Summary
O presente protocolo prepara e avalia as propriedades físicas, a resposta imune e o efeito protetor in vivo de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão.
Abstract
As vacinas adjuvantes em nanoemulsão têm atraído grande atenção devido ao seu pequeno tamanho de partículas, alta estabilidade térmica e capacidade de induzir respostas validamente imunes. No entanto, o estabelecimento de uma série de protocolos abrangentes para avaliar a resposta imune de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão é vital. Portanto, este artigo apresenta um procedimento rigoroso para determinar as características físico-químicas de uma vacina (por microscopia eletrônica de transmissão [MET], microscopia de força atômica [AFM] e espalhamento dinâmico de luz [DLS]), a estabilidade do antígeno e do sistema vacinal (por um teste de centrífuga de alta velocidade, um teste de estabilidade termodinâmica, SDS-PAGE e western blot) e a resposta imune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando essa abordagem, os pesquisadores podem avaliar com precisão o efeito protetor de uma nova vacina adjuvante de nanoemulsão em um modelo de camundongo MRSA252 letal. Com esses protocolos, pode-se identificar o adjuvante vacinal em nanoemulsão mais promissor em termos de potencial adjuvante efetivo. Além disso, os métodos podem ajudar a otimizar novas vacinas para desenvolvimento futuro.
Introduction
Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um patógeno oportunista com uma das mais altas taxas de infecção em enfermarias de unidade de terapia intensiva (UTI)1, departamentos de cardiologia e departamentos de queimados em todo o mundo. MRSA apresenta altas taxas de infecção, mortalidade e ampla resistência a drogas, apresentando grandes dificuldades no tratamento clínico2. Na Lista Global Prioritária de Bactérias Resistentes a Antibióticos divulgada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2017, o MRSA foi listado na categoria3 mais crítica. Uma vacina contra a infecção por MRSA é, portanto, urgentemente necessária.
O adjuvante de alumínio é utilizado há muito tempo, e o mecanismo auxiliar do adjuvante é relativamente claro, seguro, eficaz e bem tolerado4. Os adjuvantes de alumínio são atualmente um tipo de adjuvante amplamente utilizado. Acredita-se que antígenos adsorvidos em partículas de sal de alumínio possam melhorar a estabilidade e aumentar a capacidade do local de injeção de captar antígenos, proporcionando boa absorção e liberação lenta5. Atualmente, a principal desvantagem dos adjuvantes de alumínio é que eles não têm efeito adjuvante ou exibem apenas um fraco efeito adjuvante sobre alguns antígenos candidatos à vacina6. Além disso, adjuvantes de alumínio induzem reações de hipersensibilidade mediadas por IgE5. Portanto, é necessário desenvolver novos adjuvantes para estimular uma resposta imune mais forte.
Os adjuvantes em nanoemulsão são sistemas de dispersão coloidal compostos por óleo, água, surfactantes e cosurfactantes7. Além disso, os adjuvantes são termodinamicamente estáveis e isotrópicos, podem ser autoclavados ou estabilizados por centrifugação de alta velocidade e podem ser formados espontaneamente sob condições leves de preparação. Vários adjuvantes de emulsão (como MF59, NB001-002 series, AS01-04 series, etc.) estão atualmente no mercado ou em fase de pesquisa clínica, mas seus tamanhos de partículas são superiores a 160 nm8. Portanto, as vantagens das preparações medicinais em nanoescala (1-100 nm) (ou seja, grande área de superfície específica, tamanho de partícula pequeno, efeito de superfície, alta energia de superfície, efeito de tamanho pequeno e efeito de tunelamento macroquântico) não podem ser totalmente exploradas. No presente protocolo, um novo adjuvante baseado na tecnologia de nanoemulsão com um tamanho de diâmetro de 1-100 nm foi relatado como exibindo boa atividade adjuvante9. Testamos a proteína de antígeno vacinal de subunidade de recombinação HI (α-hemolisina mutante [Hla] e fator determinante de superfície do íon Fe B [IsdB] subunidade N2 proteína de fusão de fragmento ativo); Uma série de procedimentos foi estabelecida para examinar as propriedades físicas e a estabilidade, avaliar sua resposta específica de anticorpos após administração intramuscular e testar o efeito protetor da vacina usando um modelo de infecção sistêmica em camundongos.
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Protocol
Os experimentos com animais foram conduzidos com base no manual de uso e cuidados com animais de experimentação e foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal de Laboratório da Terceira Universidade Militar de Medicina. Camundongos Balb/c fêmeas, com 6-8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação da proteína do antígeno MRSA HI
- Obter clones IsdB e Hla de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais), realizar amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar genes IsdB e Hla e ligar seus produtos ao plasmídeo PGEX-6P-2 (obtido comercialmente; ver Tabela de Materiais). Tela com o vetor Xl/cepa azul de Escherichia coli10.
- Transformar o clone positivo em células competentes de E. coli BL21 (ver Tabela de Materiais) e amplificar com cultura de tubarão10.
- Expresse o antígeno e isole após indução com isopropil-β-D-1-mercaptogalactopiranosídeo e kits de isolados de cromatografia multimodal (MMC)11(ver Tabela de Materiais).
- Caracterizar a proteína antigênica e purificá-la com um purificador de automação completa11.
- Proteínas marcadas com gutationa S-transferase (GST) purificadas por afinidade a partir de lisados limpos usando uma resina cromatográfica de afinidade disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).
- Purificar as proteínas recombinantes por MMC11.
- Remover a endotoxina pelo método de separação de fases Triton X-11411. Resumidamente, misturar Triton X-114 a 1% com eluato de proteína recombinante a 0 °C durante 5 minutos para garantir uma solução homogénea e incubar a 37 °C durante 5 minutos para permitir a formação de duas fases.
- Use o método de teste de endotoxina bacteriana11 com kits Turtle (ver Tabela de Materiais) para detectar a concentração de endotoxina. A endotoxina para antígeno proteico é de 0,06 EU/μg, inferior ao padrão internacional (1,5 EU/μg)10.
- Realizar um teste de interferência para eliminar a possível influência do produto em teste na detecção de endotoxinas11.
NOTA: De acordo com o apêndice 2020 da farmacopeia chinesa12, o teor de endotoxinas deve ser inferior a 5 EU/dose. A sensibilidade do lisado de Limulus (λ0,25 EU/mL) e a razão de diluição efetiva máxima de 33,3 foram calculadas12 com base em MVD = cL/λ, onde L é o valor-limite de endotoxina bacteriana para o artigo de teste, c é a concentração da solução do artigo de teste e, quando L é expresso em EU/m, c é igual a 1,0 mg/mL. λ é a sensibilidade marcada (EU/mL) do reagente de caranguejo-ferradura no método do gel.
- Realizar um teste de interferência para eliminar a possível influência do produto em teste na detecção de endotoxinas11.
- Recombinar o antígeno (48 kDa, determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 12% [SDS-PAGE]) a 1,5 mg/mL em água estéril sem endotoxina ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) (método do diclorato de sódio)11.
NOTA: O tempo de pico da proteína foi de 13,843 min, a pureza foi de 99,4% (método de cromatografia líquida de alta eficiência) e a proteína foi armazenada a -70 °C10. DNA genômico extraído da cepa de S. aureus MRSA252 (ver Tabela de Materiais) foi usado como modelo de PCR. O gene IsdB foi amplificado usando o primer forward 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 e o primer reverso 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTATTAGATTCTTC-39. O gene Hla foi amplificado usando o primer forward PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) e o primer reverso PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC).
2. Preparação da vacina em nanoemulsão
- De acordo com a relação de massa de 1:6:3 (p/p), adicione três tipos de excipientes em sequência (miristato de isopropilo, óleo de rícino de polioxietileno e propilenoglicol; ver Tabela de Materiais) à solução de proteína do antígeno HI (10 mg/mL) e mexa bem. Em seguida, adicionar água pura gradualmente esterilizada até atingir um volume final de 10 mL e agitar a 500 rpm e 25 °C por aproximadamente 20 min.
NOTA: A nanoemulsão preparada neste protocolo tem um volume de 10 mL, e as massas dos três excipientes são de 0,34 g, 2 g e 1 g, respectivamente. A solução proteica aqui é a solução de trabalho, 10 vezes a concentração da solução final. - Preparar a vacina adjuvante em nanoemulsão (1 mg/mL de proteína) por métodos de emulsificação de baixa energia13 para obter uma solução líquida transparente e límpida.
NOTA: A nanoemulsão em branco (BNE) foi preparada por métodos semelhantes, exceto que a água foi substituída por HI. O método de emulsificação usual envolve o aquecimento das fases externa e interna a aproximadamente 80 °C para emulsificação e, em seguida, agitá-las e resfriá-las gradualmente. Nesse processo, uma grande quantidade de energia é consumida e, finalmente, a emulsão é obtida.
3. Caracterização física e estabilidade da vacina adjuvante em nanoemulsão
- Tamanho de partícula, potencial zeta e caracterização do índice de dispersão de polímeros (PDI).
- Preparar 100 μL da vacina adjuvante em nanoemulsão e diluir 50 vezes com água para injeção. Adicionar 2 mL de amostra para detecção.
- Observe os tamanhos de partículas, potencial zeta e PDI a 25 °C usando um Nano Zetasizer (ZS; ver Tabela de Materiais).
- Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
- Diluir 10 μL de vacina em nanoemulsão 50 vezes com água, colocar em uma grade de cobre de 100 malhas revestida de carbono e corar com ácido fosfotúngstico a 1% (ver Tabela de Materiais) por 5 minutos à temperatura ambiente.
- Remova o excesso de solução de ácido fosfotúngstico com papel de filtro.
- Observe a morfologia sob um microscópio eletrônico de transmissão (ver Tabela de Materiais). Examine se os produtos acabados são quase estáveis e circulares dentro do campo de visão do microscópio eletrônico e se eles exibem boa dispersão.
- Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
- Diluir 10 μL da vacina adjuvante em nanoemulsão 50 vezes com água, soltar 10 μL de amostras pré-diluídas em um wafer de silício e colocar em uma incubadora controlada por termostato a 37 °C por 24 horas.
- Borrifar a platina preparada sobre o silício durante 40 s e arrefecer até à temperatura ambiente.
- Observar as propriedades morfológicas das amostras preparadas em microscópio eletrônico de varredura de alta resolução (ver Tabela de Materiais). Determine se as amostras são quase estáveis, esféricas e bem dispersas dentro do campo de visão sob o microscópio eletrônico.
- Estabilidade morfológica
- Colocar 1 mL de amostras de vacina em nanoemulsão em tubos de microcentrífuga e avaliar a estabilidade de amostras frescas centrifugando por 30 min a 13.000 x g à temperatura ambiente (25°).
- Observe a aparência dessas amostras frescas e, em seguida, realize um teste de estabilidade termodinâmica de seis ciclos de temperatura (um ciclo: armazenar a 4 °C por 48 h, 25 °C por 48 h e 37 °C por 48 h).
- Após a centrifugação, deixar as amostras repousarem durante 15 minutos para determinar se existe um efeito Tyndall (se a amostra é clara e transparente sob luz) e se ocorreu desmulsificação (demonstrada por estratificação clara após a desmulsificação).
- SDS-PAGE e western blot
- Agitar as amostras, misturar uma solução de 0,6 ml de etanol absoluto e 0,3 ml de vacina e centrifugar (13.000 x g, 30 min à temperatura ambiente, 25 °C).
- Transfira o sobrenadante da solução para um tubo limpo e dissolva o precipitado com 0,3 ml de água. Obter as soluções sobrenadante e precipitada (nanoemulsão em branco e vacina) após o tratamento com etanol absoluto e solução de água destilada, e realizar a mesma diluição de 50 vezes.
- Misturar 2,5 ml de gel de separação A e 2,5 ml de gel de separação B (ver Tabela de Materiais), adicionar 50 μL de persulfato de amónio a 10% e colocar rapidamente a solução na placa de vidro com uma pipeta. Misturar 1 ml de gel concentrado A e 1 ml de gel concentrado B, adicionar 20 μL de persulfato de amónio a 10% na placa de vidro, introduzir um pente de tamanho adequado e aguardar a solidificação.
- Adicionar um total de 5 μL de solução tampão de carga proteica de 5x à amostra diluída obtida na etapa 3.5.2 e ferver a amostra durante 5 minutos.
- Adicionar 10 μL de proteína aquecida ao poço correspondente e adicionar 5 μL de marcador de proteína ao poço marcador.
- Conecte o eletrodo, ligue o medidor de eletroforese (veja Tabela de Materiais) e ajuste a tensão para 300 V. Desligue a energia quando a eletroforese atingir 1 cm de distância da parte inferior da borracha PAGE.
- Retire o gel e enxágue com ddH2O. Adicione a solução corante G-250 azul brilhante Coomassie (ver Tabela de Materiais) por 10 min. Despeje a solução corante e enxágue o gel duas vezes com ddH2O.
- Adicione a solução de descoloração disponível comercialmente e leve ao micro-ondas o gel por 1 min. Agite o gel por 10 minutos e troque repetidamente a solução de descoloração até que o fundo do gel esteja claro. Em seguida, execute imagens em gel (consulte Tabela de Materiais).
NOTA: O western blot foi pré-processado, conforme descrito nas etapas 3.5.1-3.5.6. - Mergulhe três blocos de papel de filtro com um tampão de transferência de eletroforese. Mergulhe a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) em metanol por 30 s e transfira com um instrumento de transferência de gel semi-seco (duas camadas de papel de filtro, membrana de PVDF, gel de eletroforese e uma camada de papel de filtro). Use uma tensão de 23 V para transferir a membrana por 23 min.
- Remova a membrana de PVDF e lave uma vez com solução salina tamponada tris-Tween 20 (TBST) após a transferência.
- Colocar a membrana de PVDF em solução de vedação (solução de leite em pó desnatado a 5%) e selar durante a noite a 4 °C.
- Retire a membrana de PVDF e lave três vezes com TBST ou 10 min cada.
- Incubar com o anticorpo primário (de camundongos imunizados com soro positivo). Diluir o anticorpo primário11 (ver Tabela de Materiais) para ser testado 500 vezes (100 vezes) com TBST. Coloque a membrana de PVDF bloqueada no anticorpo primário e incube a 37 °C durante 1 h.
- Retire a membrana de PVDF e lave três vezes com TBST por 10 min cada.
- Incubar com o anticorpo secundário (ver Tabela de Materiais). Anticorpo secundário diluído de fosfatase alcalina (AP) de cabra anti-camundongo 5.000 vezes com TBST. Colocar a membrana de PVDF no anticorpo secundário e incubar a 37 °C durante 40 minutos.
- Retire a membrana de PVDF e lave quatro vezes com TBST por 10 min cada.
- Submergir as membranas de PVDF em uma mistura (apenas o suficiente para embeber a membrana) do substrato AP nitro azul tetrazólio (NBT) e BCIP (5-bromo-4-cloro-3'-indolifosfato sal de p-toluidina) (ver Tabela de Materiais) para coloração. O resultado positivo é roxo.
NOTA: Os resultados devem ser uma faixa roxa clara e a tira de amostra e o peso molecular do antigénio devem estar na mesma posição rotulada.
4. Avaliação da resposta imune de anticorpos a essa vacina após administração intramuscular
NOTA: Os camundongos foram imunizados por injeção intramuscular da vacina de nanoemulsão após um relatório publicado11. Os camundongos receberam PBS como controle negativo. Após 1 semana de término de três imunizações, o soro foi coletado dos camundongos11. Os níveis séricos de IgG e as subclasses de IgG1, IgG2a e IgG2b foram determinados quantitativamente por ensaio imunoenzimático (ELISA).
- Revestimento antigénico: Diluir o antigénio da proteína HI a 10 μg/ml com solução de revestimento e adicionar à placa de ELISA a 100 μL/poço. Incubar a 4 °C durante a noite.
NOTA: A solução de revestimento é preparada dissolvendo 1,6 g de carbonato de sódio anidro e 2,9 g de bicarbonato de sódio em 1 L de água deionizada. - Vedação: Lave a placa (três ciclos, cada ciclo 300 μL). Adicionar 300 μL da solução de vedação a cada poço e selar os poços durante 2 h a 37 °C.
NOTA: A solução de selagem é preparada pela adição de Tween-20 e albumina de soro bovino (BSA) ao PBS. O teor de BSA na solução PBST é de 1%. - Diluição do soro: Diluir a amostra de soro de camundongos 100 vezes com PBST (tomar 3 μL de soro e adicioná-lo a 297 μL de PBST e vórtice) e usar 100 μL para cada amostra de soro. Diluir o soro positivo e o soro de controle negativo 100 vezes com PBST adicionando 4 μL a 396 μL de PBST, misturando em seguida por vórtice.
- Diluição de dupla proporção: Adicionar 200 μL do soro experimental diluído acima à primeira fileira da placa ELISA revestida e adicionar 100 μL de PBST a todos os poços, exceto à primeira e à12ª linhas. Efectuar uma diluição 1:2 sucessivamente a partir da primeira fileira: ajustar a pipeta para 100 μL, transferir 100 μL da primeira fileira para a segunda fileira e misturar com a pipeta 10 vezes.
- Diluir o soro para a linha 11 em proporções múltiplas e descartar 100 μL de líquido.
- Adicionar soro negativo e positivo diluído aos poços correspondentes na linha 12 de acordo com o modelo de amostra (ver Tabela 1)-100 μL/poço.
- Selar as placas de ELISA com filme plástico e incubar a 37 °C por 1 h.
- Diluir o anticorpo secundário anti-IgG-HRP de rato (ver Tabela de Materiais) com PBST a 1:10.000.
- Lave a placa (três ciclos, cada ciclo 300 μL). Em seguida, adicionar 100 μL do anticorpo secundário diluído a cada poço e incubar a placa a 37 °C por 40 min.
- Coloração e terminação: Lave a placa (cinco ciclos, cada ciclo 300 μL). Adicionar solução corante de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) (100 μL; ver Tabela de Materiais) a cada poço. Colocar as placas a 37 °C durante 10 minutos longe da luz e, em seguida, terminar imediatamente a reacção com 50 μL de 2 M H2SO4.
- Detectar o valor da densidade óptica (OD 450) por um marcador enzimático (leia o valor OD450 dentro de 15 minutos após o término).
5. Avaliação dos efeitos in vivo das novas vacinas adjuvantes
NOTA: O efeito protetor desta vacina de nanoemulsão foi avaliado em um modelo de camundongo letal MRSA252 obtido comercialmente (ver Tabela de Materiais). De acordo com os resultados anteriores do nosso grupo de pesquisa14, 1 x10 8 unidades formadoras de colônias (UFC)/camundongo é a melhor dose para avaliar o efeito protetor do modelo letal de infecção bacteriana MRSA252.
- Recuperação de deformação: Obter um tubo de MRSA252 congelado, inocular as bactérias em placas Mueller Hinton (MH) (A) (ver Tabela de Materiais) pelo "método de três linhas" e cultivar durante a noite a 37 °C. Execute as etapas do "método de três linhas" conforme mencionado abaixo:
- Segurando o anel de inoculação na mão direita, cauterize-o e resfrie-o para obter um anel de líquido bacteriano.
- Segure a placa de ágar na mão esquerda (mantendo a tampa sobre a mesa) acima da área frontal esquerda da chama da lâmpada de álcool para que a placa fique voltada para a chama, impedindo que as bactérias entrem no ar. Com a mão direita, mova o anel de inoculação de bactérias infectadas para frente e para trás na superfície do ágar de forma densa, mas não sobreposta, cobrindo uma área de aproximadamente 1/5-1/6 de toda a placa, que é a primeira zona.
NOTA: O anel de inoculação e o ágar devem estar em contato suave em um ângulo de 30°-40°; Danificar o ágar pode ser evitado deslizando com a força do pulso. - Cauterizar o excesso de bactérias no anel de inoculação (se deve cauterizar ou esterilizar cada área depende da quantidade de bactérias no espécime). Após esfriar, repita a penúltima linha 2-3 no final e desenhe uma segunda área (cerca de 1/4 da área da placa).
- Depois que a segunda zona terminar, cauterize o anel e desenhe a terceira zona da mesma forma para preencher toda a placa.
- Depois que as linhas forem traçadas, coloque a placa na tampa da placa, marque a placa e incube em uma incubadora a 37 °C por 18-24 h para observar a distribuição das colônias na superfície do ágar. Concentre a atenção se uma única colônia está isolada e observe as características da colônia (como tamanho, forma, transparência e pigmentação).
- Ativação bacteriana: No dia seguinte, tomar dois frascos agitadores de 50 mL e adicionar 20 mL de meio MH (B) (ver Tabela de Materiais) a cada um. Escolha duas colônias simples com uma ponta de pipeta de 10 μL e adicione-as aos agitadores. Incubar as colónias durante a noite a 220 rpm a 37 °C.
- Ativação secundária: No dia seguinte, tomar dois frascos agitadores de 50 mL, cada um contendo 20 mL de meio MH (B). Retirar 200 μL de solução bacteriana do agitador contendo as primeiras bactérias ativadas, adicionar aos dois novos frascos contendo 20 mL de meio MH (B) e incubar a 37 °C e 220 rpm por 5 h.
- Recolher a segunda solução bacteriana activada num tubo de centrifugação de 50 ml, separar a 3.000 x g durante 20 minutos e eliminar o sobrenadante.
- Ressuspender as bactérias precipitadas em 40 mL de solução salina.
- Medir o valor OD600 da solução bacteriana e ajustar para 1 com soro fisiológico. Neste momento, a quantidade bacteriana de MRSA252 em nosso experimento foi de 2 x 109 UFC/mL.
- Diluir a solução bacteriana com um OD600 de 1 para uma concentração de 1 x 109 UFC/ml.
- Divida aleatoriamente 48 camundongos Balb/c em quatro grupos (n=12).
LEGENDA: Grupo I: grupo PBS; Grupo II: grupo controle do NEC; Grupo III: grupo antígeno [proteína] virgen; Grupo IV: grupo vacinal adjuvante em nanoemulsão. - Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%.
- Irradiar os ratos com uma lâmpada de fisioterapia infravermelha (ver Tabela de Materiais) durante aproximadamente 1 minuto para causar vasodilatação da veia caudal.
- Desafiar os ratinhos com a injeção da solução bacteriana diluída (passo 5.7) na veia da cauda, 100 μL por rato.
- Coloque os ratos sob a lâmpada de fisioterapia infravermelha até que eles possam retornar à atividade normal.
- Observar e registrar a sobrevivência de camundongos a cada 12 h por 10 dias.
- Eutanasiar os camundongos que sobreviveram ao ataque por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%.
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Representative Results
Avaliou-se o protocolo de preparação da vacina adjuvante em nanoemulsão e os testes in vitro e in vivo desta vacina. MET, AFM e DLS foram usados para determinar as características importantes do potencial zeta e do tamanho de partícula na superfície desta amostra (Figura 1). SDS-PAGE e western blotting mostraram que a quantidade de antígeno no precipitado e sobrenadante não se degradou significativamente após a centrifugação, o que indicou que a vacina estava estruturalmente intacta, específica e imunogênica (Figura 2). A vacina adjuvante em nanoemulsão aumentou significativamente os títulos totais de anticorpos IgG, IgG1 e IgG 2a. A imunogenicidade da vacina melhorou significativamente (Figura 3A-C). Os valores séricos de IgG2b OD a 450 nm do grupo antígeno foram os mais altos (diluídos a 1:500 PBS) (Figura 3D). O modelo letal MRSA252 camundongo refletiu mais diretamente que a vacina adjuvante em nanoemulsão mostrou um bom efeito protetor e inibiu efetivamente a infecção bacteriana com MRSA252, melhorando a taxa de sobrevivência dos camundongos infectados (Figura 4).
Figura 1: Características físicas da nova vacina adjuvante em nanoemulsão . (A) Micrografia eletrônica de transmissão. (B) Microscopia de força atômica. (C) Tamanho diâmetro e distribuição. (D) Potencial Zeta e distribuição. A figura é reproduzida de Sun, H. W. et al. 10, 7275-7290 (2015)11. Publicado originalmente e usado com permissão da Dove Medical Press Ltd. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estabilidade física da nova vacina adjuvante em nanoemulsão . (A) Integridade estrutural das proteínas antigênicas. (B) Especificidade estrutural da proteína antigênica. Faixa 3: sobrenadante branco tratado com nanoemulsão; Faixa 4: precipitado de tratamento em nanoemulsão em branco; Faixa 5: marcador pré-configurado; Faixa 6: sobrenadante da vacina; Faixa 7: precipitado vacinal; Faixa 8: sobrenadante do tratamento vacinal; Faixa 9: precipitado do tratamento vacinal; Faixa 10: agente proteico nativo; (A) e (B) termo misto. Canais de proteína claramente definidos são marcados por quadrados pretos. Setas pretas indicam proteínas antigênicas. A figura é reproduzida de Sun, H. W. et al. 10, 7275-7290 (2015)11. Publicado originalmente e usado com permissão da Dove Medical Press Ltd.Sun et al.
Figura 3: Níveis de anticorpos IgG e seu subgrupo após injeção intramuscular com a vacina adjuvante em nanoemulsão . (A) Valor logarítmico2 dos títulos de IgG. (B) Densidade óptica de 450 nm da IgG1 sérica. (C) Densidade óptica de 450 nm da IgG2a sérica. (D) densidade óptica de 450 nm de IgG2b sérica. A figura é reproduzida de Sun, H. W. et al. 10, 7275-7290 (2015)11. Publicado originalmente e usado com permissão da Dove Medical Press Ltd. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeito protetor no modelo letal de infecção bacteriana MRSA252. A razão de sobrevivência de camundongos em resposta à infecção sistêmica por MRSA. A figura é reproduzida de Sun, H. W. et al. 10, 7275-7290 (2015)11. Publicado originalmente e usado com permissão da Dove Medical Press Ltd. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Sequência de picos de ELISA e molde de diluição. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
A IsdB, uma proteína de superfície bacteriana ancorada na parede celular e regulada pelo ferro, desempenha um papel importante no processo de obtenção do ferro heme15. A Hla, toxina alfa, está entre as toxinas bacterianas mais eficazes conhecidas em MRSA, podendo formar poros em células eucarióticas e interferir na adesão e nas células epiteliais16. Em nosso estudo, uma nova proteína antigênica (HI) de MRSA de recombinação foi construída e expressa com tecnologia de engenharia gênica baseada nos genes de antígenos de IsdB e Hla. Em seguida, uma vacina em nanoemulsão foi desenvolvida pelo método de emulsificação de baixa energia, e a estabilidade e eficácia dessa vacina foram avaliadas. Por exemplo, algumas características, como estabilidade a longo prazo, estrutura, forma, absorção e efeito in vivo, são muito afetadas pelo tamanho da gota de emulsão7. Os resultados mostraram que o tamanho das partículas foi um importante fator que afeta o transporte de nanoemulsões in vivo e sua fagocitose por células apresentadoras deantígenos17. Em relação à citofagocitose, nanopartículas menores que 1 μm são mais facilmente fagocitadas por células dendríticas (DCs) e macrófagos e são as mais propensas a estimular a imunidade sistêmica18.
Em relação ao transporte de partículas, nanopartículas menores que 100 nm têm maior probabilidade de serem transmitidas através de vasos linfáticos para aumentar o efeito imunológico; entretanto, pequenas nanopartículas infiltram-se nos vasos sanguíneos, enquanto as grandes nanopartículas diminuem sua velocidade de transporte nos vasos linfáticos19. Assim, o tamanho ideal da partícula está na faixa de 20-50 nm. Assim, é fundamental estudar as características físicas das nanopartículas, incluindo forma, tamanho e potencial zeta. O MET, com sua alta precisão, tornou-se uma ferramenta importante e básica para o entendimento das propriedades de vacinas adjuvantes em nanoemulsão. Além disso, a tecnologia tem sido amplamente aplicada em muitos campos por vários anos. Outra ferramenta de caracterização nanomecânica com informações de alta resolução em 3D e nanoescala, AFM, também foi utilizada para avaliar a vacina em nanoemulsão13. É importante ressaltar que o DLS, que revela simultaneamente o tamanho e a carga20, pode fornecer informações importantes, como o estado de agregação de partículas vacinais em nanoemulsão em solução. De acordo com a literatura, um alto valor de potencial zeta é indispensável para a estabilidade física e química de suspensões coloidais, pois uma grande força repulsiva frequentemente impede a agregação causada por eventuais colisões com nanopartículas adjacentes. Portanto, em nossa pesquisa, montamos esses esquemas e avaliamos suas propriedades físicas e químicas com MET, AFM e DLS.
As vacinas proteicas desempenham um papel importante na prevenção e tratamento das principais doenças infecciosas21. As vacinas proteicas desenvolveram-se rapidamente nos últimos anos, mas subsistem sérios desafios na eficácia e persistência imunológicas. As razões fundamentais para isso são a baixa estabilidade proteica, o pequeno coeficiente de distribuição, a meia-vida biológica curta dos antígenos e as altas taxas de depuração in vivo22. Neste protocolo, a estabilidade da nova vacina em nanoemulsão foi avaliada, e nenhuma degradação antigênica foi observada por SDS-PAGE ou western blot.
Uma vacina proteica segura, eficaz e comercializável deve ser complementada com um adjuvante imune apropriado para aumentar significativamente a imunogenicidade do antígeno proteico e o tipo de resposta imune protetora20 para obter a proteção imunológica vacinal ideal. O nível de anticorpos estimulado por uma vacina proteica está entre os indicadores importantes para a prevenção e tratamento efetivos da infecção, e o título de anticorpos é um índice importante para avaliar se o novo adjuvante de nanoemulsão pode melhorar a imunogenicidade do antígeno nu. Novos adjuvantes imunes podem estimular significativamente o corpo a aumentar os níveis de resposta imune humoral e celular, e enriquecer os tipos de resposta imune e eficácia imunoprotetora das vacinas é uma importante direção de desenvolvimento e o componente de pesquisas futuras e o desenvolvimento de novas vacinas23. Portanto, neste protocolo, títulos de anticorpos de IgG sérico-específico, IgG1, IgG2a e IgG2b de camundongos com a nova vacina adjuvante em nanoemulsão foram detectados. O modelo letal de camundongo24 é o padrão-ouro para avaliação de vacinas, e em nosso protocolo, um modelo letal MRSA252 camundongo foi utilizado para avaliar o efeito protetor. Os resultados mostraram que a nova vacina adjuvante em nanoemulsão efetivamente melhorou a taxa de sobrevivência de camundongos Balb/c infectados com MRSA.
Este protocolo não é suficiente na avaliação da estabilidade de vacinas em nanoemulsão. O dicroísmo circular é um método adequado se puder ser aplicado para detectar a estrutura espacial de proteínas vacinais em um método simples e rápido. Embora a taxa de sobrevivência dos camundongos testados pelo ataque seja o padrão-ouro para avaliar o teste in vivo e a eficácia da vacina, seria mais convincente se a quantidade de colonização bacteriana dos órgãos dos camundongos após o ataque pudesse ser medida. Portanto, ainda existem algumas lacunas no presente protocolo para avaliar a resposta imune da vacina adjuvante em nanoemulsão, e o experimento acima precisa ser complementado em experimentos relevantes subsequentes para avaliação.
Em conclusão, é necessário estabelecer uma série de avaliações das propriedades físicas, estabilidade, resposta imune específica e proteção ao desafio. A conclusão desses esquemas fornecerá fundamentos experimentais vitais para a aplicação e desenvolvimento de novas vacinas adjuvantes em nanoemulsão.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo No. 2021YFC2302603 do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China, No. 32070924 e 32000651 do NSFC, e No. 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
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