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Immunology and Infection

Évaluation de la réponse immunitaire d’un vaccin adjuvant à base de nanoémulsion contre l’infection à Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65152
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

Summary

Le présent protocole prépare et évalue les propriétés physiques, la réponse immunitaire et l’effet protecteur in vivo d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion.

Abstract

Les vaccins adjuvants à base de nanoémulsion ont attiré beaucoup d’attention en raison de leur petite taille de particules, de leur stabilité thermique élevée et de leur capacité à induire des réponses immunitaires valides. Cependant, il est essentiel d’établir une série de protocoles complets pour évaluer la réponse immunitaire d’un nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion. Par conséquent, cet article présente une procédure rigoureuse pour déterminer les caractéristiques physico-chimiques d’un vaccin (par microscopie électronique à transmission [MET], microscopie à force atomique [AFM] et diffusion dynamique de la lumière [DLS]), la stabilité de l’antigène et du système vaccinaux (par un test de centrifugeuse à grande vitesse, un test de stabilité thermodynamique, SDS-PAGE et Western blot), et la réponse immunitaire spécifique (IgG1, IgG2a et IgG2b). En utilisant cette approche, les chercheurs peuvent évaluer avec précision l’effet protecteur d’un nouveau vaccin adjuvant de nanoémulsion dans un modèle murin MRSA252 mortel. Avec ces protocoles, l’adjuvant de vaccin nanoémulsion le plus prometteur en termes de potentiel adjuvant efficace peut être identifié. En outre, les méthodes peuvent aider à optimiser les nouveaux vaccins pour le développement futur.

Introduction

Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) est un pathogène opportuniste avec l’un des taux d’infection les plus élevés dans les unités de soins intensifs (USI) des services 1, les services de cardiologie et lesservices de brûlures du monde entier. Le SARM présente des taux élevés d’infection, de mortalité et de résistance générale aux médicaments, ce qui présente de grandes difficultés dans le traitement clinique2. Dans la liste prioritaire mondiale des bactéries résistantes aux antibiotiques publiée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) en 2017, le SARM figurait dans la catégorie3 la plus critique. Un vaccin contre l’infection à SARM est donc nécessaire de toute urgence.

L’adjuvant d’aluminium est utilisé depuis longtemps et le mécanisme auxiliaire de l’adjuvant est relativement clair, sûr, efficace et bien toléré4. Les adjuvants à base d’aluminium sont actuellement un type d’adjuvant largement utilisé. On croit généralement que les antigènes adsorbés sur les particules de sel d’aluminium peuvent améliorer la stabilité et renforcer la capacité du site d’injection à absorber les antigènes, assurant une bonne absorption et une libération lente5. Actuellement, le principal inconvénient des adjuvants d’aluminium est qu’ils n’ont pas d’effet adjuvant ou ne présentent qu’un faible effet adjuvant sur certains antigènes candidats vaccins6. De plus, les adjuvants d’aluminium induisent des réactions d’hypersensibilité médiées par les IgE5. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouveaux adjuvants pour stimuler une réponse immunitaire plus forte.

Les adjuvants de nanoémulsion sont des systèmes de dispersion colloïdale composés d’huile, d’eau, de tensioactifs et de cosurfactants7. De plus, les adjuvants sont thermodynamiquement stables et isotropes, peuvent être autoclavés ou stabilisés par centrifugation à grande vitesse et peuvent se former spontanément dans des conditions de préparation douces. Plusieurs adjuvants d’émulsion (tels que MF59, série NB001-002, série AS01-04, etc.) sont actuellement sur le marché ou au stade de la recherche clinique, mais leur taille de particules est supérieure à 160 nm8. Par conséquent, les avantages des préparations médicinales à l’échelle nanométrique (1-100 nm) (c.-à-d. grande surface spécifique, petite taille de particules, effet de surface, énergie de surface élevée, effet de petite taille et effet tunnel macro-quantique) ne peuvent pas être pleinement exploités. Dans le protocole actuel, un nouvel adjuvant basé sur la technologie de nanoémulsion d’un diamètre de 1 à 100 nm a été signalé comme présentant une bonne activité adjuvante9. Nous avons testé la protéine antigénique du vaccin sous-unitaire de recombinaison HI (mutant de la α-hémolysine [Hla] et protéine de fusion de fragments actifs de la sous-unité N2 déterminant la surface des ions Fe ; Une série de procédures ont été établies pour examiner les propriétés physiques et la stabilité, évaluer sa réponse anticorps spécifique après administration intramusculaire et tester l’effet protecteur du vaccin à l’aide d’un modèle d’infection systémique chez la souris.

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Protocol

Les expériences sur les animaux ont été menées sur la base du manuel sur l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité de bien-être et d’éthique des animaux de laboratoire de la troisième Université médicale militaire. Des souris Balb/c femelles, âgées de 6 à 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).

1. Préparation de la protéine antigénique SARM HI

  1. Obtenir des clones IsdB et Hla à partir de sources commerciales (voir le tableau des matériaux), effectuer une amplification par amplification par amplification par polymérase en chaîne (PCR) pour amplifier les gènes IsdB et Hla, et ligaturer leurs produits sur le plasmide PGEX-6P-2 (obtenu commercialement; voir le tableau des matériaux). Criblage avec la souche vectorielle Xl/bleue d’Escherichia coli10.
  2. Transformer le clone positif en cellules compétentes pour E. coli BL21 (voir le tableau des matériaux) et l’amplifier avec la culture de requins10.
  3. Exprimer l’antigène et l’isoler après induction avec des trousses d’isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside et d’isolat de chromatographie multimodale (MMC)11 (voir le tableau des matériaux).
  4. Caractériser la protéine antigénique et la purifier avec un purificateur à automatisation complète11.
    1. Protéines marquées par affinité par gutathion S-transférase (GST) à partir de lysats clairs à l’aide d’une résine de chromatographie d’affinité disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
    2. Purifier les protéines recombinantes par MMC11.
    3. Éliminer l’endotoxine par la méthode de séparation de phase Triton X-11411. Brièvement, mélanger le Triton X-114 à 1% avec l’éluat de protéine recombinante à 0 °C pendant 5 min pour assurer une solution homogène, et incuber à 37 °C pendant 5 min pour permettre la formation de deux phases.
  5. Utiliser la méthode d’essai des endotoxines bactériennes11 avec les trousses Turtle (voir le tableau des matières) pour détecter la concentration d’endotoxines. L’endotoxine pour l’antigène protéique est de 0,06 EU/μg, inférieure à la norme internationale (1,5 EU/μg)10.
    1. Effectuer un test d’interférence pour éliminer l’influence possible du produit d’essai sur la détection des endotoxines11.
      REMARQUE: Selon l’annexe 2020 de la pharmacopée chinoise12, la teneur en endotoxines doit être inférieure à 5 EU / dose. La sensibilité du lysat de Limulus (λ0,25 EU/mL) et le taux de dilution effectif maximal de 33,3 ont été calculés12 sur la base de MVD = cL/λ, où L est la valeur limite de l’endotoxine bactérienne pour l’objet d’essai, c est la concentration de la solution de l’objet d’essai, et lorsque L est exprimé en EU/m, c est égal à 1,0 mg/mL. λ est la sensibilité marquée (EU/mL) du réactif en fer à cheval dans la méthode du gel.
  6. Recombiner l’antigène (48 kDa, déterminé par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium à 12 % [SDS-PAGE]) à 1,5 mg/mL dans de l’eau stérile sans endotoxine ni solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (méthode au dichlorate de sodium)11.
    NOTE: Le temps de pointe de la protéine était de 13,843 min, la pureté était de 99,4% (méthode de chromatographie liquide à haute performance) et la protéine a été stockée à -70 ° C10. L’ADN génomique extrait de la souche MRSA252 de S. aureus (voir le tableau des matériaux) a été utilisé comme modèle de PCR. Le gène IsdB a été amplifié à l’aide de l’amorce avant 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
    C-39 et l’amorce inversée 59-TTTTCCTTTTGCGG
    CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGCTTC-39. Le gène Hla a été amplifié à l’aide de l’amorce avant PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) et de l’amorce inverse PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
    CAATTTGTCATTTCTTC).

2. Préparation du vaccin à base de nanoémulsion

  1. Selon le rapport massique de 1:6:3 (p/p), ajouter trois types d’excipients en séquence (myristate d’isopropyle, huile de ricin de polyoxyéthylène et propylène glycol; voir le tableau des matières) à la solution protéique de l’antigène HI (10 mg/mL) et bien agiter. Ensuite, ajouter de l’eau pure stérilisée graduellement pour atteindre un volume final de 10 ml et agiter à 500 rpm et 25 °C pendant environ 20 min.
    REMARQUE: La nanoémulsion préparée dans ce protocole a un volume de 10 mL, et les masses des trois excipients sont de 0,34 g, 2 g et 1 g, respectivement. La solution protéique ici est la solution de travail, 10 fois la concentration de la solution finale.
  2. Préparer le vaccin adjuvant de nanoémulsion (1 mg/mL de protéines) par des méthodes d’émulsification à basse énergie13 pour obtenir une solution liquide claire et transparente.
    NOTE: La nanoémulsion à blanc (BNE) a été préparée par des méthodes similaires, sauf que l’eau a été remplacée par HI. La méthode habituelle d’émulsification consiste à chauffer les phases externe et interne à environ 80 °C pour l’émulsification, puis à les agiter et à les refroidir progressivement. Dans ce processus, une grande quantité d’énergie est consommée, et finalement, l’émulsion est obtenue.

3. Caractérisation physique et stabilité du vaccin adjuvant à base de nanoémulsion

  1. Taille des particules, potentiel zêta et caractérisation de l’indice de dispersion des polymères (PDI).
    1. Préparer 100 μL du vaccin adjuvant à base de nanoémulsion et diluer 50 fois avec de l’eau pour injection. Ajouter 2 mL d’échantillon pour la détection.
    2. Observez la taille des particules, le potentiel zêta et le PDI à 25 °C à l’aide d’un Nano Zetasizer (ZS; voir Tableau des matériaux).
  2. Microscopie électronique à transmission (MET)
    1. Diluer 10 μL de vaccin à nanoémulsion 50 fois avec de l’eau, placer sur une grille de cuivre de 100 mailles recouverte de carbone et colorer avec de l’acide phosphotungstique à 1 % (voir le tableau des matières) pendant 5 minutes à température ambiante.
    2. Retirer l’excès de solution d’acide phosphotungstique avec du papier filtre.
    3. Observez la morphologie au microscope électronique à transmission (voir le tableau des matériaux). Examiner si les produits finis sont presque stables et circulaires dans le champ de vision du microscope électronique et s’ils présentent une bonne dispersion.
  3. Microscopie électronique à balayage (MEB)
    1. Diluer 50 μL du vaccin adjuvant nanoémulsion avec de l’eau, déposer 10 μL d’échantillons prédilués sur une plaquette de silicium et placer dans un incubateur contrôlé par thermostat à 37 °C pendant 24 h.
    2. Vaporiser le platine préparé sur le silicium pendant 40 s et laisser refroidir à température ambiante.
    3. Observer les propriétés morphologiques des échantillons préparés au microscope électronique à balayage à haute résolution (voir le tableau des matériaux). Déterminer si les échantillons sont presque stables, sphériques et bien dispersés dans le champ de vision au microscope électronique.
  4. Stabilité morphologique
    1. Placer 1 mL d’échantillons de vaccin à nanoémulsion dans des tubes à microcentrifugation, et évaluer la stabilité des échantillons frais par centrifugation pendant 30 min à 13 000 x g à température ambiante (25°).
    2. Observer l’aspect de ces échantillons frais puis effectuer un test de stabilité thermodynamique de six cycles de température (un cycle : conserver à 4 °C pendant 48 h, 25 °C pendant 48 h et 37 °C pendant 48 h).
    3. Après centrifugation, laisser reposer les échantillons pendant 15 minutes pour déterminer s’il y a un effet Tyndall (si l’échantillon est clair et transparent sous la lumière) et si la désémulsification s’est produite (indiquée par une stratification claire après désémulsification).
  5. SDS-PAGE et Western blot
    1. Agiter les échantillons, mélanger une solution de 0,6 mL d’éthanol absolu et 0,3 mL de vaccin, et centrifuger (13 000 x g, 30 min à température ambiante, 25 °C).
    2. Transférer le surnageant de la solution dans un tube propre et dissoudre le précipité avec 0,3 mL d’eau. Obtenir les solutions surnageantes et précipitées (nanoémulsion vierge et vaccin) après traitement avec de l’éthanol absolu et une solution d’eau distillée, et effectuer la même dilution 50 fois.
    3. Mélanger 2,5 mL de gel de séparation A et 2,5 mL de gel de séparation B (voir le tableau des matières), ajouter 50 μL de persulfate d’ammonium à 10 % et placer rapidement la solution dans la plaque de verre à l’aide d’une pipette. Mélanger 1 mL de gel concentré A et 1 mL de gel concentré B, ajouter 20 μL de persulfate d’ammonium à 10 % dans la plaque de verre, insérer un peigne de taille appropriée et attendre la solidification.
    4. Ajouter au total 5 μL de solution tampon de charge protéique 5x à l’échantillon dilué obtenu à l’étape 3.5.2, et faire bouillir l’échantillon pendant 5 min.
    5. Ajouter 10 μL de protéines chauffées au puits correspondant et ajouter 5 μL de marqueur protéique au puits marqueur.
    6. Connectez l’électrode, allumez l’électrophorèmètre (voir le tableau des matériaux) et réglez la tension à 300 V. Coupez l’alimentation lorsque l’électrophorèse atteint 1 cm du bas du caoutchouc PAGE.
    7. Retirer le gel et rincer avec ddH2O. Ajouter la solution de coloration Coomassie bleu vif G-250 (voir tableau des matières) pendant 10 min. Versez la solution de coloration et rincez le gel deux fois avec ddH2O.
    8. Ajouter la solution de décoloration disponible dans le commerce et cuire le gel au micro-ondes pendant 1 min. Agiter le gel pendant 10 minutes et changer à plusieurs reprises la solution de décoloration jusqu’à ce que le fond du gel soit clair. Ensuite, effectuez l’imagerie sur gel (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Le transfert Western a été prétraité, comme décrit aux étapes 3.5.1 à 3.5.6.
    9. Trempez trois blocs de papier filtre avec un tampon de transfert d’électrophorèse. Faire tremper la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans du méthanol pendant 30 s et transférer avec un instrument de transfert de gel semi-sec (deux couches de papier filtre, membrane PVDF, gel d’électrophorèse et une couche de papier filtre). Utilisez une tension de 23 V pour transférer la membrane pendant 23 min.
    10. Retirez la membrane de PVDF et lavez une fois avec une solution saline tamponnée Tris-Tween 20 (TBST) après le transfert.
    11. Placer la membrane PVDF dans une solution d’étanchéité (solution de lait écrémé en poudre à 5 %) et sceller pendant la nuit à 4 °C.
    12. Retirez la membrane PVDF et lavez trois fois avec TBST ou 10 minutes chacune.
    13. Incuber avec l’anticorps primaire (provenant de souris immunisées avec sérum positif). Diluer l’anticorps primaire11 (voir le tableau des matières) à tester 500 fois (100 fois) avec TBST. Placer la membrane PVDF bloquée dans l’anticorps primaire et incuber à 37 °C pendant 1 h.
    14. Retirez la membrane PVDF et lavez trois fois avec TBST pendant 10 minutes chacune.
    15. Incuber avec l’anticorps secondaire (voir le tableau des matériaux). Diluer 5 000 fois l’anticorps secondaire anti-souris marqué à la phosphatase alcaline (AP) avec TBST. Placer la membrane PVDF dans l’anticorps secondaire et incuber à 37 °C pendant 40 min.
    16. Retirez la membrane PVDF et lavez quatre fois avec TBST pendant 10 minutes chacune.
    17. Immerger les membranes PVDF dans un mélange (juste assez pour faire tremper la membrane) du substrat AP nitro blue tetrazole (NBT) et BCIP (sel de 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine) (voir le tableau des matériaux) pour la coloration. Un résultat positif est violet.
      REMARQUE: Les résultats doivent être une bande violette claire, et la bandelette d’échantillon et le poids moléculaire de l’antigène doivent être à la même position marquée.

4. Évaluation de la réponse immunitaire des anticorps à ce vaccin après administration intramusculaire

REMARQUE : Les souris ont été immunisées par injection intramusculaire du vaccin à nanoémulsion à la suite d’un rapportpublié 11. Les souris ont reçu du PBS comme témoin négatif. À 1 semaine après la fin de trois immunisations, le sérum a été prélevé sur les souris11. Les taux sériques d’IgG et de sous-classes d’IgG1, IgG2a et IgG2b ont été déterminés quantitativement par dosage immunoenzymatique (ELISA).

  1. Revêtement antigénique : Diluer l’antigène de la protéine HI à 10 μg/mL avec une solution d’enrobage et l’ajouter à la plaque ELISA à 100 μL/puits. Incuber à 4 °C pendant une nuit.
    NOTE: La solution d’enrobage est préparée en dissolvant 1,6 g de carbonate de sodium anhydre et 2,9 g de bicarbonate de sodium dans 1 L d’eau désionisée.
  2. Étanchéité : Lavez la plaque (trois cycles, chaque cycle 300 μL). Ajouter 300 μL de solution d’étanchéité à chaque puits et sceller les puits pendant 2 h à 37 °C.
    NOTE: La solution d’étanchéité est préparée en ajoutant du Tween-20 et de l’albumine sérique bovine (BSA) au PBS. La teneur en BSA dans la solution PBST est de 1%.
  3. Dilution sérique : Diluer l’échantillon de sérum de souris 100 fois avec du PBST (prendre 3 μL de sérum et l’ajouter à 297 μL de PBST et de vortex) et utiliser 100 μL pour chaque échantillon de sérum. Diluer le sérum positif et le sérum témoin négatif 100 fois avec du PBST en ajoutant 4 μL à 396 μL de PBST, puis mélanger par vortex.
  4. Dilution à double rapport : Ajouter 200 μL du sérum expérimental dilué ci-dessus à la première rangée de la plaque ELISA revêtue et ajouter 100 μL de PBST à tous les puits, à l’exception de la première et de la 12erangée . Effectuer une dilution 1:2 successivement à partir de la première rangée : régler la pipette à 100 μL, transférer 100 μL de la première rangée à la deuxième rangée et mélanger 10 fois avec la pipette.
  5. Diluer le sérum à la rangée 11 à plusieurs rapports et jeter 100 μL de liquide.
  6. Ajouter le sérum négatif et positif dilué aux puits correspondants de la rangée 12 selon le modèle d’échantillon (voir le tableau 1)-100 μL/puits.
  7. Sceller les plaques ELISA avec une pellicule plastique et incuber à 37 °C pendant 1 h.
  8. Diluer l’anticorps secondaire anti-souris IgG-HRP (voir le tableau des matériaux) avec PBST à 1:10 000.
  9. Laver la plaque (trois cycles, chaque cycle 300 μL). Ensuite, ajouter 100 μL de l’anticorps secondaire dilué à chaque puits, et incuber la plaque à 37 °C pendant 40 min.
  10. Coloration et terminaison : Lavez la plaque (cinq cycles, chaque cycle 300 μL). Ajouter la solution de coloration à la 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) (100 μL; voir le tableau des matières) à chaque puits. Placer les plaques à 37 °C pendant 10 min à l’abri de la lumière, puis terminer immédiatement la réaction avec 50 μL de 2 MH2SO4.
  11. Détecter la valeur de densité optique (OD 450) par un marqueur enzymatique (lire la valeur OD450 dans les 15 minutes suivant la terminaison).

5. Évaluation des effets in vivo des nouveaux vaccins adjuvants

REMARQUE : L’effet protecteur de ce vaccin à nanoémulsion a été évalué dans un modèle murin létal MRSA252 obtenu commercialement (voir le tableau des matériaux). Selon les résultats précédents de notre groupe de recherche14, 1 x 108 unités formant colonies (UFC)/souris est la meilleure dose pour évaluer l’effet protecteur du modèle mortel d’infection bactérienne MRSA252.

  1. Récupération de la souche : Obtenir un tube de MRSA252 congelée, inoculer les bactéries sur des plaques de Mueller Hinton (MH) (A) (voir le tableau des matériaux) par la « méthode des trois lignes » et les cultiver pendant une nuit à 37 °C. Effectuez les étapes de la « méthode à trois lignes » comme mentionné ci-dessous :
    1. En tenant l’anneau d’inoculation dans la main droite, cautériser et refroidir pour obtenir un anneau de liquide bactérien.
    2. Tenez la plaque de gélose dans la main gauche (en gardant le couvercle sur la table) au-dessus de la zone avant gauche de la flamme de la lampe à alcool de sorte que la plaque fasse face à la flamme, empêchant les bactéries de pénétrer dans l’air. Avec la main droite, déplacer l’anneau d’inoculation des bactéries infectées d’avant en arrière sur la surface de la gélose d’une manière dense mais sans chevauchement, couvrant une zone d’environ 1/5-1/6 de la plaque entière, qui est la première zone.
      NOTA : L’anneau d’inoculation et la gélose doivent être en contact doux à un angle de 30°-40°; Endommager la gélose peut être évité en glissant avec la force du poignet.
    3. Cautériser l’excès de bactéries sur l’anneau d’inoculation (la cautérisation ou la stérilisation de chaque zone dépend de la quantité de bactéries dans l’échantillon). Après refroidissement, répétez l’avant-dernière rangée 2-3 à la fin et dessinez une deuxième zone (environ 1/4 de la surface de la plaque).
    4. Une fois la deuxième zone terminée, cautérisez l’anneau et dessinez la troisième zone de la même manière pour remplir toute la plaque.
    5. Une fois les lignes tracées, placez l’assiette sur le couvercle de la boîte, marquez l’assiette et incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 18 à 24 h pour observer la répartition des colonies à la surface de la gélose. Concentrez-vous sur la question de savoir si une seule colonie est isolée et observez les caractéristiques de la colonie (telles que la taille, la forme, la transparence et la pigmentation).
  2. Activation bactérienne : Le lendemain, prenez deux flacons agitateurs de 50 ml et ajoutez 20 mL de milieu MH (B) (voir le tableau des matières) à chacun. Choisissez deux colonies simples avec un embout de pipette de 10 μL et ajoutez-les aux agitateurs. Incuber les colonies pendant une nuit à 220 tr/min à 37 °C.
  3. Activation secondaire : Le lendemain, prendre deux fioles agitatrices de 50 mL, chacune contenant 20 mL de milieu MH (B). Retirer 200 μL de solution bactérienne de l’agitateur contenant les premières bactéries activées, ajouter aux deux nouvelles fioles contenant 20 mL de milieu MH(B) et incuber à 37 °C et 220 rpm pendant 5 h.
  4. Prélever la deuxième solution bactérienne activée dans un tube à centrifuger de 50 mL, séparer à 3 000 x g pendant 20 minutes et jeter le surnageant.
  5. Remettez en suspension les bactéries précipitées dans 40 mL de solution saline.
  6. Mesurer la valeur OD600 de la solution bactérienne et ajuster à 1 avec une solution saline. À ce moment-là, la quantité bactérienne de MRSA252 dans notre expérience était de 2 x 109 UFC / mL.
  7. Diluer la solution bactérienne avec une DO600 de 1 à une concentration de 1 x 109 UFC/mL.
  8. Divisez au hasard 48 souris Balb/c en quatre groupes (n = 12).
    REMARQUE : Groupe I : Groupe PBS; Groupe II: groupe témoin de l’ENB; Groupe III : groupe des antigènes naïfs [protéine]; Groupe IV : groupe de vaccins adjuvants à base de nanoémulsion.
  9. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1%.
  10. Irradier les souris avec une lampe de physiothérapie infrarouge (voir le tableau des matériaux) pendant environ 1 min pour provoquer une vasodilatation de la veine de la queue.
  11. Défiez les souris avec l’injection de la solution bactérienne diluée (étape 5.7) dans la veine de la queue, 100 μL par souris.
  12. Placez les souris sous la lampe de physiothérapie infrarouge jusqu’à ce qu’elles puissent reprendre une activité normale.
  13. Observez et enregistrez la survie des souris toutes les 12 heures pendant 10 jours.
  14. Euthanasier les souris qui ont survécu à l’attaque par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 %.

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Representative Results

Le protocole de préparation du vaccin adjuvant de nanoémulsion et les tests in vitro et in vivo de ce vaccin ont été évalués. La MET, l’AFM et le DLS ont été utilisés pour déterminer les caractéristiques importantes du potentiel zêta et de la taille des particules à la surface de cet échantillon (figure 1). SDS-PAGE et Western blot ont montré que la quantité d’antigène dans le précipité et le surnageant ne se dégradait pas significativement après la centrifugation, ce qui indiquait que le vaccin était structurellement intact, spécifique et immunogène (Figure 2). Le vaccin adjuvant à base de nanoémulsion a considérablement augmenté les titres totaux d’anticorps IgG, IgG1 et IgG 2a. L’immunogénicité du vaccin a été considérablement améliorée (figure 3A-C). Les valeurs sériques d’IgG2b OD à 450 nm du groupe antigénique étaient les plus élevées (diluées à 1:500 PBS) (Figure 3D). Le modèle murin MRSA252 létal reflétait le plus directement que le vaccin adjuvant à base de nanoémulsion avait un bon effet protecteur et inhibait efficacement l’infection bactérienne par MRSA252, améliorant ainsi le taux de survie des souris infectées (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Caractéristiques physiques du nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion. (A) Micrographie électronique à transmission. (B) Microscopie à force atomique. (C) Calibre diamètre et répartition. (D) Potentiel zêta et distribution. La figure est reproduite à partir de Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Publié à l’origine par et utilisé avec la permission de Dove Medical Press Ltd. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Stabilité physique du nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion. (A) Intégrité structurelle des protéines antigéniques. (B) Spécificité structurelle de la protéine antigénique. Voie 3 : surnageant vierge traité à la nanoémulsion; Voie 4: précipité de traitement de nanoémulsion vierge; Voie 5: marqueur précoloré; Voie 6 : surnageant vaccinal; Voie 7 : précipiter le vaccin; Voie 8 : surnageant de traitement vaccinal; Voie 9 : précipiter le traitement vaccinal; Lane 10: agent protéique natif; (A) et (B) terme mixte. Les canaux protéiques clairement définis sont marqués par des carrés noirs. Les flèches noires indiquent les protéines antigéniques. La figure est reproduite à partir de Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Publié à l’origine par et utilisé avec la permission de Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Taux d’anticorps IgG et de son sous-groupe après injection intramusculaire avec le vaccin adjuvant à base de nanoémulsion. (A) Valeur logarithmique2 des titres d’IgG. (B) Densité optique de 450 nm des IgG1 sériques. (C) Densité optique de 450 nm des IgG2a sériques. (D) Densité optique de 450 nm des IgG2b sériques. La figure est reproduite à partir de Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Publié à l’origine par et utilisé avec la permission de Dove Medical Press Ltd. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Effet protecteur dans le modèle létal d’infection bactérienne MRSA252. Le taux de survie des souris en réponse à une infection systémique à SARM. La figure est reproduite à partir de Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Publié à l’origine par et utilisé avec la permission de Dove Medical Press Ltd. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Séquence de pointe ELISA et modèle de dilution. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

IsdB, une protéine de surface ancrée dans la paroi cellulaire bactérienne et régulée par le fer, joue un rôle important dans le processus d’obtention du fer hémique15. Hla, toxine alpha, est parmi les toxines bactériennes les plus efficaces connues dans le SARM, et peut former des pores dans les cellules eucaryotes et interférer avec l’adhésion et les cellules épithéliales16. Dans notre étude, une nouvelle protéine antigénique SARM (IH) de recombinaison a été construite et exprimée avec une technologie de génie génétique basée sur les gènes antigéniques de IsdB et Hla. Ensuite, un vaccin à nanoémulsion a été développé par la méthode d’émulsification à basse énergie, et la stabilité et l’efficacité de ce vaccin ont été évaluées. Par exemple, certaines caractéristiques, telles que la stabilité à long terme, la structure, la forme, l’absorption et l’effet in vivo, sont grandement affectées par la taille de la gouttelette d’émulsion7. Les résultats ont montré que la taille des particules était un facteur important affectant le transport des nanoémulsions in vivo et leur phagocytose par les cellules présentatrices d’antigènes17. En ce qui concerne la cytophagocytose, les nanoparticules inférieures à 1 μm sont plus facilement phagocytées par les cellules dendritiques (DC) et les macrophages et sont les plus susceptibles de stimuler l’immunité systémique18.

En ce qui concerne le transport des particules, les nanoparticules inférieures à 100 nm sont plus susceptibles d’être transmises par les vaisseaux lymphatiques pour renforcer l’effet immunitaire; Cependant, de petites nanoparticules s’infiltrent dans les vaisseaux sanguins, tandis que les grosses nanoparticules ralentissent leur vitesse de transport dans les vaisseaux lymphatiques19. Ainsi, la taille optimale des particules est comprise entre 20 et 50 nm. Par conséquent, il est essentiel d’étudier les caractéristiques physiques des nanoparticules, y compris la forme, la taille et le potentiel zêta. La MET, avec sa haute précision, est devenue un outil important et fondamental pour comprendre les propriétés des vaccins adjuvants à base de nanoémulsion. De plus, la technologie a été largement appliquée dans de nombreux domaines depuis plusieurs années. Un autre outil de caractérisation nanomécanique avec des informations haute résolution à l’échelle 3D et nanométrique, AFM, a également été utilisé pour évaluer le vaccin à nanoémulsion13. Il est important de noter que le DLS, qui révèle simultanément la taille et la charge20, peut fournir des informations clés, telles que l’état d’agrégation des particules de vaccin en nanoémulsion en solution. Selon la littérature, une valeur potentielle zêta élevée est indispensable pour la stabilité physique et chimique des suspensions colloïdales, car une force répulsive importante empêche souvent l’agrégation causée par des collisions occasionnelles avec des nanoparticules adjacentes. Par conséquent, dans nos recherches, nous avons mis en place ces schémas et évalué leurs propriétés physiques et chimiques avec TEM, AFM et DLS.

Les vaccins protéiques jouent un rôle important dans la prévention et le traitement des principales maladies infectieuses21. Les vaccins protéiques se sont développés rapidement ces dernières années, mais de sérieux défis subsistent en matière d’efficacité immunitaire et de persistance. Les raisons fondamentales en sont une faible stabilité des protéines, un faible coefficient de distribution, une courte demi-vie biologique des antigènes et des taux de clairance élevés in vivo22. Dans ce protocole, la stabilité du nouveau vaccin à nanoémulsion a été évaluée et aucune dégradation de l’antigène n’a été observée par SDS-PAGE ou Western blot.

Un vaccin protéique sûr, efficace et commercialisable doit être complété par un adjuvant immunitaire approprié pour améliorer considérablement l’immunogénicité de l’antigène protéique et le type de réponse immunitaire protectrice20 afin d’obtenir la protection immunitaire optimale du vaccin. Le niveau d’anticorps stimulé par un vaccin protéique est l’un des indicateurs importants pour la prévention et le traitement efficaces de l’infection, et le titre d’anticorps est un indice important pour évaluer si le nouvel adjuvant de nanoémulsion peut améliorer l’immunogénicité de l’antigène nu. Les nouveaux adjuvants immunitaires peuvent stimuler considérablement le corps pour améliorer les niveaux de réponse immunitaire humorale et cellulaire, et l’enrichissement des types de réponse immunitaire et de l’efficacité protectrice immunitaire des vaccins est une orientation de développement importante et la composante de la recherche future et du développement de nouveaux vaccins23. Par conséquent, dans ce protocole, des titres d’anticorps d’IgG, d’IgG1, d’IgG2a et d’IgG2b spécifiques au sérum de souris avec le nouveau vaccin adjuvant de nanoémulsion ont été détectés. Le modèle de souris létale24 est l’étalon-or pour évaluer les vaccins, et dans notre protocole, un modèle de souris létale MRSA252 a été utilisé pour évaluer l’effet protecteur. Les résultats ont montré que le nouveau vaccin adjuvant à base de nanoémulsion améliorait efficacement le taux de survie des souris Balb / c infectées par le SARM.

Ce protocole n’est pas suffisant pour évaluer la stabilité des vaccins à nanoémulsion. Le dichroïsme circulaire est une méthode appropriée s’il peut être appliqué pour détecter la structure spatiale des protéines vaccinales par une méthode simple et rapide. Bien que le taux de survie des souris testées par l’attaque soit l’étalon-or pour évaluer le test in vivo et l’efficacité du vaccin, il serait plus convaincant si la quantité de colonisation bactérienne des organes des souris après l’attaque pouvait être mesurée. Par conséquent, il existe encore certaines lacunes dans le protocole actuel pour évaluer la réponse immunitaire du vaccin adjuvant à nanoémulsion, et l’expérience ci-dessus doit être complétée dans des expériences pertinentes ultérieures pour évaluation.

En conclusion, il est nécessaire d’établir une série d’évaluations des propriétés physiques, de la stabilité, de la réponse immunitaire spécifique et de la protection contre les provocations. L’achèvement de ces programmes fournira des principes fondamentaux expérimentaux essentiels pour l’application et le développement de nouveaux vaccins adjuvants à base de nanoémulsion.

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Disclosures

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par le n ° 2021YFC2302603 du Programme national de recherche et de développement clé de la Chine, n ° 32070924 et 32000651 du NSFC et le n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 Eppendorf, Germany  5424000495
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
AFM Dimension FastScan BRUKER, Germany  null
Alcohol lamp Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China YBS-AA-11408
Balb/c mice  Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP/NBT Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA null
BL21 Competent Cell Merck millipore,Germany 70232-3CN
BSA-100G Sigma-Aldrich, USA B2064-100G
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solution MIKX,China DB236
Decolorization solution BOSTER,China AR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China null
Electrophoresis apparatus Beijing Liuyi Instrument Factory, China DYCZ-25D
Gel image Tanon, USA null
Glutathione-Sepharose Resin GST Mei5bio,China affinity chromatography resin
H2SO4 Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China 7664-93-9
HI recombinant protein Third Military Medical University,China 110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgG Biodragon, China BF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1 Biodragon, China BF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2a Biodragon, China BF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2b Biodragon, China BF03004R
Inoculation loop Haimen Feiyue Co.,LTD,China YR-JZH-1UL
IsdB and Hla clones Shanghai Jereh Biotechnology Co,China null
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) SEPPIC, France null
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside fdbio,China FD3278-1
LB bouillon culture-medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-136
Lnfrared physiotherapy lamp Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China 7600
Low temperature refrigerated centrifuge Eppendorf, Germany  null
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK null
MH(A) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-051
MH(B) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-052
Micro plate washing machine 405 LSRS Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USA null
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China 1658030
MMC packing TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD 0022818
MRSA252 USA, ATCC null
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo Scientific, USA null
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit DAKEWE, China 8012011
PBS biosharp, China null
PCR, Amplifier Thermal Cycler, USA null
pGEX-target gene recombinant plasmid Shanghai Jereh Biotechnology Co,China B3528G
Phosphotungstic acid G-CLONE, China CS1231-25g
pipette Eppendorf, Germany  3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) Aladdin, China K400327-1kg
Primary antibody Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera null See Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) Sigma-Aldrich, USA P4347-500ML
Protein Marker Thermo Scientufuc, USA 26616
PVDF TRANSFER MEMBRANE Invitrogen,USA 88518
Scanning Electron Microscope JEOL,Japan JSM-IT800
Sodium pentobarbital Merck,Germany Tc-P8411
Talos L120C TEM Thermo Fisher, USA null
TMB color solution TIAN GEN, China PA107-01
Turtle kits Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD ES80545
Tween-20 Macklin, China 9005-64-5

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 199
Évaluation de la réponse immunitaire d’un vaccin adjuvant à base de nanoémulsion contre l’infection à <em>Staphylococcus aureus</em> résistant à la méthicilline (SARM)
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Zeng, X., Sun, H., Ye, Y., Luo, X., Cai, D., Yang, Y., Chen, T., Sun, C., Zhang, S., Zeng, H. Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection. J. Vis. Exp. (199), e65152, doi:10.3791/65152 (2023).

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