Summary
Il presente protocollo prepara e valuta le proprietà fisiche, la risposta immunitaria e l'effetto protettivo in vivo di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione.
Abstract
I vaccini adiuvanti a nanoemulsione hanno attirato molta attenzione a causa delle loro piccole dimensioni delle particelle, dell'elevata stabilità termica e della capacità di indurre risposte immunitarie valide. Tuttavia, stabilire una serie di protocolli completi per valutare la risposta immunitaria di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione è vitale. Pertanto, questo articolo presenta una procedura rigorosa per determinare le caratteristiche fisico-chimiche di un vaccino (mediante microscopia elettronica a trasmissione [TEM], microscopia a forza atomica [AFM] e diffusione dinamica della luce [DLS]), la stabilità dell'antigene e del sistema del vaccino (mediante un test di centrifuga ad alta velocità, un test di stabilità termodinamica, SDS-PAGE e western blot) e la risposta immunitaria specifica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono valutare accuratamente l'effetto protettivo di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione in un modello murino di MRSA252 letale. Con questi protocolli, è possibile identificare l'adiuvante del vaccino nanoemulsione più promettente in termini di potenziale adiuvante efficace. Inoltre, i metodi possono aiutare a ottimizzare nuovi vaccini per lo sviluppo futuro.
Introduction
Lo Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA) è un patogeno opportunista con uno dei più alti tassi di infezione in un'unità di terapia intensiva (ICU) reparti1, reparti di cardiologia e reparti ustionati in tutto il mondo. L'MRSA presenta alti tassi di infezione, mortalità e ampia resistenza ai farmaci, presentando grandi difficoltà nel trattamento clinico2. Nell'elenco delle priorità globali dei batteri resistenti agli antibiotici pubblicato dall'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) nel 2017, l'MRSA è stato elencatonella categoria 3 più critica. È quindi urgentemente necessario un vaccino contro l'infezione da MRSA.
L'adiuvante di alluminio è stato utilizzato per lungo tempo e il meccanismo ausiliario adiuvante è relativamente chiaro, sicuro, efficace e ben tollerato4. Gli adiuvanti di alluminio sono attualmente un tipo di coadiuvante ampiamente utilizzato. Si ritiene generalmente che gli antigeni adsorbiti su particelle di sale di alluminio possano migliorare la stabilità e migliorare la capacità del sito di iniezione di assorbire gli antigeni, fornendo un buon assorbimento e un lento rilascio5. Attualmente, il principale svantaggio degli adiuvanti di alluminio è che mancano di un effetto adiuvante o mostrano solo un debole effetto adiuvante su alcuni antigeni candidati al vaccino6. Inoltre, gli adiuvanti di alluminio inducono reazioni di ipersensibilità IgE-mediate5. Pertanto, è necessario sviluppare nuovi adiuvanti per stimolare una risposta immunitaria più forte.
Gli adiuvanti di nanoemulsione sono sistemi di dispersione colloidale composti da olio, acqua, tensioattivi e cotensioattivi7. Inoltre, gli adiuvanti sono termodinamicamente stabili e isotropi, possono essere autoclavati o stabilizzati mediante centrifugazione ad alta velocità e possono formarsi spontaneamente in condizioni di preparazione blande. Diversi adiuvanti di emulsione (come la serie MF59, NB001-002, la serie AS01-04, ecc.) sono attualmente sul mercato o in fase di ricerca clinica, ma le loro dimensioni delle particelle sono superiori a 160 nm8. Pertanto, i vantaggi dei preparati medicinali su scala nanometrica (1-100 nm) (vale a dire, grande superficie specifica, piccola dimensione delle particelle, effetto superficiale, alta energia superficiale, effetto di piccole dimensioni ed effetto di tunneling quantistico macro) non possono essere pienamente sfruttati. Nel presente protocollo, è stato riportato che un nuovo adiuvante basato sulla tecnologia della nanoemulsione con una dimensione del diametro di 1-100 nm mostra una buona attività adiuvante9. Abbiamo testato la proteina di fusione del frammento attivo della subunità del vaccino di ricombinazione HI (mutante α-emolisina [Hla] e proteina di fusione attiva del frammento attivo della subunità N2 del fattore B della superficie dello ione Fe [IsdB]); Sono state stabilite una serie di procedure per esaminare le proprietà fisiche e la stabilità, valutare la sua risposta anticorpale specifica dopo somministrazione intramuscolare e testare l'effetto protettivo del vaccino utilizzando un modello di infezione sistemica murina.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sulla base del manuale sull'uso e la cura degli animali da esperimento e sono stati approvati dal Comitato etico e benessere degli animali da laboratorio della Terza Università medica militare. Topi femmina Balb/c, di 6-8 settimane, sono stati utilizzati per il presente studio. Gli animali sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione della proteina dell'antigene MRSA HI
- Ottenere cloni di IsdB e Hla da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali), eseguire l'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare i geni IsdB e Hla e legare i loro prodotti al plasmide PGEX-6P-2 (ottenuto commercialmente; vedi Tabella dei materiali). Schermo con il ceppo vettore Xl/blue di Escherichia coli10.
- Trasformare il clone positivo in cellule competenti di E. coli BL21 (vedi Tabella dei materiali) e amplificare con coltura di squalo10.
- Esprimere l'antigene e isolare dopo induzione con isopropil-β-D-1-mercaptogalattopiranoside e kit isolati per cromatografia multimodale (MMC)11 (vedere Tabella dei materiali).
- Caratterizzare la proteina dell'antigene e purificarla con un purificatore completamente automatizzato11.
- Proteine marcate con gutatione S-transferasi (GST) purificate per affinità da lisati eliminati utilizzando una resina cromatografica di affinità disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
- Purificare le proteine ricombinanti mediante MMC11.
- Rimuovere l'endotossina con il metodo di separazione di fase Triton X-11411. In breve, mescolare Triton X-114 all'1% con eluato proteico ricombinante a 0 °C per 5 minuti per garantire una soluzione omogenea e incubare a 37 °C per 5 minuti per consentire la formazione di due fasi.
- Utilizzare il metodo di test dell'endotossina batterica11 con i kit Turtle (vedere la tabella dei materiali) per rilevare la concentrazione di endotossine. L'endotossina per l'antigene proteico è di 0,06 EU/μg, inferiore allo standard internazionale (1,5 EU/μg)10.
- Eseguire una prova di interferenza per eliminare la possibile influenza del prodotto in esame sul rilevamento delle endotossine11.
NOTA: Secondo l'appendice 2020 della farmacopea cinese12, il contenuto di endotossine deve essere inferiore a 5 EU/dose. La sensibilità del lisato di Limulus (λ0,25 EU/ml) e il rapporto di diluizione efficace massimo di 33,3 sono stati calcolati12 sulla base di MVD = cL/λ, dove L è il valore limite dell'endotossina batterica per l'articolo in esame, c è la concentrazione della soluzione dell'articolo in esame e quando L è espresso in EU/m, c è pari a 1,0 mg/ml. λ è la sensibilità marcata (EU/mL) del reagente del granchio ferro di cavallo nel metodo del gel.
- Eseguire una prova di interferenza per eliminare la possibile influenza del prodotto in esame sul rilevamento delle endotossine11.
- Ricombinare l'antigene (48 kDa, determinato mediante elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide al 12% [SDS-PAGE]) a 1,5 mg/ml in acqua sterile senza endotossina o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (metodo del diclorato di sodio)11.
NOTA: Il tempo di picco della proteina è stato di 13.843 min, la purezza è stata del 99,4% (metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni) e la proteina è stata conservata a -70 °C10. Il DNA genomico estratto dal ceppo di S. aureus MRSA252 (vedi Tabella dei materiali) è stato utilizzato come modello di PCR. Il gene IsdB è stato amplificato utilizzando il primer forward 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 e l'innesco inverso 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. Il gene Hla è stato amplificato utilizzando il primer forward PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) e il reverse primer PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC).
2. Preparazione del vaccino a nanoemulsione
- Secondo il rapporto di massa di 1:6:3 (p/p), aggiungere tre tipi di eccipienti in sequenza (isopropilmiristato, olio di ricino di poliossietilene e glicole propilenico; vedere la tabella dei materiali) alla soluzione di proteina dell'antigene HI (10 mg/ml) e mescolare bene. Quindi, aggiungere acqua pura gradualmente sterilizzata fino a raggiungere un volume finale di 10 ml e mescolare a 500 giri / min e 25 ° C per circa 20 minuti.
NOTA: La nanoemulsione preparata in questo protocollo ha un volume di 10 ml e le masse dei tre eccipienti sono rispettivamente 0,34 g, 2 g e 1 g. La soluzione proteica qui è la soluzione di lavoro, 10 volte la concentrazione della soluzione finale. - Preparare il vaccino adiuvante nanoemulsione (1 mg/mL di proteine) con metodi di emulsificazione a bassa energia13 per ottenere una soluzione liquida limpida e trasparente.
NOTA: La nanoemulsione in bianco (BNE) è stata preparata con metodi simili, tranne per il fatto che l'acqua è stata sostituita con HI. Il metodo di emulsificazione usuale prevede il riscaldamento delle fasi esterna e interna a circa 80 °C per l'emulsione e quindi l'agitazione e il raffreddamento gradualmente. In questo processo, viene consumata una grande quantità di energia e, infine, si ottiene l'emulsione.
3. Caratterizzazione fisica e stabilità del vaccino adiuvante nanoemulsione
- Dimensione delle particelle, potenziale zeta e caratterizzazione dell'indice di dispersione polimerica (PDI).
- Preparare 100 μL del vaccino adiuvante nanoemulsione e diluire 50 volte con acqua per preparazioni iniettabili. Aggiungere 2 ml di campione per il rilevamento.
- Osservare le dimensioni delle particelle, il potenziale zeta e il PDI a 25 °C usando un Nano Zetasizer (ZS; vedere la Tabella dei materiali).
- Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
- Diluire 10 μL di vaccino nanoemulsione 50 volte con acqua, porre su una griglia di rame a 100 maglie rivestita di carbonio e colorare con acido fosfotungstico all'1% (vedere Tabella dei materiali) per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di acido fosfotungstico in eccesso con carta da filtro.
- Osservare la morfologia al microscopio elettronico a trasmissione (vedi Tabella dei materiali). Esaminare se i prodotti finiti sono quasi stabili e circolari all'interno del campo visivo del microscopio elettronico e se mostrano una buona dispersione.
- Microscopia elettronica a scansione (SEM)
- Diluire 10 μL del vaccino adiuvante nanoemulsione 50 volte con acqua, far cadere 10 μL di campioni prediluiti su un wafer di silicio e metterli in un incubatore controllato da termostato a 37 °C per 24 ore.
- Spruzzare il platino preparato sul silicio per 40 s e raffreddare a temperatura ambiente.
- Osservare le proprietà morfologiche dei campioni preparati al microscopio elettronico a scansione ad alta risoluzione (vedi Tabella dei materiali). Determinare se i campioni sono quasi stabili, sferici e ben dispersi all'interno del campo visivo al microscopio elettronico.
- Stabilità morfologica
- Porre 1 mL di campioni di vaccino nanoemulsione in provette da microcentrifuga e valutare la stabilità di campioni freschi centrifugando per 30 minuti a 13.000 x g a temperatura ambiente (25°).
- Osservare l'aspetto di questi campioni freschi e quindi eseguire un test di stabilità termodinamica di sei cicli di temperatura (un ciclo: conservare a 4 °C per 48 h, 25 °C per 48 h e 37 °C per 48 h).
- Dopo la centrifugazione, lasciare riposare i campioni per 15 minuti per determinare se c'è un effetto Tyndall (se il campione è chiaro e trasparente sotto la luce) e se si è verificata la demulsificazione (mostrata da una chiara stratificazione dopo la demulsificazione).
- SDS-PAGE e western blot
- Agitare i campioni, mescolare una soluzione di 0,6 ml di etanolo assoluto e 0,3 ml di vaccino e centrifugare (13.000 x g, 30 min a temperatura ambiente, 25 °C).
- Trasferire il surnatante della soluzione in un tubo pulito e sciogliere il precipitato con 0,3 ml di acqua. Ottenere le soluzioni di surnatante e precipitato (sia nanoemulsione in bianco che vaccino) dopo il trattamento con etanolo assoluto e soluzione di acqua distillata ed eseguire la stessa diluizione di 50 volte.
- Mescolare 2,5 mL di gel di separazione A e 2,5 mL di gel di separazione B (vedere Tabella dei materiali), aggiungere 50 μL di persolfato di ammonio al 10% e posizionare rapidamente la soluzione nella lastra di vetro con una pipetta. Mescolare 1 mL di gel concentrato A e 1 mL di gel concentrato B, aggiungere 20 μL di persolfato di ammonio al 10% nella lastra di vetro, inserire un pettine di dimensioni appropriate e attendere la solidificazione.
- Aggiungere un totale di 5 μL di soluzione tampone di carico proteico 5x al campione diluito ottenuto nella fase 3.5.2 e far bollire il campione per 5 minuti.
- Aggiungere 10 μL di proteine riscaldate al pozzetto corrispondente e aggiungere 5 μL di marcatore proteico al pozzetto marcatore.
- Collegare l'elettrodo, accendere il misuratore di elettroforesi (vedere Tabella dei materiali) e regolare la tensione a 300 V. Spegnere l'alimentazione quando l'elettroforesi raggiunge 1 cm di distanza dal fondo della gomma PAGE.
- Rimuovere il gel e risciacquare con ddH2O. Aggiungere la soluzione colorante blu brillante G-250 Coomassie (vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti. Versare la soluzione colorante e risciacquare il gel due volte con ddH2O.
- Aggiungere la soluzione di decolorazione disponibile in commercio e cuocere a microonde il gel per 1 minuto. Agitare il gel per 10 minuti e cambiare ripetutamente la soluzione di decolorazione fino a quando lo sfondo del gel è chiaro. Quindi, eseguire l'imaging in gel (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: la macchia occidentale è stata pre-elaborata, come descritto nei passaggi 3.5.1-3.5.6. - Immergere tre blocchi di carta da filtro con un tampone di trasferimento per elettroforesi. Immergere la membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) in metanolo per 30 s e trasferire con uno strumento di trasferimento di gel semisecco (due strati di carta da filtro, membrana PVDF, gel per elettroforesi e uno strato di carta da filtro). Utilizzare una tensione di 23 V per trasferire la membrana per 23 minuti.
- Rimuovere la membrana PVDF e lavare una volta con tris-buffered saline-Tween 20 (TBST) dopo il trasferimento.
- Porre la membrana PVDF in soluzione sigillante (soluzione di latte scremato in polvere al 5%) e sigillare per una notte a 4 °C.
- Rimuovere la membrana PVDF e lavare tre volte con TBST o 10 minuti ciascuna.
- Incubare con l'anticorpo primario (da topi immunizzati con siero positivo). Diluire l'anticorpo primario11 (vedere Tabella dei materiali) da testare 500 volte (100 volte) con TBST. Posizionare la membrana PVDF bloccata nell'anticorpo primario e incubare a 37 °C per 1 ora.
- Rimuovere la membrana PVDF e lavare tre volte con TBST per 10 minuti ciascuna.
- Incubare con l'anticorpo secondario (vedere Tabella dei materiali). Diluire l'anticorpo secondario anti-topo anti-topo marcato con fosfatasi alcalina alcalina (AP) 5.000 volte con TBST. Introdurre la membrana PVDF nell'anticorpo secondario e incubare a 37 °C per 40 minuti.
- Rimuovere la membrana PVDF e lavare quattro volte con TBST per 10 minuti ciascuna.
- Immergere le membrane PVDF in una miscela (quanto basta per immergere la membrana) del substrato AP nitro blu tetrazolo (NBT) e BCIP (5-bromo-4-cloro-3'-indololifosfato p-toluidina sale) (vedi tabella dei materiali) per la colorazione. Un risultato positivo è viola.
NOTA: I risultati devono essere una banda viola chiara e la striscia del campione e il peso molecolare dell'antigene devono essere nella stessa posizione marcata.
4. Valutazione della risposta immunitaria degli anticorpi a questo vaccino dopo somministrazione intramuscolare
NOTA: I topi sono stati immunizzati mediante iniezione intramuscolare del vaccino nanoemulsione a seguito di un rapporto pubblicato11. Ai topi è stato somministrato PBS come controllo negativo. A 1 settimana dopo il completamento di tre vaccinazioni, il siero è stato raccolto dai topi11. I livelli sierici di IgG e delle sottoclassi di IgG1, IgG2a e IgG2b sono stati determinati quantitativamente mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
- Rivestimento dell'antigene: diluire l'antigene della proteina HI a 10 μg/ml con la soluzione di rivestimento e aggiungere alla piastra ELISA a 100 μL/pozzetto. Incubare a 4 °C durante la notte.
NOTA: La soluzione di rivestimento viene preparata sciogliendo 1,6 g di carbonato di sodio anidro e 2,9 g di bicarbonato di sodio in 1 L di acqua deionizzata. - Tenuta: Lavare la piastra (tre cicli, ogni ciclo 300 μL). Aggiungere 300 μL della soluzione sigillante a ciascun pozzetto e sigillare i pozzetti per 2 ore a 37 °C.
NOTA: La soluzione sigillante viene preparata aggiungendo Tween-20 e albumina sierica bovina (BSA) al PBS. Il contenuto di BSA nella soluzione PBST è dell'1%. - Diluizione del siero: Diluire il siero campione di topi 100 volte con PBST (prendere 3 μL di siero e aggiungerlo a 297 μL di PBST e vortice) e utilizzare 100 μL per ciascun campione di siero. Diluire il siero positivo e il siero di controllo negativo 100 volte con PBST aggiungendo 4 μL a 396 μL di PBST, quindi miscelando per vortice.
- Diluizione a doppio rapporto: aggiungere 200 μL del siero sperimentale diluito sopra riportato alla prima riga della piastra ELISA rivestita e aggiungere 100 μL di PBST a tutti i pozzetti tranne la prima e la 12afila. Eseguire una diluizione 1:2 successivamente dalla prima riga: regolare la pipetta a 100 μL, trasferire 100 μL dalla prima fila alla seconda fila e mescolare con la pipetta 10 volte.
- Diluire il siero alla riga 11 in rapporti multipli ed eliminare 100 μL di liquido.
- Aggiungere siero diluito negativo e positivo ai pozzetti corrispondenti nella riga 12 secondo il modello di esempio (vedere Tabella 1)-100 μL/pozzetto.
- Sigillare le piastre ELISA con pellicola trasparente e incubare a 37 °C per 1 ora.
- Diluire l'anticorpo secondario anticorpale IgG-HRP (vedere Tabella dei materiali) con PBST a 1:10.000.
- Lavare la piastra (tre cicli, ogni ciclo 300 μL). Quindi, aggiungere 100 μL di anticorpo secondario diluito a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 37 °C per 40 minuti.
- Colorazione e terminazione: Lavare la piastra (cinque cicli, ogni ciclo 300 μL). Aggiungere una soluzione colorante di 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) (100 μL; vedere la tabella dei materiali) a ciascun pozzetto. Porre le piastre a 37 °C per 10 minuti lontano dalla luce, quindi terminare immediatamente la reazione con 50 μL di 2 M H2SO4.
- Rilevare il valore della densità ottica (OD 450) mediante un marcatore enzimatico (leggere il valore OD450 entro 15 minuti dalla terminazione).
5. Valutazione degli effetti in vivo dei nuovi vaccini adiuvanti
NOTA: L'effetto protettivo di questo vaccino a nanoemulsione è stato valutato in un modello murino di MRSA252 letale ottenuto commercialmente (vedere Tabella dei materiali). Secondo i precedenti risultati del nostro gruppo di ricerca14, 1 x 108 unità formanti colonie (CFU)/topo è la dose migliore per valutare l'effetto protettivo del modello letale di infezione batterica MRSA252.
- Recupero del ceppo: ottenere una provetta di MRSA252 congelata, inoculare i batteri su piastre Mueller Hinton (MH) (A) (vedi tabella dei materiali) con il "metodo a tre linee" e coltivare per una notte a 37 °C. Eseguire i passaggi del "metodo a tre righe" come indicato di seguito:
- Tenendo l'anello di inoculazione nella mano destra, cauterizzarlo e raffreddarlo per ottenere un anello di liquido batterico.
- Tenere la piastra di agar nella mano sinistra (tenendo il coperchio sul tavolo) sopra l'area anteriore sinistra della fiamma della lampada ad alcool in modo che la piastra sia rivolta verso la fiamma, impedendo ai batteri di entrare nell'aria. Con la mano destra, spostare l'anello di inoculazione dei batteri infetti avanti e indietro sulla superficie dell'agar in modo denso ma non sovrapposto, coprendo un'area di circa 1/5-1/6 dell'intera piastra, che è la prima zona.
NOTA: L'anello di inoculazione e l'agar devono essere in contatto delicato con un angolo di 30°-40°; Il danneggiamento dell'agar può essere evitato scivolando con la forza del polso. - Cauterizzare i batteri in eccesso sull'anello di inoculazione (se cauterizzare o sterilizzare ogni area dipende dalla quantità di batteri nel campione). Dopo il raffreddamento, ripetere le penultime righe 2-3 alla fine e disegnare una seconda area (circa 1/4 dell'area della piastra).
- Dopo aver terminato la seconda zona, cauterizzare l'anello e disegnare la terza zona allo stesso modo per riempire l'intero piatto.
- Dopo aver disegnato le linee, posizionare la piastra sul coperchio del piatto, contrassegnare la piastra e incubare in un'incubatrice a 37 °C per 18-24 ore per osservare la distribuzione delle colonie sulla superficie dell'agar. Focalizzare l'attenzione sul fatto che una singola colonia sia isolata e osservare le caratteristiche della colonia (come dimensioni, forma, trasparenza e pigmentazione).
- Attivazione batterica: il giorno successivo, prelevare due palloni da 50 ml di agitatore e aggiungere 20 ml di terreno MH (B) (vedi Tabella dei materiali) a ciascuno. Prelevare due colonie singole con una punta di pipetta da 10 μL e aggiungerle agli agitatori. Incubare le colonie durante la notte a 220 giri/min a 37 °C.
- Attivazione secondaria: Il giorno successivo, prendere due matraccio agitatore da 50 ml, ciascuno contenente 20 ml di terreno MH (B). Prelevare 200 μL di soluzione batterica dall'agitatore contenente i primi batteri attivati, aggiungere ai due nuovi matraccio contenenti 20 mL di mezzo MH (B) e incubare a 37 °C e 220 giri/min per 5 ore.
- Raccogliere la seconda soluzione batterica attivata in una provetta da centrifuga da 50 ml, separare a 3.000 x g per 20 minuti ed eliminare il surnatante.
- Risospendere i batteri precipitati in 40 ml di soluzione salina.
- Misurare il valore OD600 della soluzione batterica e regolare a 1 con soluzione salina. A quel tempo, la quantità batterica di MRSA252 nel nostro esperimento era 2 x 109 CFU / ml.
- Diluire la soluzione batterica con un OD600 di 1 ad una concentrazione di 1 x 109 CFU/ml.
- Dividere casualmente 48 topi Balb/c in quattro gruppi (n=12).
NOTA: Gruppo I: gruppo PBS; Gruppo II: gruppo di controllo BNE; Gruppo III: gruppo [proteina] dell'antigene naïve; Gruppo IV: gruppo vaccinale adiuvante nanoemulsione. - Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di sodio pentobarbital all'1%.
- Irradiare i topi con una lampada per fisioterapia a infrarossi (vedi Tabella dei materiali) per circa 1 minuto per provocare vasodilatazione della vena caudale.
- Sfidare i topi con l'iniezione della soluzione batterica diluita (fase 5.7) nella vena della coda, 100 μL per topo.
- Posizionare i topi sotto la lampada di fisioterapia a infrarossi fino a quando non possono tornare alla normale attività.
- Osservare e registrare la sopravvivenza dei topi ogni 12 ore per 10 giorni.
- Eutanasia i topi sopravvissuti all'attacco mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital di sodio all'1%.
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Representative Results
È stato valutato il protocollo per la preparazione del vaccino adiuvante nanoemulsione e i test in vitro e in vivo di questo vaccino. TEM, AFM e DLS sono stati utilizzati per determinare le importanti caratteristiche del potenziale zeta e della dimensione delle particelle sulla superficie di questo campione (Figura 1). SDS-PAGE e western blotting hanno mostrato che la quantità di antigene nel precipitato e nel surnatante non si è degradata significativamente dopo la centrifugazione, il che indica che il vaccino era strutturalmente intatto, specifico e immunogenico (Figura 2). Il vaccino adiuvante nanoemulsione ha aumentato significativamente i titoli anticorpali totali IgG, IgG1 e IgG 2a. L'immunogenicità del vaccino è risultata significativamente migliorata (Figura 3A-C). I valori sierici di OD di IgG2b a 450 nm del gruppo antigene erano i più alti (diluito a 1:500 PBS) (Figura 3D). Il modello letale MRSA252 murino rifletteva più direttamente che il vaccino adiuvante nanoemulsione mostrava un buon effetto protettivo e inibiva efficacemente l'infezione batterica con MRSA252, migliorando il tasso di sopravvivenza dei topi infetti (Figura 4).
Figura 1: Caratteristiche fisiche del nuovo vaccino adiuvante a nanoemulsione . (A) Micrografia elettronica a trasmissione. (B) Micrografia microscopica a forza atomica. (C) Diametro dimensionale e distribuzione. (D) Potenziale zeta e distribuzione. La figura è riprodotta da Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Originariamente pubblicato e utilizzato con il permesso di Dove Medical Press Ltd. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Stabilità fisica del nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione . (A) Integrità strutturale delle proteine antigeniche. (B) Specificità strutturale della proteina dell'antigene. corsia 3: supernatante bianco trattato con nanoemulsione; Corsia 4: precipitato di trattamento con nanoemulsione in bianco; Corsia 5: marcatore prestained; Corsia 6: vaccino supernatante; Corsia 7: precipitare il vaccino; Corsia 8: trattamento vaccinale supernatante; Corsia 9: precipitare il trattamento vaccinale; Corsia 10: agente proteico nativo; (A) e (B) termine misto. I canali proteici chiaramente definiti sono contrassegnati da quadrati neri. Le frecce nere indicano proteine antigeniche. La figura è riprodotta da Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Originariamente pubblicato e utilizzato con il permesso di Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Livelli di anticorpi IgG e dei suoi sottogruppi dopo iniezione intramuscolare con il vaccino adiuvante nanoemulsione . (A) Valore log2 dei titoli IgG. (B) 450 nm di densità ottica delle IgG1 sieriche. (C) 450 nm di densità ottica delle IgG2a sieriche. (D) 450 nm di densità ottica delle IgG2b sieriche. La figura è riprodotta da Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Originariamente pubblicato e utilizzato con il permesso di Dove Medical Press Ltd. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Effetto protettivo nel modello letale di infezione batterica MRSA252. Il rapporto di sopravvivenza dei topi in risposta all'infezione sistemica da MRSA. La figura è riprodotta da Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Originariamente pubblicato e utilizzato con il permesso di Dove Medical Press Ltd. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Sequenza di spiking ELISA e modello di diluizione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
IsdB, una proteina di superficie ancorata alla parete cellulare batterica e regolata dal ferro, svolge un ruolo importante nel processo di ottenimento del ferro eme15. Hla, tossina alfa, è tra le tossine batteriche più efficaci conosciute nell'MRSA e può formare pori nelle cellule eucariotiche e interferire con l'adesione e le cellule epiteliali16. Nel nostro studio, una nuova proteina antigene MRSA di ricombinazione (HI) è stata costruita ed espressa con la tecnologia di ingegneria genica basata sui geni dell'antigene di IsdB e Hla. Quindi, è stato sviluppato un vaccino a nanoemulsione con il metodo di emulsificazione a bassa energia e sono state valutate la stabilità e l'efficacia di questo vaccino. Ad esempio, alcune caratteristiche, come la stabilità a lungo termine, la struttura, la forma, l'assorbimento e l'effetto in vivo, sono fortemente influenzate dalla dimensione della goccia di emulsione7. I risultati hanno mostrato che la dimensione delle particelle era un fattore importante che influenza il trasporto di nanoemulsioni in vivo e la loro fagocitosi da parte delle cellule presentanti l'antigene17. Per quanto riguarda la citofagocitosi, le nanoparticelle più piccole di 1 μm sono più facilmente fagocitate dalle cellule dendritiche (DC) e dai macrofagi e hanno maggiori probabilità di stimolare l'immunità sistemica18.
Per quanto riguarda il trasporto di particelle, le nanoparticelle più piccole di 100 nm hanno maggiori probabilità di essere trasmesse attraverso i vasi linfatici per migliorare l'effetto immunitario; Tuttavia, piccole nanoparticelle si infiltrano nei vasi sanguigni, mentre le grandi nanoparticelle rallentano la loro velocità di trasporto nei vasi linfatici19. Pertanto, la dimensione ottimale delle particelle è compresa tra 20 e 50 nm. Quindi, è fondamentale studiare le caratteristiche fisiche delle nanoparticelle, tra cui forma, dimensione e potenziale zeta. TEM, con la sua alta precisione, è diventato uno strumento importante e fondamentale per comprendere le proprietà dei vaccini adiuvanti in nanoemulsione. Inoltre, la tecnologia è stata ampiamente applicata in molti campi per diversi anni. Un altro strumento di caratterizzazione nanomeccanica con informazioni ad alta risoluzione 3D e nanoscala, AFM, è stato utilizzato anche per valutare il vaccino nanoemulsione13. È importante sottolineare che DLS, che rivela simultaneamente sia le dimensioni che la carica20, può fornire informazioni chiave, come lo stato di aggregazione delle particelle di vaccino nanoemulsione in soluzione. Secondo la letteratura, un alto valore di potenziale zeta è indispensabile per la stabilità fisica e chimica delle sospensioni colloidali, poiché una grande forza repulsiva spesso impedisce l'aggregazione causata da collisioni occasionali con nanoparticelle adiacenti. Pertanto, nella nostra ricerca, abbiamo impostato questi schemi e valutato le loro proprietà fisiche e chimiche con TEM, AFM e DLS.
I vaccini proteici svolgono un ruolo importante nella prevenzione e nel trattamento delle principali malattie infettive21. I vaccini proteici si sono sviluppati rapidamente negli ultimi anni, ma rimangono serie sfide nell'efficacia e nella persistenza immunitaria. Le ragioni fondamentali di ciò sono la scarsa stabilità delle proteine, il piccolo coefficiente di distribuzione, la breve emivita biologica degli antigeni e gli alti tassi di clearance in vivo22. In questo protocollo, è stata valutata la stabilità del nuovo vaccino a nanoemulsione e nessuna degradazione dell'antigene è stata osservata da SDS-PAGE o western blot.
Un vaccino proteico sicuro, efficace e commerciabile deve essere integrato con un adiuvante immunitario appropriato per migliorare significativamente l'immunogenicità dell'antigene proteico e il tipo di risposta immunitaria protettiva20 per ottenere la protezione immunitaria ottimale del vaccino. Il livello di anticorpi stimolato da un vaccino proteico è tra gli indicatori importanti per l'efficace prevenzione e trattamento dell'infezione e il titolo anticorpale è un indice importante per valutare se il nuovo adiuvante nanoemulsione può migliorare l'immunogenicità dell'antigene nudo. Nuovi adiuvanti immunitari possono stimolare significativamente il corpo a migliorare i livelli di risposta immunitaria umorale e cellulare, e arricchire i tipi di risposta immunitaria e l'efficacia protettiva immunitaria dei vaccini è un'importante direzione di sviluppo e la componente della ricerca futura e dello sviluppo di nuovi vaccini23. Pertanto, in questo protocollo, sono stati rilevati titoli anticorpali di IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b specifici del siero di topo con il nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione. Il modello di topo letale24 è il gold standard per la valutazione dei vaccini e, nel nostro protocollo, è stato utilizzato un modello di topo MRSA252 letale per valutare l'effetto protettivo. I risultati hanno mostrato che il nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione ha migliorato efficacemente il tasso di sopravvivenza dei topi Balb / c infettati da MRSA.
Questo protocollo non è sufficiente nella valutazione della stabilità dei vaccini a nanoemulsione. Il dicroismo circolare è un metodo adatto se può essere applicato per rilevare la struttura spaziale delle proteine del vaccino in un metodo semplice e veloce. Sebbene il tasso di sopravvivenza dei topi testati dall'attacco sia il gold standard per valutare il test in vivo e l'efficacia del vaccino, sarebbe più convincente se la quantità di colonizzazione batterica degli organi dei topi dopo l'attacco potesse essere misurata. Pertanto, ci sono ancora alcune carenze nel presente protocollo per valutare la risposta immunitaria del vaccino adiuvante nanoemulsione, e l'esperimento di cui sopra deve essere integrato in successivi esperimenti pertinenti per la valutazione.
In conclusione, è necessario stabilire una serie di valutazioni delle proprietà fisiche, della stabilità, della risposta immunitaria specifica e della protezione dalle sfide. Il completamento di questi schemi fornirà fondamenti sperimentali vitali per l'applicazione e lo sviluppo di nuovi vaccini adiuvanti a nanoemulsione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in questo lavoro.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dal n. 2021YFC2302603 del National Key Research and Development Program of China, No. 32070924 e 32000651 del NSFC e No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Natural Science Foundation Project Program di Chongqing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
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