Summary
El presente protocolo prepara y evalúa las propiedades físicas, la respuesta inmune y el efecto protector in vivo de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión.
Abstract
Las vacunas adyuvantes de nanoemulsión han atraído una gran atención debido a su pequeño tamaño de partícula, alta estabilidad térmica y capacidad para inducir respuestas inmunes válidas. Sin embargo, establecer una serie de protocolos integrales para evaluar la respuesta inmune de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión es vital. Por lo tanto, este artículo presenta un procedimiento riguroso para determinar las características fisicoquímicas de una vacuna (por microscopía electrónica de transmisión [TEM], microscopía de fuerza atómica [AFM] y dispersión dinámica de luz [DLS]), la estabilidad del antígeno y el sistema de la vacuna (mediante una prueba de centrífuga de alta velocidad, una prueba de estabilidad termodinámica, SDS-PAGE y western blot), y la respuesta inmune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando este enfoque, los investigadores pueden evaluar con precisión el efecto protector de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión en un modelo letal MRSA252 ratón. Con estos protocolos, se puede identificar el adyuvante de vacuna de nanoemulsión más prometedor en términos de potencial adyuvante efectivo. Además, los métodos pueden ayudar a optimizar nuevas vacunas para el desarrollo futuro.
Introduction
El Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) es un patógeno oportunista con una de las tasas de infección más altas en una unidad de cuidados intensivos (UCI) salas1, departamentos de cardiología y departamentos de quemaduras en todo el mundo. El SARM exhibe altas tasas de infección, mortalidad y amplia resistencia a los medicamentos, presentando grandes dificultades en el tratamiento clínico2. En la Lista de prioridad mundial de bacterias resistentes a los antibióticos publicada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2017, MRSA se incluyó en la categoría3 más crítica. Por lo tanto, se necesita urgentemente una vacuna contra la infección por SARM.
El adyuvante de aluminio se ha utilizado durante mucho tiempo, y el mecanismo auxiliar adyuvante es relativamente claro, seguro, efectivo y bien tolerado4. Los adyuvantes de aluminio son actualmente un tipo de adyuvante ampliamente utilizado. En general, se cree que los antígenos adsorbidos en partículas de sal de aluminio pueden mejorar la estabilidad y mejorar la capacidad del sitio de inyección para absorber antígenos, proporcionando una buena absorción y liberación lenta5. Actualmente, la principal desventaja de los adyuvantes de aluminio es que carecen de un efecto adyuvante o exhiben solo un efecto adyuvante débil en algunos antígenos candidatos a vacuna6. Además, los adyuvantes de aluminio inducen reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE5. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos adyuvantes para estimular una respuesta inmune más fuerte.
Los adyuvantes de nanoemulsión son sistemas de dispersión coloidal compuestos de aceite, agua, tensioactivos y cosurfactantes7. Además, los adyuvantes son termodinámicamente estables e isótropos, pueden ser esterilizados en autoclave o estabilizados por centrifugación de alta velocidad, y pueden formarse espontáneamente en condiciones de preparación suaves. Varios adyuvantes de emulsión (como MF59, NB001-002 series, AS01-04 series, etc.) están actualmente en el mercado o en la etapa de investigación clínica, pero sus tamaños de partícula son superiores a 160 nm8. Por lo tanto, las ventajas de las preparaciones medicinales a nanoescala (1-100 nm) (es decir, área de superficie específica grande, tamaño de partícula pequeño, efecto de superficie, energía superficial alta, efecto de tamaño pequeño y efecto túnel macrocuántico) no pueden explotarse plenamente. En el presente protocolo, se ha informado que un nuevo adyuvante basado en tecnología de nanoemulsión con un tamaño de diámetro de 1-100 nm exhibe una buena actividad adyuvante9. Probamos la proteína HI del antígeno de la vacuna de la subunidad de recombinación (mutante de α-hemolisina [Hla] y la proteína de fusión de fragmentos activos de la subunidad N2 del factor de determinación de la superficie de iones Fe [IsdB]); Se establecieron una serie de procedimientos para examinar las propiedades físicas y la estabilidad, evaluar su respuesta específica de anticuerpos después de la administración intramuscular y probar el efecto protector de la vacuna utilizando un modelo de infección sistémica de ratón.
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Protocol
Los experimentos con animales se realizaron con base en el manual sobre el uso y cuidado de animales de experimentación y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar. Para el presente estudio se utilizaron ratones Balb/c hembra, de 6 a 8 semanas de edad. Los animales fueron obtenidos de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de la proteína antígeno MRSA HI
- Obtener clones de IsdB y Hla de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales), realizar amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los genes IsdB y Hla, y ligar sus productos al plásmido PGEX-6P-2 (obtenido comercialmente; ver Tabla de materiales). Cribado con el vector Xl/cepa azul de Escherichia coli10.
- Transformar el clon positivo en células competentes de E. coli BL21 (ver Tabla de materiales) y amplificar con cultivo de tiburones10.
- Expresar el antígeno y aislar después de la inducción con isopropil-β-D-1-mercaptogalactopiranosido y kits de aislamiento de cromatografía multimodal (MMC)11 (ver Tabla de materiales).
- Caracterizar la proteína antígeno y purificarla con un purificador de automatización completa11.
- Purificar la afinidad de las proteínas marcadas con gutatión S-transferasa (GST) a partir de lisados eliminados utilizando una resina de cromatografía de afinidad disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).
- Purificar las proteínas recombinantes por MMC11.
- Eliminar la endotoxina mediante el método de separación de fases Triton X-11411. Mezclar Triton X-114 al 1% con eluido de proteína recombinante a 0 °C durante 5 min para asegurar una solución homogénea, e incubar a 37 °C durante 5 min para permitir que se formen dos fases.
- Utilice el método de prueba de endotoxinas bacterianas11 con kits de tortugas (consulte la Tabla de materiales) para detectar la concentración de endotoxinas. La endotoxina para el antígeno proteico es de 0,06 EU/μg, inferior al estándar internacional (1,5 EU/μg)10.
- Realizar una prueba de interferencia para eliminar la posible influencia del producto de prueba en la detección de endotoxinas11.
NOTA: De acuerdo con el Apéndice 2020 de la farmacopea china12, el contenido de endotoxinas debe ser inferior a 5 UE/dosis. La sensibilidad del lisado de Limulus (λ0,25 EU/ml) y la relación de dilución efectiva máxima de 33,3 se calcularon12 sobre la base de MVD = cL/λ, donde L es el valor límite de endotoxina bacteriana para el artículo de ensayo, c es la concentración de la solución del artículo de ensayo, y cuando L se expresa en UE/m, c es igual a 1,0 mg/ml. λ es la sensibilidad marcada (EU/mL) del reactivo del cangrejo herradura en el método del gel.
- Realizar una prueba de interferencia para eliminar la posible influencia del producto de prueba en la detección de endotoxinas11.
- Recombinar el antígeno (48 kDa, determinado por electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida al 12% [SDS-PAGE]) a 1,5 mg/ml en agua estéril sin endotoxina ni solución salina tamponada con fosfato (PBS) (método del diclorato de sodio)11.
NOTA: El tiempo pico de proteína fue de 13.843 min, la pureza fue del 99.4% (método de cromatografía líquida de alta resolución) y la proteína se almacenó a -70 °C10. El ADN genómico extraído de la cepa MRSA252 de S. aureus (ver Tabla de materiales) se utilizó como plantilla de PCR. El gen IsdB se amplificó utilizando el cebador directo 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 y el cebador inverso 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. El gen Hla se amplificó utilizando el cebador directo PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) y el cebador inverso PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC).
2. Preparación de la vacuna de nanoemulsión
- De acuerdo con la relación de masa de 1:6:3 (p/p), agregue tres tipos de excipientes en secuencia (miristato de isopropilo, aceite de ricino de polioxietileno y propilenglicol; consulte la Tabla de materiales) a la solución de proteína del antígeno HI (10 mg / ml) y revuelva bien. Luego, agregue agua pura esterilizada gradualmente para alcanzar un volumen final de 10 ml y revuelva a 500 rpm y 25 ° C durante aproximadamente 20 minutos.
NOTA: La nanoemulsión preparada en este protocolo tiene un volumen de 10 mL, y las masas de los tres excipientes son 0,34 g, 2 g y 1 g, respectivamente. La solución de proteína aquí es la solución de trabajo, 10 veces la concentración de la solución final. - Preparar la vacuna adyuvante de nanoemulsión (proteína 1 mg/ml) mediante métodos de emulsificación de baja energía13 para obtener una solución líquida clara y transparente.
NOTA: La nanoemulsión en blanco (BNE) se preparó por métodos similares, excepto que el agua se reemplazó con HI. El método habitual de emulsificación consiste en calentar las fases externa e interna a aproximadamente 80 °C para la emulsificación y luego agitarlas y enfriarlas gradualmente. En este proceso, se consume una gran cantidad de energía y, finalmente, se obtiene la emulsión.
3. Caracterización física y estabilidad de la vacuna adyuvante de nanoemulsión
- Tamaño de partícula, potencial zeta y caracterización del índice de dispersión polimérica (PDI).
- Preparar 100 μL de la vacuna adyuvante de nanoemulsión y diluir 50 veces con agua para inyección. Añadir 2 ml de muestra para su detección.
- Observe los tamaños de partícula, el potencial zeta y el PDI a 25 °C utilizando un nano zetasizer (ZS; ver Tabla de materiales).
- Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
- Diluir 10 μL de vacuna de nanoemulsión 50 veces con agua, colocar en una rejilla de cobre de 100 mallas recubiertas de carbono y teñir con ácido fosfotúngstico al 1% (ver Tabla de materiales) durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire el exceso de solución de ácido fosfotúngstico con papel de filtro.
- Observe la morfología bajo un microscopio electrónico de transmisión (ver Tabla de materiales). Examine si los productos terminados son casi estables y circulares dentro del campo de visión del microscopio electrónico y si exhiben una buena dispersión.
- Microscopía electrónica de barrido (SEM)
- Diluir 10 μL de la vacuna adyuvante de nanoemulsión 50 veces con agua, colocar 10 μL de muestras prediluidas en una oblea de silicio y colocar en una incubadora controlada por termostato a 37 °C durante 24 h.
- Rocíe el platino preparado sobre el silicio durante 40 s y enfríe a temperatura ambiente.
- Observe las propiedades morfológicas de las muestras preparadas bajo un microscopio electrónico de barrido de alta resolución (ver Tabla de materiales). Determine si las muestras son casi estables, esféricas y bien dispersas dentro del campo de visión bajo el microscopio electrónico.
- Estabilidad morfológica
- Colocar 1 ml de muestras de vacunas de nanoemulsión en tubos de microcentrífuga y evaluar la estabilidad de muestras frescas centrifugando durante 30 min a 13.000 x g a temperatura ambiente (25°).
- Observar la apariencia de estas muestras frescas y luego realizar una prueba de estabilidad termodinámica de seis ciclos de temperatura (un ciclo: almacenar a 4 °C durante 48 h, 25 °C durante 48 h y 37 °C durante 48 h).
- Después de la centrifugación, deje reposar las muestras durante 15 minutos para determinar si hay un efecto Tyndall (si la muestra es clara y transparente bajo luz) y si se ha producido demulsificación (mostrada por una estratificación clara después de la demulsificación).
- SDS-PAGE y western blot
- Agitar las muestras, mezclar una solución de 0,6 ml de etanol absoluto y 0,3 ml de vacuna, y centrifugar (13.000 x g, 30 min a temperatura ambiente, 25 °C).
- Transfiera el sobrenadante de la solución a un tubo limpio y disuelva el precipitado con 0,3 ml de agua. Obtenga el sobrenadante y las soluciones precipitadas (tanto nanoemulsión en blanco como vacuna) después del tratamiento con etanol absoluto y solución de agua destilada, y realice la misma dilución de 50 veces.
- Mezcle 2.5 ml de gel de separación A y 2.5 ml de gel de separación B (consulte la Tabla de materiales), agregue 50 μL de persulfato de amonio al 10% y coloque rápidamente la solución en la placa de vidrio con una pipeta. Mezcle 1 ml de gel concentrado A y 1 ml de gel concentrado B, agregue 20 μL de persulfato de amonio al 10% en la placa de vidrio, inserte un peine del tamaño adecuado y espere a que se solidifique.
- Añadir un total de 5 μL de solución tampón de carga proteica 5x a la muestra diluida obtenida en la etapa 3.5.2 y hervir la muestra durante 5 min.
- Agregue 10 μL de proteína calentada al pocillo correspondiente y agregue 5 μL de marcador de proteína al pocillo marcador.
- Conecte el electrodo, encienda el medidor de electroforesis (consulte Tabla de materiales) y ajuste el voltaje a 300 V. Apague la alimentación cuando la electroforesis alcance 1 cm de distancia de la parte inferior de la goma PAGE.
- Retire el gel y enjuague conddH2O. Agregue la solución de tinción azul brillante G-250 de Coomassie (ver Tabla de materiales) durante 10 min. Vierta la solución de tinción y enjuague el gel dos veces conddH2O.
- Agregue la solución de decoloración disponible comercialmente y caliente el gel en el microondas durante 1 minuto. Agite el gel durante 10 minutos y cambie repetidamente la solución de decoloración hasta que el fondo del gel esté claro. Luego, realice imágenes de gel (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: El Western Blot se procesó previamente, como se describe en los pasos 3.5.1-3.5.6. - Remoje tres bloques de papel de filtro con un tampón de transferencia de electroforesis. Remoje la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) en metanol durante 30 s y transfiérala con un instrumento de transferencia de gel semiseco (dos capas de papel de filtro, membrana de PVDF, gel de electroforesis y una capa de papel de filtro). Utilice un voltaje de 23 V para transferir la membrana durante 23 min.
- Retire la membrana de PVDF y lávela una vez con solución salina tamponada con tris 20 (TBST) después de la transferencia.
- Colocar la membrana de PVDF en solución de sellado (solución de leche desnatada en polvo al 5%) y sellar durante la noche a 4 °C.
- Retire la membrana de PVDF y lávese tres veces con TBST o 10 min cada una.
- Incubar con el anticuerpo primario (de ratones inmunizados con suero positivo). Diluir el anticuerpo primario11 (ver Tabla de materiales) para ser probado 500 veces (100 veces) con TBST. Colocar la membrana de PVDF bloqueada en el anticuerpo primario e incubar a 37 °C durante 1 h.
- Retire la membrana de PVDF y lave tres veces con TBST durante 10 minutos cada una.
- Incubar con el anticuerpo secundario (ver Tabla de materiales). Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con fosfatasa alcalina diluida (AP) 5.000 veces con TBST. Colocar la membrana de PVDF en el anticuerpo secundario e incubar a 37 °C durante 40 min.
- Retire la membrana de PVDF y lave cuatro veces con TBST durante 10 minutos cada una.
- Sumergir las membranas de PVDF en una mezcla (lo suficiente para empapar la membrana) del sustrato AP nitro azul tetrazol (NBT) y BCIP (sal de 5-bromo-4-cloro-3'-indolfosfato p-toluidina) (ver Tabla de materiales) para la tinción. Un resultado positivo es púrpura.
NOTA: Los resultados deben ser una banda púrpura clara, y la tira de muestra y el peso molecular del antígeno deben estar en la misma posición etiquetada.
4. Evaluación de la respuesta inmune de anticuerpos a esta vacuna después de la administración intramuscular
NOTA: Los ratones fueron inmunizados por inyección intramuscular de la vacuna de nanoemulsión después de un informe publicado11. A los ratones se les administró PBS como control negativo. A 1 semana después de que se completaron tres inmunizaciones, se recolectó suero de los ratones11. Los niveles séricos de IgG y las subclases de IgG1, IgG2a e IgG2b se determinaron cuantitativamente mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
- Recubrimiento de antígeno: Diluir el antígeno de la proteína HI a 10 μg/ml con solución de recubrimiento y añadir a la placa ELISA a 100 μL/pocillo. Incubar a 4 °C durante la noche.
NOTA: La solución de recubrimiento se prepara disolviendo 1,6 g de carbonato de sodio anhidro y 2,9 g de bicarbonato de sodio en 1 L de agua desionizada. - Sellado: Lavar la placa (tres ciclos, cada ciclo 300 μL). Añadir 300 μL de la solución de sellado a cada pocillo y sellar los pocillos durante 2 h a 37 °C.
NOTA: La solución de sellado se prepara agregando Tween-20 y albúmina sérica bovina (BSA) a PBS. El contenido de BSA en la solución PBST es del 1%. - Dilución del suero: Diluir la muestra de suero de ratones 100 veces con PBST (tomar 3 μL de suero y añadirlo a 297 μL de PBST y vórtice), y utilizar 100 μL para cada muestra de suero. Diluir el suero positivo y el suero de control negativo 100 veces con PBST agregando 4 μL a 396 μL de PBST, luego mezclando por vórtice.
- Dilución de doble relación: Agregue 200 μL del suero experimental diluido anterior a la primera fila de la placa ELISA recubierta y agregue 100 μL de PBST a todos los pocillos excepto a la primera y12ª filas. Realice una dilución 1:2 sucesivamente desde la primera fila: ajuste la pipeta a 100 μL, transfiera 100 μL de la primera fila a la segunda fila y mezcle con la pipeta 10 veces.
- Diluir el suero en la fila 11 en proporciones múltiples y desechar 100 μL de líquido.
- Agregue suero negativo y positivo diluido a los pocillos correspondientes en la fila 12 de acuerdo con la plantilla de muestra (ver Tabla 1)-100 μL/pocillo.
- Sellar las placas ELISA con papel film e incubar a 37 °C durante 1 h.
- Diluir el anticuerpo secundario anti-ratón IgG-HRP (ver Tabla de materiales) con PBST a 1:10.000.
- Lavar el plato (tres ciclos, cada ciclo 300 μL). A continuación, añadir 100 μL del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo e incubar la placa a 37 °C durante 40 min.
- Tinción y terminación: Lavar la placa (cinco ciclos, cada ciclo 300 μL). Agregue la solución de tinción de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) (100 μL; consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo. Colocar las placas a 37 °C durante 10 minutos lejos de la luz, y luego terminar la reacción inmediatamente con 50 μL de 2 M H2SO4.
- Detecte el valor de densidad óptica (OD 450) mediante un marcador enzimático (lea el valor de OD450 dentro de los 15 minutos posteriores a la terminación).
5. Evaluación de los efectos in vivo de las nuevas vacunas adyuvantes
NOTA: El efecto protector de esta vacuna de nanoemulsión se evaluó en un modelo de ratón letal MRSA252 obtenido comercialmente (ver Tabla de materiales). De acuerdo con los resultados previos de nuestro grupo de investigación14, 1 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC)/ratón es la mejor dosis para evaluar el efecto protector del modelo letal de MRSA252 infección bacteriana.
- Recuperación de cepas: Obtener un tubo de MRSA252 congelado, inocular las bacterias en placas de Mueller Hinton (MH) (A) (ver Tabla de materiales) por el "método de tres líneas", y cultivar durante la noche a 37 °C. Realice los pasos del "método de tres líneas" como se menciona a continuación:
- Sosteniendo el anillo de inoculación en la mano derecha, cauterizarlo y enfriarlo para obtener un anillo de líquido bacteriano.
- Sostenga la placa de agar en la mano izquierda (manteniendo la tapa sobre la mesa) sobre el área frontal izquierda de la llama de la lámpara de alcohol para que la placa se enfrente a la llama, evitando que las bacterias entren en el aire. Con la mano derecha, mueva el anillo de inoculación de bacterias infectadas hacia adelante y hacia atrás en la superficie del agar de una manera densa pero no superpuesta, cubriendo un área de aproximadamente 1/5-1/6 de toda la placa, que es la primera zona.
NOTA: El anillo de inoculación y el agar deben estar en contacto suave en un ángulo de 30°-40°; El daño al agar se puede evitar deslizando con fuerza en la muñeca. - Cauterizar el exceso de bacterias en el anillo de inoculación (si cauterizar o esterilizar cada área depende de la cantidad de bacterias en la muestra). Después de enfriar, repita las penúltimas filas 2-3 al final y dibuje una segunda área (aproximadamente 1/4 del área del plato).
- Una vez terminada la segunda zona, cauteriza el anillo y dibuja la tercera zona de la misma manera para llenar todo el plato.
- Después de dibujar las líneas, coloque la placa en la tapa del plato, marque la placa e incube en una incubadora a 37 ° C durante 18-24 h para observar la distribución de las colonias en la superficie del agar. Centrar la atención en si una sola colonia está aislada y observar las características de la colonia (como el tamaño, la forma, la transparencia y la pigmentación).
- Activación bacteriana: Al día siguiente, tome dos matraces agitadores de 50 ml y agregue 20 ml de medio MH (B) (ver Tabla de materiales) a cada uno. Elija dos colonias individuales con una punta de pipeta de 10 μL y agréguelas a los agitadores. Incubar las colonias durante la noche a 220 rpm a 37 °C.
- Activación secundaria: Al día siguiente, tomar dos matraces agitadores de 50 ml, cada uno con 20 ml de medio MH (B). Extraer 200 μL de solución bacteriana del agitador que contiene las primeras bacterias activadas, añadir a los dos matraces nuevos que contienen 20 ml de medio MH (B) e incubar a 37 °C y 220 rpm durante 5 h.
- Recoja la segunda solución bacteriana activada en un tubo de centrífuga de 50 ml, sepárela a 3.000 x g durante 20 minutos y deseche el sobrenadante.
- Resuspender las bacterias precipitadas en 40 mL de solución salina.
- Mida el valor de OD600 de la solución bacteriana y ajuste a 1 con solución salina. En este momento, la cantidad bacteriana de MRSA252 en nuestro experimento fue de 2 x 109 UFC/ml.
- Diluir la solución bacteriana con un OD600 de 1 hasta una concentración de 1 x 109 UFC/ml.
- Divida aleatoriamente 48 ratones Balb/c en cuatro grupos (n = 12).
NOTA: Grupo I: Grupo PBS; Grupo II: Grupo control de BNE; Grupo III: grupo antígeno [proteína] naïve; Grupo IV: grupo de vacunas adyuvantes de nanoemulsión. - Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al 1%.
- Irradiar a los ratones con una lámpara de fisioterapia infrarroja (ver Tabla de materiales) durante aproximadamente 1 minuto para causar vasodilatación de la vena de la cola.
- Desafiar a los ratones con la inyección de la solución bacteriana diluida (paso 5.7) en la vena de la cola, 100 μL por ratón.
- Coloque los ratones bajo la lámpara de fisioterapia infrarroja hasta que puedan volver a la actividad normal.
- Observar y registrar la supervivencia de los ratones cada 12 h durante 10 días.
- Eutanasia a los ratones que sobrevivieron al ataque mediante inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al 1%.
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Representative Results
Se evaluó el protocolo para la preparación de la vacuna adyuvante de nanoemulsión y las pruebas in vitro e in vivo de esta vacuna. Se utilizaron TEM, AFM y DLS para determinar las características importantes del potencial zeta y el tamaño de partícula en la superficie de esta muestra (Figura 1). SDS-PAGE y western blotting mostraron que la cantidad de antígeno en el precipitado y sobrenadante no se degradó significativamente después de la centrifugación, lo que indicó que la vacuna estaba estructuralmente intacta, específica e inmunogénica (Figura 2). La vacuna adyuvante de nanoemulsión aumentó significativamente los títulos totales de anticuerpos IgG, IgG1 e IgG 2a. La inmunogenicidad de la vacuna mejoró significativamente (Figura 3A-C). Los valores séricos de OD de IgG2b a 450 nm del grupo antígeno fueron los más altos (diluido a 1:500 PBS) (Figura 3D). El modelo letal MRSA252 ratón reflejó más directamente que la vacuna adyuvante de nanoemulsión mostró un buen efecto protector e inhibió eficazmente la infección bacteriana con MRSA252, mejorando la tasa de supervivencia de los ratones infectados (Figura 4).
Figura 1: Características físicas de la nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión . (A) Micrografía electrónica de transmisión. (B) Microscopía de fuerza atómica. (C) Tamaño diámetro y distribución. (D) Potencial y distribución de Zeta. La figura se reproduce de Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Publicado originalmente y utilizado con permiso de Dove Medical Press Ltd. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estabilidad física de la nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión . (A) Integridad estructural de las proteínas antigénicas. (B) Especificidad estructural de la proteína antígeno. Carril 3: sobrenadante tratado con nanoemulsión en blanco; Carril 4: precipitado de tratamiento de nanoemulsión en blanco; Carril 5: marcador preñido; Carril 6: sobrenadante de vacuna; Carril 7: precipitado de vacunas; Carril 8: sobrenadante de tratamiento vacunal; Carril 9: precipitado del tratamiento de la vacuna; Carril 10: agente proteico nativo; (A) y (B) término mixto. Los canales de proteínas claramente definidos están marcados por cuadrados negros. Las flechas negras indican proteínas antigénicas. La figura se reproduce de Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Publicado originalmente y utilizado con permiso de Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Niveles de anticuerpos IgG y su subgrupo después de la inyección intramuscular con la vacuna adyuvante de nanoemulsión . (A) Valor logarítmico2 de los títulos de IgG. (B) 450 nm de densidad óptica de IgG1 sérica. (C) 450 nm de densidad óptica de IgG2a sérica. (D) 450 nm de densidad óptica de IgG2b sérica. La figura se reproduce de Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Publicado originalmente y utilizado con permiso de Dove Medical Press Ltd. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efecto protector en el modelo letal de MRSA252 infección bacteriana. La relación de supervivencia de ratones en respuesta a la infección sistémica por SARM. La figura se reproduce de Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Publicado originalmente y utilizado con permiso de Dove Medical Press Ltd. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Secuencia de picos ELISA y plantilla de dilución. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
IsdB, una proteína de superficie bacteriana anclada a la pared celular y regulada por hierro, juega un papel importante en el proceso de obtención de hierro hemo15. Hla, toxina alfa, es una de las toxinas bacterianas más efectivas conocidas en MRSA, y puede formar poros en células eucariotas e interferir con la adhesión y las células epiteliales16. En nuestro estudio, se construyó una nueva proteína de antígeno MRSA (HI) de recombinación y se expresó con tecnología de ingeniería génica basada en los genes de antígeno de IsdB y Hla. Luego, se desarrolló una vacuna de nanoemulsión por el método de emulsificación de baja energía, y se evaluó la estabilidad y efectividad de esta vacuna. Por ejemplo, algunas características, como la estabilidad a largo plazo, la estructura, la forma, la absorción y el efecto in vivo, se ven muy afectadas por el tamaño de la gota de emulsión7. Los resultados mostraron que el tamaño de partícula fue un factor importante que afectó el transporte de nanoemulsiones in vivo y su fagocitosis por células presentadoras de antígeno17. En cuanto a la citofagocitosis, las nanopartículas menores de 1 μm son fagocitadas más fácilmente por las células dendríticas (DC) y los macrófagos y son las más propensas a estimular la inmunidad sistémica18.
Con respecto al transporte de partículas, las nanopartículas menores de 100 nm tienen más probabilidades de transmitirse a través de los vasos linfáticos para mejorar el efecto inmune; Sin embargo, pequeñas nanopartículas se infiltran en los vasos sanguíneos, mientras que las nanopartículas grandes disminuyen su velocidad de transporte en los vasos linfáticos19. Por lo tanto, el tamaño de partícula óptimo está en el rango de 20-50 nm. Por lo tanto, es fundamental estudiar las características físicas de las nanopartículas, incluida la forma, el tamaño y el potencial zeta. TEM, con su alta precisión, se ha convertido en una herramienta importante y básica para comprender las propiedades de las vacunas adyuvantes de nanoemulsión. Además, la tecnología se ha aplicado ampliamente en muchos campos durante varios años. Otra herramienta de caracterización nanomecánica con información de alta resolución en 3D y nanoescala, AFM, también se utilizó para evaluar la vacuna de nanoemulsión13. Es importante destacar que el DLS, que revela simultáneamente el tamaño y la carga20, puede proporcionar información clave, como el estado de agregación de las partículas de la vacuna de nanoemulsión en solución. Según la literatura, un alto valor potencial zeta es indispensable para la estabilidad física y química de las suspensiones coloidales, ya que una gran fuerza repulsiva a menudo evita la agregación causada por colisiones ocasionales con nanopartículas adyacentes. Por lo tanto, en nuestra investigación, establecimos estos esquemas y evaluamos sus propiedades físicas y químicas con TEM, AFM y DLS.
Las vacunas proteicas desempeñan un papel importante en la prevención y el tratamiento de las principales enfermedades infecciosas21. Las vacunas proteicas se han desarrollado rápidamente en los últimos años, pero siguen existiendo serios desafíos en cuanto a la eficacia y persistencia inmunológicas. Las razones fundamentales de esto son la mala estabilidad de las proteínas, el pequeño coeficiente de distribución, la corta vida media biológica de los antígenos y las altas tasas de aclaramiento in vivo22. En este protocolo, se evaluó la estabilidad de la nueva vacuna de nanoemulsión, y no se observó degradación del antígeno por SDS-PAGE o western blot.
Una vacuna proteica segura, eficaz y comercializable debe complementarse con un adyuvante inmunitario adecuado para mejorar significativamente la inmunogenicidad del antígeno proteico y el tipo de respuesta inmunitaria protectora20 para obtener la protección inmunitaria óptima de la vacuna. El nivel de anticuerpos estimulado por una vacuna proteica es uno de los indicadores importantes para la prevención y el tratamiento efectivos de la infección, y el título de anticuerpos es un índice importante para evaluar si el nuevo adyuvante de nanoemulsión puede mejorar la inmunogenicidad del antígeno desnudo. Los nuevos adyuvantes inmunes pueden estimular significativamente el cuerpo para mejorar los niveles de respuesta inmune humoral y celular, y enriquecer los tipos de respuesta inmune y la eficacia inmunoprotectora de las vacunas es una dirección de desarrollo importante y el componente de la investigación futura y el desarrollo de nuevas vacunas23. Por lo tanto, en este protocolo, se detectaron títulos de anticuerpos de IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b específicas del suero de ratón con la nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión. El modelo de ratón letal24 es el estándar de oro para evaluar las vacunas, y en nuestro protocolo, se utilizó un modelo de ratón letal MRSA252 para evaluar el efecto protector. Los resultados mostraron que la nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión mejoró efectivamente la tasa de supervivencia de los ratones Balb / c infectados con MRSA.
Este protocolo no es suficiente en la evaluación de la estabilidad de las vacunas de nanoemulsión. El dicroísmo circular es un método adecuado si se puede aplicar para detectar la estructura espacial de las proteínas de la vacuna en un método simple y rápido. Aunque la tasa de supervivencia de los ratones probados por el ataque es el estándar de oro para evaluar la prueba in vivo y la efectividad de la vacuna, sería más convincente si se pudiera medir la cantidad de colonización bacteriana de los órganos de los ratones después del ataque. Por lo tanto, todavía hay algunas deficiencias en el protocolo actual para evaluar la respuesta inmune de la vacuna adyuvante de nanoemulsión, y el experimento anterior debe complementarse en experimentos relevantes posteriores para su evaluación.
En conclusión, es necesario establecer una serie de evaluaciones de las propiedades físicas, la estabilidad, la respuesta inmune específica y la protección contra desafíos. Completar estos esquemas proporcionará fundamentos experimentales vitales para la aplicación y el desarrollo de nuevas vacunas adyuvantes de nanoemulsión.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses en este trabajo.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China, el No. 32070924 y 32000651 del NSFC, y el No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
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