af en proteinvaccine er blandt de vigtige indikatorer for effektiv forebyggelse og behandling af infektion, og antistoftiteren er et vigtigt indeks til evaluering af, om den nye nanoemulsionsadjuvans kan forbedre immunogeniciteten af det nøgne antigen. Nye immunhjælpestoffer kan stimulere kroppen betydeligt til at forbedre de humorale og cellulære immunresponsniveauer, og berigelse af typerne af immunrespons og immunbeskyttende effektivitet af vacciner er en vigtig udviklingsretning og komponenten i fremtidig forskning og udvikling af nye vacciner23. Derfor blev der i denne protokol påvist antistoftitere af museserumspecifik IgG, IgG1, IgG2a og IgG2b med den nye nanoemulsionsadjuvansvaccine. Den dødelige musemodel24 er guldstandarden til evaluering af vacciner, og i vores protokol blev en dødelig MRSA252 musemodel brugt til at evaluere den beskyttende virkning. Resultaterne viste, at den nye nanoemulsionsadjuvansvaccine effektivt forbedrede overlevelsesraten for Balb / c-mus inficeret med MRSA.
Denne protokol er ikke tilstrækkelig til stabilitetsevaluering af nanoemulsionsvacciner. Cirkulær dikroisme er en passende metode, hvis den kan anvendes til at detektere den rumlige struktur af vaccineproteiner i en enkel og hurtig metode. Selvom overlevelsesraten for mus testet ved angrebet er guldstandarden til evaluering af in vivo-testen og effektiviteten af vaccinen, ville det være mere overbevisende, hvis mængden af bakteriel kolonisering af museorganerne efter angreb kunne måles. Derfor er der stadig nogle mangler i den nuværende protokol til evaluering af immunresponset af nanoemulsionsadjuvansvaccinen, og ovennævnte forsøg skal suppleres i efterfølgende relevante forsøg til evaluering.
Afslutningsvis er det nødvendigt at etablere en række evalueringer af fysiske egenskaber, stabilitet, specifikt immunrespons og udfordringsbeskyttelse. Fuldførelsen af disse ordninger vil give afgørende eksperimentelle grundlag for anvendelse og udvikling af nye nanoemulsionsadjuvansvacciner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter i dette arbejde.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af nr. 2021YFC2302603 fra National Key Research and Development Program of China, nr. 32070924 og 32000651 fra NSFC og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 fra Natural Science Foundation Project Program of Chongqing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia. , China Medical Science and Technology Press. Beijing. 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D.
- Saeed, K., et al.
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J.
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
