Summary
Den foreliggende protokollen forbereder og evaluerer de fysiske egenskapene, immunresponsen og in vivo beskyttende effekten av en ny nanoemulsjonsadjuvant vaksine.
Abstract
Nanoemulsjon adjuvante vaksiner har tiltrukket seg omfattende oppmerksomhet på grunn av sin lille partikkelstørrelse, høy termisk stabilitet og evne til å indusere valide immunresponser. Imidlertid er det viktig å etablere en rekke omfattende protokoller for å evaluere immunresponsen til en ny nanoemulsjonsadjuvant vaksine. Derfor inneholder denne artikkelen en streng prosedyre for å bestemme de fysisk-kjemiske egenskapene til en vaksine (ved transmisjonselektronmikroskopi [TEM], atomkraftmikroskopi [AFM] og dynamisk lysspredning [DLS]), stabiliteten til vaksineantigenet og systemet (ved en høyhastighets sentrifugetest, en termodynamisk stabilitetstest, SDS-PAGE og western blot) og den spesifikke immunresponsen (IgG1, IgG2a og IgG2b). Ved hjelp av denne tilnærmingen kan forskere nøyaktig evaluere den beskyttende effekten av en ny nanoemulsjonsadjuvant vaksine i en dødelig MRSA252 musemodell. Med disse protokollene kan den mest lovende nanoemulsjonsvaksineadjuvansen med hensyn til effektivt adjuvanspotensial identifiseres. I tillegg kan metodene bidra til å optimalisere nye vaksiner for fremtidig utvikling.
Introduction
Meticillinresistente gule stafylokokker (MRSA) er et opportunistisk patogen med en av de høyeste infeksjonsratene i en intensivavdeling (ICU) avdeling1, kardiologiske avdelinger og brannavdelinger over hele verden. MRSA viser høy forekomst av infeksjon, dødelighet og bred legemiddelresistens, noe som gir store vanskeligheter i klinisk behandling2. I den globale prioriteringslisten over antibiotikaresistente bakterier utgitt av Verdens helseorganisasjon (WHO) i 2017, ble MRSA oppført i den mest kritiske kategorien3. Det haster derfor med en vaksine mot MRSA-infeksjon.
Aluminiumadjuvans har vært brukt i lang tid, og den adjuvante hjelpemekanismen er relativt klar, sikker, effektiv og godt tolerert4. Aluminiumadjuvanser er for tiden en mye brukt type adjuvans. Det er generelt antatt at antigener adsorbert på aluminiumsaltpartikler kan forbedre stabiliteten og forbedre injeksjonsstedets evne til å ta opp antigener, noe som gir god absorpsjon og langsom frigjøring5. For tiden er den største ulempen med aluminiumadjuvanser at de mangler en adjuvans effekt eller bare utviser en svak adjuvant effekt på noen vaksinekandidatantigener6. I tillegg induserer aluminiumadjuvanser IgE-medierte hypersensitivitetsreaksjoner5. Derfor er det nødvendig å utvikle nye hjelpestoffer for å stimulere en sterkere immunrespons.
Nanoemulsjonsadjuvanser er kolloidale dispersjonssystemer sammensatt av olje, vann, overflateaktive midler og kosurfaktanter7. I tillegg er hjelpestoffene termodynamisk stabile og isotrope, kan autoklaveres eller stabiliseres ved høyhastighets sentrifugering, og kan dannes spontant under milde prepareringsforhold. Flere emulsjonsadjuvanser (som MF59, NB001-002-serien, AS01-04-serien, etc.) er for tiden på markedet eller i klinisk forskningsstadium, men deres partikkelstørrelser er større enn 160 nm8. Derfor kan fordelene ved medisinske preparater på nanoskala (1-100 nm) (dvs. stort spesifikt overflateareal, liten partikkelstørrelse, overflateeffekt, høy overflateenergi, liten størrelseseffekt og makrokvantetunneleffekt) ikke utnyttes fullt ut. I denne protokollen har en ny adjuvans basert på nanoemulsjonsteknologi med en diameterstørrelse på 1-100 nm blitt rapportert å vise god adjuvans aktivitet9. Vi testet rekombinasjon subenhet vaksine antigen protein HI (α-hemolysin mutant [Hla] og Fe ion overflatebestemmende faktor B [IsdB] subenhet N2 aktivt fragment fusjonsprotein); En rekke prosedyrer ble etablert for å undersøke de fysiske egenskapene og stabiliteten, evaluere den spesifikke antistoffresponsen etter intramuskulær administrering, og teste den beskyttende effekten av vaksinen ved hjelp av en systemisk infeksjonsmodell fra mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøkene ble utført basert på håndboken om bruk og stell av forsøksdyr og ble godkjent av Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee ved Third Military Medical University. Kvinnelige Balb / c mus, 6-8 uker gamle, ble brukt til denne studien. Dyrene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell).
1. Fremstilling av MRSA HI antigenprotein
- Oppnå IsdB- og Hla-kloner fra kommersielle kilder (se materialtabell), utfør polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifisering for å amplifisere IsdB- og Hla-gener, og ligere produktene deres til PGEX-6P-2-plasmidet (oppnådd kommersielt; se materialtabell). Skjerm med vektor XL/blå stamme av Escherichia coli10.
- Transformer den positive klonen til E. coli BL21 kompetente celler (se materialtabell) og forsterk med haikultur10.
- Uttrykk antigenet og isolat etter induksjon med isopropyl-β-D-1-merkaptogalaktopyranosid og multimodal kromatografi (MMC) isolatsett11 (se materialfortegnelse).
- Karakteriser antigenproteinet og rens det med en fullautomatiseringsrenser11.
- Affinitetsrensende gutation S-transferase (GST)-merkede proteiner fra clearede lysater ved bruk av en kommersielt tilgjengelig affinitetskromatografiharpiks (se materialtabellen).
- Rens de rekombinante proteinene med MMC11.
- Fjern endotoksinet med Triton X-114 faseseparasjonsmetode11. Bland kort 1 % Triton X-114 med rekombinant proteineluat ved 0 °C i 5 minutter for å sikre en homogen løsning, og inkuber ved 37 °C i 5 minutter for å la to faser dannes.
- Bruk bakteriell endotoksin testmetode11 med skilpaddesett (se tabell over materialer) for å oppdage endotoksinkonsentrasjonen. Endotoksinet for proteinantigen er 0,06 EU/μg, lavere enn den internasjonale standarden (1,5 EU/μg)10.
- Utfør en interferenstest for å eliminere testproduktets mulige påvirkning på endotoksindeteksjon11.
MERK: I henhold til vedlegg 2020 til kinesisk farmakopé12 skal endotoksininnholdet være mindre enn 5 EU/dose. Sensitiviteten til Limuluslysat (λ0,25 EU/ml) og det maksimale effektive fortynningsforholdet på 33,3 ble beregnet12 basert på MVD = cL/λ, der L er grenseverdien for bakteriell endotoksin for testartikkelen, c er konsentrasjonen av testartikkelløsningen, og når L uttrykkes i EU/m, er c lik 1,0 mg/ml. λ er den merkede følsomheten (EU/ml) til hesteskokrabbereagenset i gelmetoden.
- Utfør en interferenstest for å eliminere testproduktets mulige påvirkning på endotoksindeteksjon11.
- Rekombiner antigenet (48 kDa, bestemt ved 12 % natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese [SDS-PAGE]) ved 1,5 mg/ml i sterilt vann uten endotoksin eller fosfatbufret saltvann (PBS) (natriumdikloratmetode)11.
MERK: Proteinets topptid var 13.843 min, renheten var 99.4% (High-performance liquid chromatography method), og proteinet ble lagret ved -70 °C10. Genomisk DNA ekstrahert fra S. aureus-stamme MRSA252 (se materialliste) ble brukt som PCR-mal. IsdB-genet ble amplifisert ved hjelp av forward primer 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 og omvendt primer 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. Hla-genet ble amplifisert ved hjelp av den fremre primeren PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) og omvendt primer PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC).
2. Fremstilling av nanoemulsjonsvaksinen
- I henhold til masseforholdet 1: 6: 3 (w / w), tilsett tre typer hjelpestoffer i rekkefølge (isopropylmyristat, polyoksyetylen ricinusolje og propylenglykol; se materialtabell) til HI antigen proteinoppløsning (10 mg / ml) og rør godt. Tilsett deretter gradvis sterilisert rent vann for å nå et endelig volum på 10 ml og rør ved 500 rpm og 25 °C i ca. 20 minutter.
MERK: Nanoemulsjonen fremstilt i denne protokollen har et volum på 10 ml, og massene av de tre hjelpestoffene er henholdsvis 0, 34 g, 2 g og 1 g. Proteinløsningen her er arbeidsløsningen, 10 ganger konsentrasjonen av den endelige løsningen. - Forbered nanoemulsjonsadjuvansvaksinen (1 mg / ml protein) ved lav-energi emulgering metoder13 for å oppnå en klar og gjennomsiktig flytende løsning.
MERK: Den blanke nanoemulsjonen (BNE) ble fremstilt ved lignende metoder, bortsett fra at vann ble erstattet med HI. Den vanlige emulgeringsmetoden innebærer oppvarming av ytre og indre faser til ca. 80 ° C for emulgering og deretter omrøring og avkjøling av dem gradvis. I denne prosessen forbrukes en stor mengde energi, og til slutt oppnås emulsjonen.
3. Fysisk karakterisering og stabilitet av nanoemulsjonsadjuvansvaksinen
- Partikkelstørrelse, zetapotensial og polymerdispersjonsindekskarakterisering (PDI).
- Forbered 100 μL av nanoemulsjonsadjuvansvaksinen og fortynn 50 ganger med vann til injeksjon. Tilsett 2 ml prøve for deteksjon.
- Observer partikkelstørrelsene, zetapotensialet og PDI ved 25 °C ved hjelp av en Nano Zetasizer (ZS; se materialtabell).
- Transmisjonselektronmikroskopi (TEM)
- Fortynn 10 μL nanoemulsjonsvaksine 50 ganger med vann, legg på et karbonbelagt 100-mesh kobbergitter, og flekk med 1% fosfotungstisk syre (se materialtabell) i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern overflødig fosfotungstisk syreoppløsning med filterpapir.
- Observer morfologien under et transmisjonselektronmikroskop (se materialtabell). Undersøk om de ferdige produktene er nesten stabile og sirkulære innenfor elektronmikroskopets synsfelt og om de har god spredning.
- Skanning elektronmikroskopi (SEM)
- Fortynn 10 μL av nanoemulsjonsadjuvansvaksinen 50 ganger med vann, slipp 10 μL fortynnede prøver på en silisiumskive og sett i en 37 ° C termostatstyrt inkubator i 24 timer.
- Spray det tilberedte platina på silisiumet i 40 s og avkjøl til romtemperatur.
- Observer de morfologiske egenskapene til de preparerte prøvene under et høyoppløselig skanningelektronmikroskop (se materialtabell). Bestem om prøvene er nesten stabile, sfæriske og godt spredt innenfor synsfeltet under elektronmikroskopet.
- Morfologisk stabilitet
- Plasser 1 ml nanoemulsjonsvaksineprøver i mikrosentrifugerør, og vurder stabiliteten til ferske prøver ved sentrifugering i 30 minutter ved 13.000 x g ved romtemperatur (25 °).
- Observer utseendet til disse ferske prøvene og utfør deretter en termodynamisk stabilitetstest av seks temperatursykluser (en syklus: oppbevares ved 4 °C i 48 timer, 25 °C i 48 timer og 37 °C i 48 timer).
- Etter sentrifugering, la prøvene stå i 15 minutter for å avgjøre om det er en Tyndall-effekt (om prøven er klar og gjennomsiktig under lys) og om demulgering har skjedd (vist ved klar stratifisering etter demulgering).
- SDS-PAGE og western blot
- Rist prøvene, bland en oppløsning på 0,6 ml absolutt etanol og 0,3 ml vaksine, og sentrifuge (13 000 x g, 30 min ved romtemperatur, 25 °C).
- Overfør oppløsningens supernatant til et rent rør og oppløs bunnfallet med 0,3 ml vann. Oppnå supernatant- og utfellingsløsninger (både blank nanoemulsjon og vaksine) etter behandling med absolutt etanol og destillert vannoppløsning, og utfør samme 50 ganger fortynning.
- Bland 2,5 ml separasjonsgel A og 2,5 ml separasjonsgel B (se materialfortegnelse), tilsett 50 μL 10% ammoniumpersulfat, og legg raskt løsningen i glassplaten med en pipette. Bland 1 ml konsentrert gel A og 1 ml konsentrert gel B, tilsett 20 μL 10% ammoniumpersulfat i glassplaten, sett inn en passende størrelse kam og vent på størkning.
- Tilsett totalt 5 μL 5x proteinbelastningsbufferløsning til den fortynnede prøven oppnådd i trinn 3.5.2, og kok prøven i 5 minutter.
- Tilsett 10 μL oppvarmet protein til den tilsvarende brønnen, og tilsett 5 μL proteinmarkør til markørbrønnen.
- Koble elektroden, slå på elektroforesemåleren (se materialtabell), og juster spenningen til 300 V. Slå av strømmen når elektroforesen når 1 cm fra bunnen av PAGE-gummien.
- Fjern gelen og skyll med ddH2O. Tilsett Coomassie lyseblå G-250 fargeløsning (se materialfortegnelse) i 10 minutter. Hell ut fargeløsningen, og skyll gelen to ganger med ddH2O.
- Tilsett den kommersielt tilgjengelige avfargingsløsningen og mikrobølgeovn gelen i 1 min. Rist gelen i 10 minutter, og bytt avfargingsløsningen gjentatte ganger til gelbakgrunnen er klar. Deretter utfører du gelavbildning (se Materialfortegnelse).
MERK: Western blot ble forhåndsbehandlet, som beskrevet i trinn 3.5.1-3.5.6. - Bløtlegg tre filterpapirblokker med en elektroforeseoverføringsbuffer. Bløtlegg polyvinylidenfluoridmembranen (PVDF) i metanol i 30 sekunder og overfør med et halvtørt geloverføringsinstrument (to lag filterpapir, PVDF-membran, elektroforesegel og ett lag filterpapir). Bruk en spenning på 23 V for å overføre membranen i 23 minutter.
- Fjern PVDF-membranen og vask en gang med tris-bufret saltvann-Tween 20 (TBST) etter overføring.
- Plasser PVDF-membranen i tetningsoppløsning (5 % skummetmelkpulveroppløsning) og forsegl over natten ved 4 °C.
- Fjern PVDF-membranen og vask tre ganger med TBST eller 10 minutter hver.
- Inkubere med det primære antistoffet (fra immuniserte mus med positivt serum). Fortynn det primære antistoffet11 (se materialfortegnelsen) som skal testes 500 ganger (100 ganger) med TBST. Plasser den blokkerte PVDF-membranen i det primære antistoffet og inkuber ved 37 °C i 1 time.
- Fjern PVDF-membranen og vask tre ganger med TBST i 10 minutter hver.
- Inkuber med det sekundære antistoffet (se Materialfortegnelse). Fortynn alkalisk fosfatase (AP) -merket geit anti-mus sekundært antistoff 5,000 ganger med TBST. Plasser PVDF-membranen i det sekundære antistoffet og inkuber ved 37 °C i 40 minutter.
- Fjern PVDF-membranen og vask fire ganger med TBST i 10 minutter hver.
- Senk PVDF-membranene i en blanding (akkurat nok til å suge membranen) av AP-substratet nitroblå tetrazol (NBT) og BCIP (5-brom-4-klor-3'-indolyfosfat p-toluidinsalt) (se materialtabell) for farging. Et positivt resultat er lilla.
MERK: Resultatene må være et klart lilla bånd, og prøvestrimmelen og molekylvekten til antigenet skal være i samme merkede posisjon.
4. Vurdering av antistoffimmunrespons mot denne vaksinen etter intramuskulær administrering
MERK: Musene ble immunisert ved intramuskulær injeksjon av nanoemulsjonsvaksinen etter en publisert rapport11. Musene ble administrert PBS som en negativ kontroll. På 1 uke etter at tre immuniseringer var fullført, ble serum samlet fra musene11. Serumnivåene av IgG og subklasser av IgG1, IgG2a og IgG2b ble kvantitativt bestemt ved enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).
- Antigenbelegg: Fortynn HI-proteinantigen til 10 μg / ml med beleggoppløsning og tilsett ELISA-platen ved 100 μL / brønn. Inkuber ved 4 °C over natten.
MERK: Beleggoppløsningen fremstilles ved å oppløse 1,6 g vannfritt natriumkarbonat og 2,9 g natriumbikarbonat i 1 liter avionisert vann. - Tetting: Vask platen (tre sykluser, hver syklus 300 μL). Tilsett 300 μl av tetningsløsningen til hver brønn, og forsegle brønnene i 2 timer ved 37 °C.
MERK: Tetningsløsningen fremstilles ved å tilsette Tween-20 og bovint serumalbumin (BSA) til PBS. Innholdet av BSA i PBST-løsningen er 1%. - Serumfortynning: Fortynn serumprøven fra mus 100 ganger med PBST (ta 3 μL serum og tilsett det til 297 μL PBST og vortex), og bruk 100 μL for hver serumprøve. Fortynn det positive serumet og det negative kontrollserumet 100 ganger med PBST ved å tilsette 4 μL til 396 μL PBST, og bland deretter med vortexing.
- Fortynning med dobbeltforhold: Tilsett 200 μL av det ovenfor fortynnede eksperimentelle serumet til den første raden av den belagte ELISA-platen, og tilsett 100 μL PBST til alle brønner unntatt første og 12. rad. Utfør en 1:2-fortynning suksessivt fra første rad: juster pipetten til 100 μL, overfør 100 μL fra første rad til andre rad, og bland med pipetten 10 ganger.
- Fortynn serumet til rad 11 i flere forhold og kast 100 μL væske.
- Tilsett fortynnet negativt og positivt serum til de tilsvarende brønnene i rad 12 i henhold til prøvemalen (se tabell 1)-100 μL/brønn.
- Forsegl ELISA-platene med plastfolie og inkuber ved 37 °C i 1 time.
- Fortynn sekundært antistoff anti-mus IgG-HRP (se materialfortegnelse) med PBST ved 1:10 000.
- Vask platen (tre sykluser, hver syklus 300 μL). Deretter tilsettes 100 μL av det fortynnede sekundære antistoffet til hver brønn, og inkuberer platen ved 37 °C i 40 minutter.
- Farging og avslutning: Vask platen (fem sykluser, hver syklus 300 μL). Tilsett 3,3′,5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) fargeløsning (100 μL; se materialfortegnelse) til hver brønn. Plasser platene ved 37 °C i 10 minutter borte fra lys, og avslutt deretter reaksjonen umiddelbart med 50 μL 2 MH 2SO4.
- Oppdag den optiske tetthetsverdien (OD 450) med en enzymmarkør (les OD450-verdien innen 15 minutter etter avslutning).
5. Evaluering av in vivo-effektene av de nye adjuvante vaksinene
MERK: Den beskyttende effekten av denne nanoemulsjonsvaksinen ble evaluert i en kommersielt oppnådd dødelig MRSA252 musemodell (se materialtabellen). Ifølge de tidligere resultatene fra vår forskningsgruppe 14, er 1 x10 8 kolonidannende enheter (CFU) / mus den beste dosen for å evaluere den beskyttende effekten av den dødelige modellen for MRSA252 bakteriell infeksjon.
- Stammegjenoppretting: Få et rør med frosne MRSA252, inokuler bakteriene på Mueller Hinton (MH) (A) plater (se materialtabell) ved "tre-linjers metode", og kultur over natten ved 37 ° C. Utfør trinnene i "tre-linjers metoden" som nevnt nedenfor:
- Hold inokulasjonsringen i høyre hånd, cauterize og avkjøl den for å oppnå en ring av bakteriell væske.
- Hold agarplaten i venstre hånd (hold lokket på bordet) over det fremre venstre området av flammen til alkohollampen slik at platen vender mot flammen, slik at bakteriene ikke kommer inn i luften. Med høyre hånd flytter du inokulasjonsringen av infiserte bakterier frem og tilbake på agaroverflaten på en tett, men ikke-overlappende måte, som dekker et område på omtrent 1/5-1/6 av hele platen, som er den første sonen.
MERK: Inokulasjonsringen og agaren skal være i forsiktig kontakt i en 30 ° -40 ° vinkel; Skade på agar kan unngås ved å glide med håndleddskraft. - Cauterize de overskytende bakteriene på inokulasjonsringen (om du skal cauterize eller sterilisere hvert område, avhenger av mengden bakterier i prøven). Etter avkjøling, gjenta de nest siste radene 2-3 på slutten og tegn et annet område (omtrent 1/4 av plateområdet).
- Etter at den andre sonen er ferdig, cauterize ringen, og tegne den tredje sonen på samme måte for å fylle hele platen.
- Etter at linjene er trukket, legg platen på lokket på fatet, merk platen og inkuber i en 37 ° C inkubator i 18-24 timer for å observere fordelingen av kolonier på agaroverflaten. Fokuser oppmerksomheten på om en enkelt koloni er isolert, og observer koloniegenskaper (som størrelse, form, gjennomsiktighet og pigmentering).
- Bakteriell aktivering: Ta neste dag to 50 ml shakerflasker og tilsett 20 ml MH (B) medium (se materialfortegnelse) til hver. Velg to enkeltkolonier med en 10 μL pipettespiss og legg dem til shakerne. Inkuber koloniene over natten ved 220 o / min ved 37 ° C.
- Sekundær aktivering: Ta neste dag to 50 ml shakerflasker, hver med 20 ml MH (B) medium. Fjern 200 μL bakteriell oppløsning fra shakeren som inneholder de første aktiverte bakteriene, tilsett de to nye kolbene som inneholder 20 ml MH (B) medium, og inkuber ved 37 °C og 220 rpm i 5 timer.
- Samle den andre aktiverte bakterielle løsningen i et 50 ml sentrifugerør, separat ved 3000 x g i 20 minutter, og kast supernatanten.
- Resuspender de utfelte bakteriene i 40 ml saltvann.
- Mål OD600-verdien av bakterieløsningen og juster til 1 med saltvann. På dette tidspunktet var bakteriemengden MRSA252 i vårt eksperiment 2 x 109 CFU / ml.
- Fortynn bakterieoppløsningen med en OD600 på 1 til en konsentrasjon på 1 x 109 CFU / ml.
- Del tilfeldig 48 Balb/c mus inn i fire grupper (n = 12).
MERK: Gruppe I: PBS-gruppe; Gruppe II: BNE kontrollgruppe; Gruppe III: naiv antigen [protein] gruppe; Gruppe IV: nanoemulsjon adjuvant vaksine gruppe. - Bedøv musene ved intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg av 1% pentobarbitalnatrium.
- Bestråle musene med en infrarød fysioterapilampe (se materialfortegnelse) i ca. 1 min for å forårsake vasodilatasjon av halevenen.
- Utfordre musene med injeksjon av den fortynnede bakterieoppløsningen (trinn 5.7) i halevenen, 100 μL per mus.
- Plasser musene under den infrarøde fysioterapilampen til de kan gå tilbake til normal aktivitet.
- Observer og registrer overlevelse av mus hver 12. time i 10 dager.
- Avlive musene som overlevde angrepet ved intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg av 1% natriumpentobarbital.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen for fremstilling av nanoemulsjonsadjuvant vaksine og in vitro og in vivo tester av denne vaksinen ble evaluert. TEM, AFM og DLS ble brukt til å bestemme de viktige egenskapene til zetapotensialet og partikkelstørrelsen på overflaten av denne prøven (figur 1). SDS-PAGE og western blotting viste at mengden antigen i bunnfallet og supernatanten ikke ble signifikant nedbrutt etter sentrifugering, noe som indikerte at vaksinen var strukturelt intakt, spesifikk og immunogen (figur 2). Nanoemulsjonsadjuvansvaksinen økte signifikant de totale IgG-, IgG1- og IgG2a-antistofftitere. Immunogeniteten til vaksinen ble signifikant forbedret (figur 3A-C). Serum-IgG2b OD-verdiene ved 450 nm i antigengruppen var høyest (fortynnet ved 1:500 PBS) (figur 3D). Den dødelige MRSA252 musemodellen reflekterte mest direkte at nanoemulsjonsadjuvansvaksinen viste en god beskyttende effekt og effektivt hemmet bakteriell infeksjon med MRSA252, noe som forbedret overlevelsesraten for infiserte mus (figur 4).
Figur 1: Fysiske egenskaper av den nye nanoemulsjonsadjuvante vaksinen . (A) Transmisjonselektronmikrograf. (B) Atomkraftmikroskopi mikrograf. (C) Størrelse, diameter og fordeling. (D) Zeta potensial og distribusjon. Figuren er gjengitt fra Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Opprinnelig publisert av og brukt med tillatelse fra Dove Medical Press Ltd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fysisk stabilitet av den nye nanoemulsjonsadjuvante vaksinen . (A) Strukturell integritet av antigene proteiner. (B) Strukturell spesifisitet av antigenproteinet. Lane 3: blank nanoemulsjonsbehandlet supernatant; Lane 4: blank nanoemulsjonsbehandling utfelling; Lane 5: prestained markør; Lane 6: vaksine supernatant; Lane 7: vaksine bunnfall; Lane 8: vaksinebehandling supernatant; Lane 9: vaksinebehandling bunnfall; Lane 10: innfødt proteinmiddel; (A) og (B) blandet begrep. Klart definerte proteinkanaler er preget av svarte firkanter. Svarte piler indikerer antigene proteiner. Figuren er gjengitt fra Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Opprinnelig publisert av og brukt med tillatelse fra Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: IgG og dets subgruppeantistoffnivåer etter intramuskulær injeksjon med nanoemulsjonsadjuvant vaksine. (A) Log2-verdien av IgG-titerne. (B) 450 nm optisk tetthet av serum IgG1. (C) 450 nm optisk tetthet av serum IgG2a. (D) 450 nm optisk tetthet av serum IgG2b. Figuren er gjengitt fra Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Opprinnelig publisert av og brukt med tillatelse fra Dove Medical Press Ltd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Beskyttende effekt i den dødelige modellen for MRSA252 bakteriell infeksjon. Overlevelsesforholdet mellom mus som respons på systemisk MRSA-infeksjon. Figuren er gjengitt fra Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Opprinnelig publisert av og brukt med tillatelse fra Dove Medical Press Ltd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: ELISA-piggsekvens og fortynningsmal. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IsdB, et bakteriecelleveggforankret og jernregulert overflateprotein, spiller en viktig rolle i prosessen med å skaffe hemejern15. Hla, alfatoksin, er blant de mest effektive bakterietoksinene som er kjent i MRSA, og kan danne porer i eukaryote celler og forstyrre adhesjon og epitelceller16. I vår studie ble et nytt rekombinasjon MRSA-antigenprotein (HI) konstruert og uttrykt med genteknologisk teknologi basert på antigengenene til IsdB og Hla. Deretter ble en nanoemulsjonsvaksine utviklet ved lavenergiemulgeringsmetoden, og stabiliteten og effektiviteten til denne vaksinen ble evaluert. For eksempel påvirkes noen egenskaper, som langsiktig stabilitet, struktur, form, absorpsjon og effekt in vivo, sterkt av størrelsen på emulsjonsdråpen7. Resultatene viste at partikkelstørrelse var en viktig faktor som påvirker transporten av nanoemulsjoner in vivo og deres fagocytose av antigenpresenterende celler17. Når det gjelder cytofagocytose, blir nanopartikler mindre enn 1 μm lettere fagocytosert av dendrittiske celler (DC) og makrofager og er mest sannsynlig å stimulere systemisk immunitet18.
Når det gjelder partikkeltransport, er nanopartikler mindre enn 100 nm mer sannsynlig å bli overført gjennom lymfekar for å forbedre immuneffekten; Imidlertid infiltrerer små nanopartikler inn i blodkar, mens store nanopartikler reduserer transporthastigheten i lymfekar19. Dermed er den optimale partikkelstørrelsen i området 20-50 nm. Derfor er det viktig å studere de fysiske egenskapene til nanopartikler, inkludert form, størrelse og zetapotensial. TEM, med sin høye presisjon, har blitt et viktig og grunnleggende verktøy for å forstå egenskapene til nanoemulsjonsadjuvante vaksiner. I tillegg har teknologien vært mye brukt på mange felt i flere år. Et annet nanomekanisk karakteriseringsverktøy med 3D og nanoskala høyoppløselig informasjon, AFM, ble også brukt til å evaluere nanoemulsjonsvaksinen13. Det er viktig at DLS, som samtidig avslører både størrelse og ladning20, kan gi nøkkelinformasjon, for eksempel aggregeringstilstanden til nanoemulsjonsvaksinepartikler i oppløsning. Ifølge litteraturen er en høy zeta-potensiell verdi uunnværlig for den fysiske og kjemiske stabiliteten til kolloidale suspensjoner, da en stor frastøtende kraft ofte forhindrer aggregering forårsaket av sporadiske kollisjoner med tilstøtende nanopartikler. Derfor, i vår forskning, satte vi opp disse ordningene og evaluerte deres fysiske og kjemiske egenskaper med TEM, AFM og DLS.
Proteinvaksiner spiller en viktig rolle i forebygging og behandling av store infeksjonssykdommer21. Proteinvaksiner har utviklet seg raskt de siste årene, men det gjenstår alvorlige utfordringer i immuneffekt og utholdenhet. De grunnleggende årsakene til dette er dårlig proteinstabilitet, liten distribusjonskoeffisient, kort biologisk halveringstid for antigener og høye clearancerater in vivo22. I denne protokollen ble stabiliteten til den nye nanoemulsjonsvaksinen evaluert, og ingen antigennedbrytning ble observert av SDS-PAGE eller western blot.
En sikker, effektiv og salgbar proteinvaksine må suppleres med en egnet immunadjuvans for signifikant å øke immunogeniteten til proteinantigenet og typen beskyttende immunrespons20 for å oppnå optimal immunbeskyttelse mot vaksinen. Antistoffnivået stimulert av en proteinvaksine er blant de viktige indikatorene for effektiv forebygging og behandling av infeksjon, og antistofftiteren er en viktig indeks for å vurdere om den nye nanoemulsjonsadjuvansen kan forbedre immunogeniteten til det nakne antigenet. Nye immunhjelpestoffer kan stimulere kroppen betydelig til å forbedre humorale og cellulære immunresponsnivåer, og berikelse av typer immunrespons og immunbeskyttende effekt av vaksiner er en viktig utviklingsretning og komponenten i fremtidig forskning og utvikling av nye vaksiner23. Derfor ble antistofftitere av museserumspesifikke IgG, IgG1, IgG2a og IgG2b med den nye nanoemulsjonsadjuvansvaksinen i denne protokollen detektert. Den dødelige musemodellen24 er gullstandarden for evaluering av vaksiner, og i vår protokoll ble en dødelig MRSA252 musemodell brukt til å evaluere den beskyttende effekten. Resultatene viste at den nye nanoemulsjonsadjuvante vaksinen effektivt forbedret overlevelsesraten for Balb / c-mus infisert med MRSA.
Denne protokollen er ikke tilstrekkelig i stabilitetsevalueringen av nanoemulsjonsvaksiner. Sirkulær dikroisme er en egnet metode hvis den kan brukes til å oppdage den romlige strukturen til vaksineproteiner på en enkel og rask metode. Selv om overlevelsesgraden for mus testet av angrepet er gullstandarden for evaluering av in vivo-testen og effektiviteten av vaksinen, ville det være mer overbevisende om mengden bakteriell kolonisering av musens organer etter angrep kunne måles. Derfor er det fortsatt noen mangler i denne protokollen for å evaluere immunresponsen til nanoemulsjonsadjuvansvaksinen, og ovennevnte eksperiment må suppleres i etterfølgende relevante eksperimenter for evaluering.
Avslutningsvis er det nødvendig å etablere en rekke evalueringer av fysiske egenskaper, stabilitet, spesifikk immunrespons og utfordringsbeskyttelse. Gjennomføring av disse ordningene vil gi viktige eksperimentelle grunnleggende for anvendelse og utvikling av nye nanoemulsjonsadjuvante vaksiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter i dette arbeidet.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av nr. 2021YFC2302603 fra National Key Research and Development Program of China, nr. 32070924 og 32000651 av NSFC, og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 av Natural Science Foundation Project Program of Chongqing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia. , China Medical Science and Technology Press. Beijing. 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D.
- Saeed, K., et al.
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J.
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
