Summary
Bu protokol, yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının fiziksel özelliklerini, immün yanıtını ve in vivo koruyucu etkisini hazırlar ve değerlendirir.
Abstract
Nanoemülsiyon adjuvan aşıları, küçük partikül boyutları, yüksek termal stabiliteleri ve geçerli bağışıklık tepkilerini indükleme yetenekleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. Bununla birlikte, yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının bağışıklık tepkisini değerlendirmek için bir dizi kapsamlı protokol oluşturmak hayati önem taşımaktadır. Bu nedenle, bu makale bir aşının fizikokimyasal özelliklerini (iletim elektron mikroskobu [TEM], atomik kuvvet mikroskobu [AFM] ve dinamik ışık saçılması [DLS]), aşı antijeninin ve sisteminin stabilitesini (yüksek hızlı santrifüj testi, termodinamik stabilite testi, SDS-PAGE ve batı lekesi ile) ve spesifik bağışıklık tepkisini (IgG1, IgG2a ve IgG2b). Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar ölümcül bir MRSA252 fare modelinde yeni bir nanoemülsiyon adjuvan aşısının koruyucu etkisini doğru bir şekilde değerlendirebilirler. Bu protokollerle, etkili adjuvan potansiyeli açısından en umut verici nanoemülsiyon aşısı adjuvanı belirlenebilir. Ek olarak, yöntemler gelecekteki gelişmeler için yeni aşıların optimize edilmesine yardımcı olabilir.
Introduction
Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), yoğun bakım ünitesi (YBÜ) koğuş1, kardiyoloji bölümleri ve yanık bölümlerinde dünya çapında en yüksek enfeksiyon oranlarından birine sahip fırsatçı bir patojendir. MRSA, yüksek enfeksiyon, mortalite oranları ve geniş ilaç direnci göstermekte ve klinik tedavide büyük zorluklar ortaya koymaktadır2. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından 2017 yılında yayınlanan Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin Küresel Öncelik Listesi'nde MRSA, en kritik kategori3'te yer aldı. Bu nedenle MRSA enfeksiyonuna karşı bir aşıya acilen ihtiyaç vardır.
Alüminyum adjuvan uzun süredir kullanılmaktadır ve adjuvan yardımcı mekanizma nispeten açık, güvenli, etkili ve iyi tolere edilir4. Alüminyum adjuvanlar şu anda yaygın olarak kullanılan bir adjuvan türüdür. Genel olarak, alüminyum tuzu parçacıkları üzerinde adsorbe edilen antijenlerin stabiliteyi artırabileceğine ve enjeksiyon bölgesinin antijenleri alma yeteneğini artırabileceğine, iyi emilim ve yavaş salınım sağlayabileceğine inanılmaktadır5. Şu anda, alüminyum adjuvanların ana dezavantajı, adjuvan bir etkiye sahip olmamaları veya bazı aşı adayıantijenler 6 üzerinde sadece zayıf bir adjuvan etki göstermeleridir. Ek olarak, alüminyum adjuvanlar IgE aracılı aşırı duyarlılık reaksiyonlarını indükler5. Bu nedenle, daha güçlü bir bağışıklık tepkisini uyarmak için yeni adjuvanlar geliştirmek gerekir.
Nanoemülsiyon adjuvanları, yağ, su, yüzey aktif maddeler ve kosürfaktan oluşan kolloidal dispersiyon sistemleridir7. Ek olarak, adjuvanlar termodinamik olarak stabil ve izotropiktir, yüksek hızlı santrifüjleme ile otoklavlanabilir veya stabilize edilebilir ve hafif hazırlık koşulları altında kendiliğinden oluşturulabilir. Birkaç emülsiyon adjuvanı (MF59, NB001-002 serisi, AS01-04 serisi, vb. gibi) şu anda piyasada veya klinik araştırma aşamasındadır, ancak partikül boyutları 160 nm8'den büyüktür. Bu nedenle, nano ölçekli (1-100 nm) tıbbi preparatların avantajları (yani, büyük spesifik yüzey alanı, küçük parçacık boyutu, yüzey etkisi, yüksek yüzey enerjisi, küçük boyut etkisi ve makro kuantum tünelleme etkisi) tam olarak kullanılamaz. Bu protokolde, 1-100 nm çap büyüklüğünde nanoemülsiyon teknolojisine dayanan yeni bir adjuvanın iyi bir adjuvan aktivitesi sergilediği bildirilmiştir9. Rekombinasyon alt birim aşı antijen proteini HI (α-hemolizin mutantı [Hla] ve Fe iyon yüzeyini belirleyen faktör B [IsdB] alt birimi N2 aktif fragman füzyon proteini) test ettik; Fiziksel özellikleri ve stabiliteyi incelemek, intramüsküler uygulamadan sonra spesifik antikor yanıtını değerlendirmek ve bir fare sistemik enfeksiyon modeli kullanarak aşının koruyucu etkisini test etmek için bir dizi prosedür oluşturulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, deney hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili el kitabına dayanarak yürütülmüş ve Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 6-8 haftalık dişi Balb/c fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. MRSA HI antijen proteininin hazırlanması
- IsdB ve Hla klonlarını ticari kaynaklardan elde edin (bakınız Malzeme Tablosu), IsdB ve Hla genlerini yükseltmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu gerçekleştirin ve ürünlerini PGEX-6P-2 plazmidine bağlayın (ticari olarak elde edilir; bakınız Malzeme Tablosu). Escherichia coli10'un Xl/mavi suşu vektörlü ekran.
- Pozitif klonu E. coli BL21 yetkin hücrelerine dönüştürün ( bakınız Malzeme Tablosu) ve köpekbalığı kültürü10 ile güçlendirin.
- Antijeni eksprese edin ve indüksiyondan sonra izopropil-β-D-1-merkaptogalaktopiranosid ve multimodal kromatografi (MMC) izolatı kitleri11 ile izole edin (bkz.
- Antijen proteinini karakterize edin ve tam otomasyonlu bir arıtıcı11 ile saflaştırın.
- Afinite-saflaştırma gutation S-transferaz (GST) etiketli proteinler, ticari olarak temin edilebilen bir afinite kromatografi reçinesi kullanılarak temizlenmiş lizatlardan (bakınız Malzeme Tablosu).
- Rekombinant proteinleri MMC11 ile saflaştırın.
- Triton X-114 faz ayırma yöntemi11 ile endotoksinin uzaklaştırılması. Kısaca,% 1 Triton X-114'ü rekombinant protein ile karıştırın, homojen bir çözelti sağlamak için 5 dakika boyunca 0 ° C'de elüe edin ve iki fazın oluşmasına izin vermek için 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Endotoksin konsantrasyonunu tespit etmek için bakteriyel endotoksin test yöntemi11'i Kaplumbağa kitleri ile birlikte kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Protein antijeni için endotoksin 0.06 EU/μg'dir ve uluslararası standarttan (1.5 EU/μg)10 daha düşüktür.
- Test ürününün endotoksin tespiti üzerindeki olası etkisini ortadan kaldırmak için bir girişim testi yapın11.
NOT: Çin farmakopesi12'nin Ek 2020'sine göre, endotoksin içeriği 5 AB / dozdan az olmalıdır. Limulus lizatının duyarlılığı (λ0.25 EU/mL) ve maksimum etkili seyreltme oranı 33.3 MVD = cL/λ'ya göre12 hesaplanmıştır, burada L, test makalesi için bakteriyel endotoksinin sınır değeridir, c, test maddesi çözeltisinin konsantrasyonudur ve L, AB / m cinsinden ifade edildiğinde, c 1.0 mg / mL'ye eşittir. λ, jel yönteminde at nalı yengeç reaktifinin etiketli duyarlılığıdır (EU/mL).
- Test ürününün endotoksin tespiti üzerindeki olası etkisini ortadan kaldırmak için bir girişim testi yapın11.
- Antijeni (48 kDa, %12 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi [SDS-PAGE] ile belirlenir) endotoksin veya fosfat tamponlu salin (PBS) içermeyen steril suda 1,5 mg/mL'de yeniden birleştirin (sodyum diklorat yöntemi)11.
NOT: Protein pik süresi 13.843 dakika, saflığı% 99.4 (Yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemi) idi ve protein -70 ° C10'da depolandı. PCR şablonu olarak S. aureus suşu MRSA252 ekstrakte edilen genomik DNA (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. IsdB geni, ileri primer 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG kullanılarak güçlendirildi
C-39 ve ters astar 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. Hla geni, ileri primer PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) ve ters primer PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC).
2. Nanoemülsiyon aşısının hazırlanması
- 1: 6: 3 (w / w) kütle oranına göre, HI antijen protein çözeltisine (10 mg / mL) sırayla üç çeşit yardımcı madde (izopropil miristat, polioksietilen hint yağı ve propilen glikol; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, 10 mL'lik son hacme ulaşmak için kademeli olarak sterilize edilmiş saf su ekleyin ve yaklaşık 20 dakika boyunca 500 rpm ve 25 ° C'de karıştırın.
NOT: Bu protokolde hazırlanan nanoemülsiyon 10 mL'lik bir hacme sahiptir ve üç eksipiyanın kütleleri sırasıyla 0.34 g, 2 g ve 1 g'dır. Buradaki protein çözeltisi, nihai çözeltinin konsantrasyonunun 10 katı olan çalışma çözeltisidir. - Net ve şeffaf bir sıvı çözelti elde etmek için nanoemülsiyon adjuvan aşısını (1 mg / mL proteini) düşük enerjili emülsifikasyon yöntemleri13 ile hazırlayın.
NOT: Boş nanoemülsiyon (BNE), suyun HI ile değiştirilmesi dışında benzer yöntemlerle hazırlanmıştır. Her zamanki emülsifikasyon yöntemi, emülsifikasyon için dış ve iç fazların yaklaşık 80 ° C'ye ısıtılmasını ve daha sonra yavaş yavaş karıştırılmasını ve soğutulmasını içerir. Bu işlemde, büyük miktarda enerji tüketilir ve son olarak emülsiyon elde edilir.
3. Nanoemülsiyon adjuvan aşısının fiziksel karakterizasyonu ve stabilitesi
- Partikül boyutu, zeta potansiyeli ve polimer dispersiyon indeksi karakterizasyonu (PDI).
- 100 μL nanoemülsiyon adjuvan aşısı hazırlayın ve enjeksiyon için 50 kat su ile seyreltin. Algılama için 2 mL numune ekleyin.
- Bir Nano Zetasizer kullanarak partikül boyutlarını, zeta potansiyelini ve PDI'yı 25 ° C'de gözlemleyin (ZS; bkz.
- Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
- 10 μL nanoemülsiyon aşısını 50 kat su ile seyreltin, karbon kaplı 100 ağlı bakır ızgaraya yerleştirin ve% 1 fosfotungstik asit ile lekeleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
- Fazla fosfotungstik asit çözeltisini filtre kağıdı ile çıkarın.
- Bir transmisyon elektron mikroskobu altında morfolojiyi gözlemleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Bitmiş ürünlerin elektron mikroskobunun görüş alanı içinde neredeyse kararlı ve dairesel olup olmadıklarını ve iyi dağılım gösterip göstermediklerini inceleyin.
- Taramalı elektron mikroskobu (SEM)
- 10 μL nanoemülsiyon adjuvan aşısını 50 kat su ile seyreltin, 10 μL önceden seyreltilmiş numuneleri bir silikon gofret üzerine bırakın ve 24 saat boyunca 37 ° C termostat kontrollü bir inkübatöre yerleştirin.
- Hazırlanan platini silikon üzerine 40 s boyunca püskürtün ve oda sıcaklığına soğutun.
- Hazırlanan numunelerin morfolojik özelliklerini yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Numunelerin neredeyse kararlı, küresel ve elektron mikroskobu altında görüş alanı içinde iyi dağılmış olup olmadığını belirleyin.
- Morfolojik stabilite
- 1 mL nanoemülsiyon aşısı numunelerini mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin ve oda sıcaklığında (25 ° C) 13.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj yaparak taze numunelerin stabilitesini değerlendirin.
- Bu taze numunelerin görünümünü gözlemleyin ve ardından altı sıcaklık döngüsünün termodinamik stabilite testini gerçekleştirin (bir döngü: 48 saat boyunca 4 ° C'de, 48 saat boyunca 25 ° C'de ve 48 saat boyunca 37 ° C'de saklayın).
- Santrifüjlemeden sonra, bir Tyndall etkisi olup olmadığını (numunenin ışık altında açık ve şeffaf olup olmadığını) ve emülsifikasyonun gerçekleşip gerçekleşmediğini (emülsifikasyondan sonra net tabakalaşma ile gösterilir) belirlemek için numunelerin 15 dakika beklemesine izin verin.
- SDS-PAGE ve batı lekesi
- Numuneleri çalkalayın, 0,6 mL mutlak etanol ve 0,3 mL aşı çözeltisi ve santrifüj (13.000 x g, oda sıcaklığında 30 dakika, 25 °C) karıştırın.
- Çözeltinin süpernatantını temiz bir tüpe aktarın ve çökeltiyi 0.3 mL su ile çözün. Mutlak etanol ve damıtılmış su çözeltisi ile işlemden sonra süpernatant ve çökelti çözeltilerini (hem boş nanoemülsiyon hem de aşı) elde edin ve aynı 50 kat seyreltmeyi gerçekleştirin.
- 2,5 mL ayırma jeli A ve 2,5 mL ayırma jeli B'yi karıştırın ( Malzeme Tablosuna bakınız), 50 μL% 10 amonyum persülfat ekleyin ve çözeltiyi bir pipetle cam plakaya hızlı bir şekilde yerleştirin. 1 mL konsantre jel A ve 1 mL konsantre jel B'yi karıştırın, cam plakaya 20 μL% 10 amonyum persülfat ekleyin, uygun büyüklükte bir tarak yerleştirin ve katılaşmayı bekleyin.
- Adım 3.5.2'de elde edilen seyreltilmiş numuneye toplam 5 μL 5x protein yükleme tamponu çözeltisi ekleyin ve numuneyi 5 dakika kaynatın.
- İlgili kuyucuğa 10 μL ısıtılmış protein ekleyin ve işaretleyici kuyucuğuna 5 μL protein işaretleyici ekleyin.
- Elektrodu bağlayın, elektroforez ölçeri açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve voltajı 300 V'a ayarlayın. elektroforez PAGE kauçuğunun altından 1 cm uzağa ulaştığında gücü kapatın.
- Jeli çıkarın ve ddH2O ile durulayın. Coomassie parlak mavi G-250 boyama solüsyonunu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) 10 dakika boyunca. Boyama çözeltisini dökün ve jeli ddH2O ile iki kez durulayın.
- Ticari olarak temin edilebilen renk giderme çözeltisini ekleyin ve jeli 1 dakika boyunca mikrodalgada pişirin. Jeli 10 dakika çalkalayın ve jel arka planı temizlenene kadar renk giderme solüsyonunu tekrar tekrar değiştirin. Ardından, jel görüntüleme yapın (bkz.
NOT: Batı lekesi, 3.5.1-3.5.6 adımlarında açıklandığı gibi önceden işlenmiştir. - Üç filtre kağıdı bloğunu bir elektroforez transfer tamponu ile ıslatın. Poliviniliden florür (PVDF) membranını 30 s boyunca metanol içinde bekletin ve yarı kuru jel transfer aleti (iki kat filtre kağıdı, PVDF membran, elektroforez jeli ve bir kat filtre kağıdı) ile aktarın. Membranı 23 dakika boyunca aktarmak için 23 V'luk bir voltaj kullanın.
- PVDF membranını çıkarın ve transferden sonra tris tamponlu salin-Tween 20 (TBST) ile bir kez yıkayın.
- PVDF membranını sızdırmazlık çözeltisine (% 5 yağsız süt tozu çözeltisi) yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de kapatın.
- PVDF membranını çıkarın ve TBST veya her biri 10 dakika ile üç kez yıkayın.
- Birincil antikor ile inkübe edin (pozitif serum ile bağışıklanmış farelerden). TBST ile 500 kat (100 kat) test edilecek birincil antikor11'i ( Malzeme Tablosuna bakınız) seyreltin. Bloke PVDF membranını birincil antikora yerleştirin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- PVDF membranını çıkarın ve her biri 10 dakika boyunca TBST ile üç kez yıkayın.
- İkincil antikor ile inkübe edin (bakınız Malzeme Tablosu). Alkalen fosfataz (AP) etiketli keçi anti-fare ikincil antikorunu TBST ile 5.000 kat seyreltin. PVDF membranını ikincil antikora yerleştirin ve 40 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- PVDF membranını çıkarın ve her biri 10 dakika boyunca TBST ile dört kez yıkayın.
- PVDF membranlarını, boyama için AP substratı nitro mavi tetrazol (NBT) ve BCIP'nin (5-bromo-4-kloro-3'-indolyfosfat p-toluidin tuzu) bir karışımına (membranı ıslatmak için yeterli) batırın (bkz. Olumlu bir sonuç mordur.
NOT: Sonuçlar açık mor bir bant olmalı ve numune şeridi ile antijenin moleküler ağırlığı aynı etiketli konumda olmalıdır.
4. İntramüsküler uygulamadan sonra bu aşıya karşı antikor immün yanıtının değerlendirilmesi
NOT: Fareler, yayınlanan bir rapor11'i takiben nanoemülsiyon aşısının kas içi enjeksiyonu ile aşılanmıştır. Farelere negatif kontrol olarak PBS uygulandı. Üç aşılama tamamlandıktan 1 hafta sonra, farelerden serum toplandı11. Serum IgG düzeyleri ve IgG1, IgG2a ve IgG2b alt sınıfları, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile kantitatif olarak belirlendi.
- Antijen kaplama: HI protein antijenini kaplama çözeltisi ile 10 μg / mL'ye seyreltin ve ELISA plakasına 100 μL / kuyuda ekleyin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
NOT: Kaplama çözeltisi, 1.6 g susuz sodyum karbonat ve 2.9 g sodyum bikarbonatın 1 L deiyonize su içinde çözülmesiyle hazırlanır. - Sızdırmazlık: Plakayı yıkayın (üç döngü, her döngü 300 μL). Her bir kuyucuğa 300 μL sızdırmazlık çözeltisi ekleyin ve kuyucukları 37 ° C'de 2 saat boyunca kapatın.
NOT: Sızdırmazlık çözeltisi, PBS'ye Tween-20 ve sığır serum albümini (BSA) eklenerek hazırlanır. PBST çözeltisindeki BSA içeriği% 1'dir. - Serum seyreltmesi: Farelerin örnek serumunu PBST ile 100 kez seyreltin (3 μL serum alın ve 297 μL PBST ve vortekse ekleyin) ve her serum örneği için 100 μL kullanın. Pozitif serum ve negatif kontrol serumunu PBST ile 396 μL PBST'ye 4 μL ekleyerek 100 kez seyreltin, ardından vorteks ile karıştırın.
- Çift oranlı seyreltme: Kaplanmış ELISA plakasının ilk sırasına yukarıdaki seyreltilmiş deneysel serumun 200 μL'sini ekleyin ve birinci ve 12. sıralar dışındaki tüm kuyucuklara 100 μL PBST ekleyin. İlk sıradan art arda 1:2 seyreltme gerçekleştirin: pipeti 100 μL'ye ayarlayın, ilk sıradan ikinci sıraya 100 μL aktarın ve pipetle 10 kez karıştırın.
- Serumu çoklu oranlarda Satır 11'e seyreltin ve 100 μL sıvıyı atın.
- Örnek şablona göre Satır 12'deki ilgili kuyucuklara seyreltilmiş negatif ve pozitif serum ekleyin (bkz. Tablo 1)-100 μL/kuyu.
- ELISA plakalarını plastik ambalajla kapatın ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
- Sekonder anti-fare anti-fare IgG-HRP'yi (bakınız Malzeme Tablosu) PBST ile 1:10.000'de seyreltin.
- Plakayı yıkayın (üç döngü, her döngü 300 μL). Daha sonra, her bir oyuğa 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve plakayı 40 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Boyama ve sonlandırma: Plakayı yıkayın (beş döngü, her döngü 300 μL). Her bir kuyucuğa 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) boyama çözeltisi (100 μL; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. Plakaları ışıktan 10 dakika uzakta 37 ° C'ye yerleştirin ve ardından reaksiyonu derhal 50 μL 2 M H2SO4 ile sonlandırın.
- Optik yoğunluk (OD 450) değerini bir enzim işaretleyici ile tespit edin (sonlandırmadan sonraki 15 dakika içinde OD450 değerini okuyun).
5. Yeni adjuvan aşıların in vivo etkilerinin değerlendirilmesi
NOT: Bu nanoemülsiyon aşısının koruyucu etkisi, ticari olarak elde edilen ölümcül MRSA252 fare modelinde değerlendirilmiştir (bkz. Araştırma grubumuzunönceki sonuçlarına göre, 1 x 108 koloni oluşturan birim (CFU) / fare, ölümcül MRSA252 bakteriyel enfeksiyon modelinin koruyucu etkisini değerlendirmek için en iyi dozdur.
- Gerinim geri kazanımı: Bir dondurulmuş MRSA252 tüpü elde edin, bakterileri Mueller Hinton (MH) (A) plakalarına (bakınız Malzeme Tablosu) "üç satırlı yöntemle" aşılayın ve 37 ° C'de bir gecede kültürleyin. Aşağıda belirtildiği gibi "üç satırlı yöntem" in adımlarını gerçekleştirin:
- Aşılama halkasını sağ elinizde tutarak, bir bakteri sıvısı halkası elde etmek için koterize edin ve soğutun.
- Agar plakasını sol elinizde tutun (kapağı masanın üzerinde tutarak), alkol lambasının alevinin ön sol alanının üstünde, plaka aleve bakacak ve bakterilerin havaya girmesini önleyecek şekilde tutun. Sağ elinizle, enfekte olmuş bakterilerin aşılama halkasını agar yüzeyinde yoğun fakat örtüşmeyen bir şekilde ileri geri hareket ettirin ve ilk bölge olan tüm plakanın yaklaşık 1/5-1/6'lık bir alanını kaplayın.
NOT: Aşılama halkası ve agar 30°-40° açıyla hafifçe temas halinde olmalıdır; Bilek kuvveti ile kayarak agarın zarar görmesi önlenebilir. - Aşılama halkasındaki fazla bakterileri koterize edin (her bölgenin koterize edilmesi veya sterilize edilmesi, numunedeki bakteri miktarına bağlıdır). Soğuduktan sonra, sondan bir önceki Satır 2-3'ü sonunda tekrarlayın ve ikinci bir alan çizin (plaka alanının yaklaşık 1 / 4'ü).
- İkinci bölge bittikten sonra, halkayı koterize edin ve üçüncü bölgeyi tüm plakayı doldurmak için aynı şekilde çizin.
- Çizgiler çizildikten sonra, plakayı yemeğin kapağına yerleştirin, plakayı işaretleyin ve agar yüzeyindeki kolonilerin dağılımını gözlemlemek için 18-24 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Tek bir koloninin izole edilip edilmediğine dikkat edin ve koloni özelliklerini (boyut, şekil, şeffaflık ve pigmentasyon gibi) gözlemleyin.
- Bakteriyel aktivasyon: Ertesi gün, iki adet 50 mL çalkalayıcı şişesi alın ve her birine 20 mL MH (B) ortamı ekleyin ( bkz. 10 μL pipet ucu olan iki tek koloni seçin ve bunları çalkalayıcılara ekleyin. Kolonileri gece boyunca 220 rpm'de 37 ° C'de inkübe edin.
- İkincil aktivasyon: Ertesi gün, her biri 20 mL MH (B) ortamı içeren iki adet 50 mL çalkalayıcı şişe alın. İlk aktif bakterileri içeren çalkalayıcıdan 200 μL bakteri çözeltisini çıkarın, 20 mL MH (B) ortamı içeren iki yeni şişeye ekleyin ve 5 saat boyunca 37 ° C ve 220 rpm'de inkübe edin.
- İkinci aktif bakteri çözeltisini 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın, 20 dakika boyunca 3.000 x g'de ayırın ve süpernatanı atın.
- Çökelmiş bakterileri 40 mL salin içinde yeniden askıya alın.
- Bakteriyel çözeltinin OD600 değerini ölçün ve salin ile 1'e ayarlayın. Şu anda, deneyimizdeki bakteri MRSA252 miktarı 2 x 109 CFU / mL idi.
- Bakteriyel çözeltiyi OD600 1 ile 1 x 109 CFU / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin.
- 48 Balb/c faresini rastgele dört gruba ayırın (n=12).
NOT: Grup I: PBS grubu; Grup II: BNE kontrol grubu; Grup III: naif antijen [protein] grubu; Grup IV: nanoemülsiyon adjuvan aşı grubu. - Fareleri 100 mg/kg %1 pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun.
- Kuyruk damarının vazodilatasyonuna neden olmak için fareleri yaklaşık 1 dakika boyunca kızılötesi fizyoterapi lambası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile ışınlayın.
- Seyreltilmiş bakteri çözeltisinin (adım 5.7) kuyruk damarına, fare başına 100 μL enjeksiyonu ile farelere meydan okuyun.
- Fareleri normal aktiviteye dönene kadar kızılötesi fizyoterapi lambasının altına yerleştirin.
- 10 gün boyunca her 12 saatte bir farelerin hayatta kalmasını gözlemleyin ve kaydedin.
- Saldırıdan kurtulan fareleri, 100 mg / kg% 1 sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonu ile ötenazi yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nanoemülsiyon adjuvan aşısının hazırlanmasına yönelik protokol ve bu aşının in vitro ve in vivo testleri değerlendirildi. Bu numunenin yüzeyindeki zeta potansiyelinin ve partikül boyutunun önemli özelliklerini belirlemek için TEM, AFM ve DLS kullanılmıştır (Şekil 1). SDS-PAGE ve western blotting, çökelti ve süpernatanttaki antijen miktarının santrifüjlemeden sonra önemli ölçüde bozulmadığını gösterdi, bu da aşının yapısal olarak sağlam, spesifik ve immünojenik olduğunu gösterdi (Şekil 2). Nanoemülsiyon adjuvan aşısı, toplam IgG, IgG1 ve IgG 2a antikor titrelerini önemli ölçüde arttırmıştır. Aşının immünojenitesi önemli ölçüde iyileşti (Şekil 3A-C). Antijen grubunun 450 nm'sinde serum IgG2b OD değerleri en yüksekti (1:500 PBS'de seyreltilir) (Şekil 3D). Ölümcül MRSA252 fare modeli, nanoemülsiyon adjuvan aşısının iyi bir koruyucu etki gösterdiğini ve enfekte olmuş farelerin hayatta kalma oranını artırarak MRSA252 ile bakteriyel enfeksiyonu etkili bir şekilde inhibe ettiğini en doğrudan yansıtmaktadır (Şekil 4).
Şekil 1: Yeni nanoemülsiyon adjuvan aşısının fiziksel özellikleri . (A) İletim elektron mikrografisi. (B) Atomik kuvvet mikroskobu mikrografisi. (C) Boyut, çap ve dağılım. (D) Zeta potansiyeli ve dağılımı. Şekil Sun, HW ve ark. Uluslararası Nanotıp Dergisi'nden çoğaltılmıştır. 10, 7275-7290 (2015)11. İlk olarak Dove Medical Press Ltd. tarafından yayınlanmış ve Dove Medical Press Ltd.'nin izniyle kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Yeni nanoemülsiyon adjuvan aşısının fiziksel stabilitesi . (A) Antijenik proteinlerin yapısal bütünlüğü. (B) Antijen proteininin yapısal özgüllüğü. Şerit 3: boş nanoemülsiyonla işlenmiş süpernatan; Şerit 4: boş nanoemülsiyon işlemi çökelti; Şerit 5: önceden boyanmış işaretleyici; Şerit 6: aşı süpernatan; Şerit 7: aşı çökeltisi; Şerit 8: aşı tedavisi süpernatan; Şerit 9: aşı tedavisi çökelir; Şerit 10: doğal protein ajanı; (A) ve (B) karışık terim. Açıkça tanımlanmış protein kanalları siyah karelerle işaretlenmiştir. Siyah oklar antijenik proteinleri gösterir. Şekil Sun, HW ve ark. Uluslararası Nanotıp Dergisi'nden çoğaltılmıştır. 10, 7275-7290 (2015)11. İlk olarak Dove Medical Press Ltd.Sun et al. tarafından yayınlanmış ve Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nanoemülsiyon adjuvan aşı ile intramüsküler enjeksiyon sonrası IgG ve alt grup antikor seviyeleri . (A) IgG titrelerinin log2 değeri. (B) 450 nm optik yoğunlukta serum IgG1. (C) Serum IgG2a'nın 450 nm optik yoğunluğu. (D) Serum IgG2b'nin 450 nm optik yoğunluğu. Şekil Sun, HW ve ark. Uluslararası Nanotıp Dergisi'nden çoğaltılmıştır. 10, 7275-7290 (2015)11. İlk olarak Dove Medical Press Ltd. tarafından yayınlanmış ve Dove Medical Press Ltd.'nin izniyle kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bakteriyel enfeksiyonun ölümcül modelinde koruyucu MRSA252 . Sistemik MRSA enfeksiyonuna yanıt olarak farelerin sağkalım oranı. Şekil Sun, HW ve ark. Uluslararası Nanotıp Dergisi'nden çoğaltılmıştır. 10, 7275-7290 (2015)11. İlk olarak Dove Medical Press Ltd. tarafından yayınlanmış ve Dove Medical Press Ltd.'nin izniyle kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: ELISA spiking sekansı ve seyreltme şablonu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriyel hücre duvarına bağlı ve demir regüle edilmiş bir yüzey proteini olan IsdB, heme demir15'in elde edilmesi sürecinde önemli bir rol oynar. Hla, alfa toksini, MRSA'da bilinen en etkili bakteriyel toksinler arasındadır ve ökaryotik hücrelerde gözenekler oluşturabilir ve yapışma ve epitel hücrelerine müdahale edebilir16. Çalışmamızda, IsdB ve Hla'nın antijen genlerine dayanan gen mühendisliği teknolojisi ile yeni bir rekombinasyon MRSA antijen proteini (HI) oluşturulmuş ve eksprese edilmiştir. Daha sonra, düşük enerjili emülsifikasyon yöntemi ile bir nanoemülsiyon aşısı geliştirildi ve bu aşının stabilitesi ve etkinliği değerlendirildi. Örneğin, uzun süreli stabilite, yapı, şekil, emilim ve in vivo etki gibi bazı özellikler, emülsiyon damlacığı7'nin boyutundan büyük ölçüde etkilenir. Sonuçlar, partikül boyutunun, nanoemülsiyonların in vivo olarak taşınmasını ve fagositozunu antijen sunan hücreler tarafından etkileyen önemli bir faktör olduğunu göstermiştir17. Sitofagositoz ile ilgili olarak, 1 μm'den küçük nanopartiküller, dendritik hücreler (DC'ler) ve makrofajlar tarafından daha kolay fagositozlanır ve sistemik bağışıklığı uyarma olasılığı en yüksektir18.
Parçacık taşınması ile ilgili olarak, 100 nm'den küçük nanopartiküllerin, bağışıklık etkisini arttırmak için lenfatik damarlardan bulaşma olasılığı daha yüksektir; Bununla birlikte, küçük nanopartiküller kan damarlarına sızarken, büyük nanopartiküller lenfatik damarlarda taşıma hızlarını yavaşlatır19. Böylece, optimum parçacık boyutu 20-50 nm aralığındadır. Bu nedenle, şekil, boyut ve zeta potansiyeli de dahil olmak üzere nanopartiküllerin fiziksel özelliklerini incelemek kritik öneme sahiptir. TEM, yüksek hassasiyeti ile nanoemülsiyon adjuvan aşıların özelliklerini anlamak için önemli ve temel bir araç haline gelmiştir. Ek olarak, teknoloji birkaç yıldır birçok alanda yaygın olarak uygulanmaktadır. 3D ve nano ölçekli yüksek çözünürlüklü bilgiye sahip bir başka nanomekanik karakterizasyon aracı olan AFM de nanoemülsiyon aşısı13'ü değerlendirmek için kullanılmıştır. Daha da önemlisi, aynı anda hem boyutu hem de yük20'yi ortaya çıkaran DLS, nanoemülsiyon aşısı parçacıklarının çözeltideki toplanma durumu gibi önemli bilgiler sağlayabilir. Literatüre göre, kolloidal süspansiyonların fiziksel ve kimyasal stabilitesi için yüksek bir zeta potansiyel değeri vazgeçilmezdir, çünkü büyük bir itici kuvvet genellikle bitişik nanopartiküllerle ara sıra çarpışmaların neden olduğu toplanmayı önler. Bu nedenle araştırmamızda bu şemaları oluşturduk ve fiziksel ve kimyasal özelliklerini TEM, AFM ve DLS ile değerlendirdik.
Protein aşıları başlıca bulaşıcı hastalıkların önlenmesinde ve tedavisinde önemli bir rol oynamaktadır21. Protein aşıları son yıllarda hızla gelişmiştir, ancak bağışıklık etkinliği ve kalıcılığında ciddi zorluklar devam etmektedir. Bunun temel nedenleri zayıf protein stabilitesi, küçük dağılım katsayısı, antijenlerin kısa biyolojik yarı ömrü ve in vivo22'deki yüksek klirens oranlarıdır. Bu protokolde, yeni nanoemülsiyon aşısının stabilitesi değerlendirildi ve SDS-PAGE veya western blot tarafından antijen bozulması gözlenmedi.
Güvenli, etkili ve pazarlanabilir bir protein aşısı, optimal aşı bağışıklık korumasını elde etmek için protein antijeninin immünojenitesini ve koruyucu immün yanıt tipini önemli ölçüde arttırmak için uygun bir immün adjuvan ile desteklenmelidir20 . Bir protein aşısı tarafından uyarılan antikor seviyesi, enfeksiyonun etkili bir şekilde önlenmesi ve tedavisi için önemli göstergeler arasındadır ve antikor titresi, yeni nanoemülsiyon adjuvanının çıplak antijenin immünojenitesini iyileştirip iyileştiremeyeceğini değerlendirmek için önemli bir indekstir. Yeni immün adjuvanlar, humoral ve hücresel immün yanıt seviyelerini arttırmak için vücudu önemli ölçüde uyarabilir ve aşıların immün yanıt tiplerini ve immün koruyucu etkinliğini zenginleştirmek önemli bir gelişme yönüdür ve gelecekteki araştırmaların ve yeni aşıların geliştirilmesinin bileşenidir23. Bu nedenle, bu protokolde, fare serumuna özgü IgG, IgG1, IgG2a ve IgG2b'nin antikor titreleri ile yeni nanoemülsiyon adjuvan aşısı tespit edildi. Ölümcül fare modeli24 , aşıların değerlendirilmesinde altın standarttır ve protokolümüzde, koruyucu etkiyi değerlendirmek için ölümcül bir MRSA252 fare modeli kullanılmıştır. Sonuçlar, yeni nanoemülsiyon adjuvan aşısının, MRSA ile enfekte olmuş Balb / c farelerinin hayatta kalma oranını etkili bir şekilde iyileştirdiğini göstermiştir.
Bu protokol nanoemülsiyon aşılarının stabilite değerlendirmesinde yeterli değildir. Dairesel dikroizm, aşı proteinlerinin mekansal yapısını basit ve hızlı bir yöntemle tespit etmek için uygulanabiliyorsa uygun bir yöntemdir. Saldırı tarafından test edilen farelerin hayatta kalma oranı, in vivo testi ve aşının etkinliğini değerlendirmek için altın standart olmasına rağmen, saldırı sonrası farelerin organlarının bakteriyel kolonizasyon miktarının ölçülebilmesi daha ikna edici olacaktır. Bu nedenle, nanoemülsiyon adjuvan aşısının bağışıklık tepkisini değerlendirmek için mevcut protokolde hala bazı eksiklikler vardır ve yukarıdaki deneyin değerlendirme için sonraki ilgili deneylerde desteklenmesi gerekmektedir.
Sonuç olarak, fiziksel özellikler, stabilite, spesifik immün yanıt ve meydan okuma koruması ile ilgili bir dizi değerlendirme yapmak gereklidir. Bu şemaların tamamlanması, yeni nanoemülsiyon adjuvan aşıların uygulanması ve geliştirilmesi için hayati deneysel temeller sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu çalışmada çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı'nın No. 2021YFC2302603, NSFC'nin No. 32070924 ve 32000651 ve Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Proje Programı'nın No. 2019jcyjA-msxmx0159 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia. , China Medical Science and Technology Press. Beijing. 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D.
- Saeed, K., et al.
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J.
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
