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Immunology and Infection

मेथिसिलिन प्रतिरोधी स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एमआरएसए) संक्रमण के खिलाफ एक नैनोइमल्शन सहायक वैक्सीन की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65152
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक नए नैनोइमल्शन सहायक वैक्सीन के भौतिक गुणों, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और विवो सुरक्षात्मक प्रभाव को तैयार और मूल्यांकन करता है।

Abstract

नैनोइमल्शन सहायक टीकों ने अपने छोटे कण आकार, उच्च थर्मल स्थिरता और वैध प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने की क्षमता के कारण व्यापक ध्यान आकर्षित किया है। हालांकि, एक नोवेल नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए व्यापक प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला स्थापित करना महत्वपूर्ण है। इसलिए, इस लेख में एक वैक्सीन की भौतिक रासायनिक विशेषताओं (ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी [टीईएम], परमाणु बल माइक्रोस्कोपी [एएफएम], और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन [डीएलएस]), वैक्सीन एंटीजन और सिस्टम की स्थिरता (एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूज परीक्षण, एक थर्मोडायनामिक स्थिरता परीक्षण, एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा द्वारा), और विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (आईजीजी 1, आईजीजी 2 ए, और आईजीजी 2 बी)। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, शोधकर्ता एक घातक MRSA252 माउस मॉडल में एक नए नैनोइमल्शन सहायक वैक्सीन के सुरक्षात्मक प्रभाव का सटीक मूल्यांकन कर सकते हैं। इन प्रोटोकॉल के साथ, प्रभावी सहायक क्षमता के मामले में सबसे आशाजनक नैनोइमल्शन वैक्सीन सहायक की पहचान की जा सकती है। इसके अलावा, विधियां भविष्य के विकास के लिए नए टीकों को अनुकूलित करने में मदद कर सकती हैं।

Introduction

मेथिसिलिन प्रतिरोधी स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एमआरएसए) एक अवसरवादी रोगज़नक़ है जो दुनिया भर में एक गहन देखभाल इकाई (आईसीयू) वार्ड1, कार्डियोलॉजी विभागों और बर्न विभागों में उच्चतम संक्रमण दर में से एक है। एमआरएसए संक्रमण, मृत्यु दर और व्यापक दवा प्रतिरोध की उच्च दर प्रदर्शित करता है, जो नैदानिक उपचार में बड़ी कठिनाइयों को प्रस्तुत करताहै। 2017 में विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा जारी एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया की वैश्विक प्राथमिकता सूची में, एमआरएसए को सबसे महत्वपूर्ण श्रेणी3 में सूचीबद्ध किया गया था। इसलिए एमआरएसए संक्रमण के खिलाफ एक टीका तत्काल आवश्यक है।

एल्यूमीनियम सहायक का उपयोग लंबे समय से किया गया है, और सहायक सहायक तंत्र अपेक्षाकृत स्पष्ट, सुरक्षित, प्रभावी और अच्छी तरह से सहन किया जाताहै। एल्यूमीनियम सहायक वर्तमान में एक व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रकार के सहायक हैं। आमतौर पर यह माना जाता है कि एल्यूमीनियम नमक कणों पर अधिशोषित एंटीजन स्थिरता में सुधार कर सकते हैं और एंटीजन को लेने के लिए इंजेक्शन साइट की क्षमता को बढ़ा सकते हैं, अच्छा अवशोषण और धीमी गतिसे रिलीज प्रदान करते हैं। वर्तमान में, एल्यूमीनियम सहायक दवाओं का मुख्य नुकसान यह है कि उनके पास एक सहायक प्रभाव की कमी है या कुछ वैक्सीन उम्मीदवार एंटीजन6 पर केवल एक कमजोर सहायक प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, एल्यूमीनियम सहायक आईजीई-मध्यस्थता अतिसंवेदनशीलताप्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं। इसलिए, एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित करने के लिए नवीन सहायक विकसित करना आवश्यक है।

नैनोइमल्शन सहायक कोलाइडल फैलाव प्रणाली हैं जो तेल, पानी, सर्फेक्टेंट और कोसर्फेक्टेंट7 से बनी होती हैं। इसके अलावा, सहायक थर्मोडायनामिक रूप से स्थिर और आइसोट्रोपिक हैं, उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा आटोक्लेव या स्थिर किए जा सकते हैं, और हल्के तैयारी की स्थिति में अनायास बन सकते हैं। कई इमल्शन सहायक (जैसे एमएफ 59, एनबी001-002 श्रृंखला, एएस01-04 श्रृंखला, आदि) वर्तमान में बाजार में या नैदानिक अनुसंधान चरण में हैं, लेकिन उनके कण आकार 160 एनएम8 से अधिक हैं। इसलिए, नैनोस्केल (1-100 एनएम) औषधीय तैयारी (यानी, बड़े विशिष्ट सतह क्षेत्र, छोटे कण आकार, सतह प्रभाव, उच्च सतह ऊर्जा, छोटे आकार के प्रभाव और मैक्रो क्वांटम टनलिंग प्रभाव) के फायदे पूरी तरह से शोषण नहीं किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, 1-100 एनएम के व्यास आकार के साथ नैनोइमल्शन तकनीक पर आधारित एक नवीन सहायक को अच्छीसहायक गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए रिपोर्ट किया गया है। हमने पुनर्संयोजन सबयूनिट वैक्सीन एंटीजन प्रोटीन एचआई (α-हेमोलिसिन उत्परिवर्ती [एचएलए] और फे आयन सतह निर्धारण कारक बी [आईएसडीबी] सबयूनिट एन 2 सक्रिय टुकड़ा संलयन प्रोटीन) का परीक्षण किया; भौतिक गुणों और स्थिरता की जांच करने, इंट्रामस्क्युलर प्रशासन के बाद इसकी विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने और माउस प्रणालीगत संक्रमण मॉडल का उपयोग करके वैक्सीन के सुरक्षात्मक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला स्थापित की गई थी।

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Protocol

पशु प्रयोग प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग और देखभाल पर मैनुअल के आधार पर आयोजित किए गए थे और तीसरे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला पशु कल्याण और नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे। वर्तमान अध्ययन के लिए 6-8 सप्ताह की मादा बाल्ब / सी चूहों का उपयोग किया गया था। जानवरों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. एमआरएसए एचआई एंटीजन प्रोटीन की तैयारी

  1. वाणिज्यिक स्रोतों से आईएसडीबी और एचएलए क्लोन प्राप्त करें (सामग्री की तालिका देखें), आईएसडीबी और एचएलए जीन को बढ़ाने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रवर्धन करें, और उनके उत्पादों को पीजीईएक्स -6 पी -2 प्लास्मिड (व्यावसायिक रूप से प्राप्त; सामग्री की तालिका देखें) में ले जाएं। एस्चेरिचिया कोलाई10 के वेक्टर एक्सएल /ब्लू स्ट्रेन के साथ स्क्रीन।
  2. सकारात्मक क्लोन को ई कोलाई बीएल 21 सक्षम कोशिकाओं में बदलें ( सामग्री की तालिका देखें) और शार्क कल्चर10 के साथ बढ़ाएं।
  3. एंटीजन को व्यक्त करें और आइसोप्रोपिल-β-डी-1-मर्कैप्टोगैलेक्टोपाइरानोसाइड और मल्टीमॉडल क्रोमैटोग्राफी (एमएमसी) आइसोलेट किट11 के साथ प्रेरण के बाद अलग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. एंटीजन प्रोटीन को चिह्नित करें और इसे पूर्ण-स्वचालन शोधक11 के साथ शुद्ध करें।
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी राल का उपयोग करके साफ किए गए लाइसेट से आत्मीयता-शुद्ध गुटाथियोन एस-ट्रांसफेरेज (जीएसटी) -टैग किए गए प्रोटीन (सामग्री की तालिका देखें)।
    2. एमएमसी11 द्वारा पुनः संयोजक प्रोटीन को शुद्ध करें।
    3. ट्राइटन एक्स -114 चरण पृथक्करण विधि11 द्वारा एंडोटॉक्सिन को हटा दें। संक्षेप में, 1% ट्राइटन एक्स -114 को पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ 5 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं ताकि एक समरूप समाधान सुनिश्चित हो सके, और दो चरणों को बनाने की अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. एंडोटॉक्सिन एकाग्रता का पता लगाने के लिए कछुए किट (सामग्री की तालिका देखें) के साथ बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन परीक्षण विधि11 का उपयोग करें। प्रोटीन एंटीजन के लिए एंडोटॉक्सिन 0.06 EU / μg है, जो अंतरराष्ट्रीय मानक (1.5 EU / μg) 10 से कम है।
    1. एंडोटॉक्सिनका पता लगाने पर परीक्षण उत्पाद के संभावित प्रभाव को खत्म करने के लिए एक हस्तक्षेप परीक्षण करें।
      नोट: चीनी फार्माकोपिया12 के परिशिष्ट 2020 के अनुसार, एंडोटॉक्सिन सामग्री 5 ईयू / खुराक से कम होनी चाहिए। लिम्यूलस लाइसेट की संवेदनशीलता (0.25 EU / mL) और 33.3 के अधिकतम प्रभावी कमजोर पड़ने के अनुपात की गणना MVD = cL / 3 के आधार पर12 की गई थी, जहां L परीक्षण लेख के लिए बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन का सीमा मान है, c परीक्षण लेख समाधान की एकाग्रता है, और जब L को EU / m में व्यक्त किया जाता है, तो c 1.0 mg / mL के बराबर होता है। जेल विधि में घोड़े की नाल केकड़ा अभिकर्मक की लेबल संवेदनशीलता (ईयू / एमएल) है।
  6. एंडोटॉक्सिन या फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (सोडियम डाइक्लोरेट विधि) के बिना बाँझ पानी में 1.5 मिलीग्राम / एमएल पर एंटीजन (48 केडीए, 12% सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन [एसडीएस-पेज]) द्वारा निर्धारित एंटीजन (48 केडीए) को फिर से संयोजित करें।
    नोट: प्रोटीन पीक समय 13.843 मिनट था, शुद्धता 99.4% (उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विधि) थी, और प्रोटीन -70 डिग्री सेल्सियस10 पर संग्रहीत किया गया था। एस ऑरियस स्ट्रेन MRSA252 से निकाले गए जीनोमिक डीएनए ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग पीसीआर टेम्पलेट के रूप में किया गया था। आईएसडीबी जीन को फॉरवर्ड प्राइमर 59-सीजीसीजीजीजीएटीसीएटीजीजीजीएएजी
    सी -39 और रिवर्स प्राइमर 59-टीटीटीसीसीटीटीटीजीसीजी
    सीसीजीसीसीटीएटीजीटीटीएटीसीटीएटीसीटीटीसी -39। एचएलए जीन को फॉरवर्ड प्राइमर पीएचएलएएफ (जीसीजीजीएटीसीसीजीएटीसीटीएटीएटी) और रिवर्स प्राइमर पीएचएलएआर (टीएएजीसीजीजीसीजीजीसीटीटीएटी) का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था।
    सीएएटीसीटीटीटीसी)।

2. नैनोइमल्शन वैक्सीन की तैयारी

  1. 1: 6: 3 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) के द्रव्यमान अनुपात के अनुसार, एचआई एंटीजन प्रोटीन समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) में अनुक्रम में तीन प्रकार के एक्सीपिएंट्स (आइसोप्रोपिल माइरिस्टेट, पॉलीऑक्सीएथिलीन कैस्टर ऑयल और प्रोपलीन ग्लाइकोल; सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और अच्छी तरह से हिलाएं। फिर, 10 एमएल की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए धीरे-धीरे निष्फल शुद्ध पानी जोड़ें और लगभग 20 मिनट के लिए 500 आरपीएम और 25 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में तैयार नैनोइमल्शन में 10 एमएल की मात्रा है, और तीन एक्सीपिएंट्स के द्रव्यमान क्रमशः 0.34 ग्राम, 2 ग्राम और 1 ग्राम हैं। यहां प्रोटीन समाधान काम करने वाला समाधान है, अंतिम समाधान की एकाग्रता का 10 गुना।
  2. एक स्पष्ट और पारदर्शी तरल समाधान प्राप्त करने के लिए कम ऊर्जा पायसीकरण विधियों13 द्वारा नैनोइमल्शन सहायक टीका (1 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन) तैयार करें।
    नोट: रिक्त नैनोइमल्शन (बीएनई) को इसी तरह के तरीकों से तैयार किया गया था, सिवाय इसके कि पानी को एचआई के साथ बदल दिया गया था। सामान्य पायसीकरण विधि में पायसीकरण के लिए बाहरी और आंतरिक चरणों को लगभग 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करना और फिर उन्हें धीरे-धीरे हिलाना और ठंडा करना शामिल है। इस प्रक्रिया में, बड़ी मात्रा में ऊर्जा की खपत होती है, और अंत में, इमल्शन प्राप्त होता है।

3. नैनोइमल्शन सहायक वैक्सीन की भौतिक विशेषता और स्थिरता

  1. कण आकार, ज़ेटा क्षमता, और बहुलक फैलाव सूचकांक लक्षण वर्णन (पीडीआई)।
    1. नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन के 100 μL तैयार करें और इंजेक्शन के लिए पानी के साथ 50 गुना पतला करें। पता लगाने के लिए नमूना के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. नैनो ज़ेटासाइज़र (जेडएस; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 25 डिग्री सेल्सियस पर कण आकार, ज़ेटा क्षमता और पीडीआई का निरीक्षण करें।
  2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)
    1. नैनोइमल्शन वैक्सीन के 10 μL को पानी के साथ 50 गुना पतला करें, कार्बन-लेपित 100-जाल तांबा ग्रिड पर रखें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1% फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ दाग दें।
    2. फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड समाधान को हटा दें।
    3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। जांच ें कि क्या तैयार उत्पाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के दृश्य के क्षेत्र के भीतर लगभग स्थिर और गोलाकार हैं और क्या वे अच्छे फैलाव का प्रदर्शन करते हैं।
  3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम)
    1. नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन के 10 μL को पानी के साथ 50 गुना पतला करें, सिलिकॉन वेफर पर 10 μL प्रीडाइल्यूटेड नमूने गिराएं, और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस थर्मोस्टेट-नियंत्रित इनक्यूबेटर में रखें।
    2. तैयार प्लैटिनम को सिलिकॉन पर 40 सेकंड के लिए स्प्रे करें और कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
    3. एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत तैयार नमूनों के रूपात्मक गुणों का निरीक्षण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। निर्धारित करें कि क्या नमूने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत दृश्य के क्षेत्र के भीतर लगभग स्थिर, गोलाकार और अच्छी तरह से फैले हुए हैं।
  4. रूपात्मक स्थिरता।
    1. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल नैनोइमल्शन वैक्सीन के नमूने रखें, और कमरे के तापमान (25 डिग्री) पर 13,000 एक्स जी पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके ताजा नमूनों की स्थिरता का मूल्यांकन करें।
    2. इन ताजा नमूनों की उपस्थिति का निरीक्षण करें और फिर छह तापमान चक्रों का थर्मोडायनामिक स्थिरता परीक्षण करें (एक चक्र: 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 48 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर)।
    3. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, नमूनों को 15 मिनट तक खड़े रहने की अनुमति दें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या टिंडल प्रभाव है (क्या नमूना प्रकाश के तहत स्पष्ट और पारदर्शी है) और क्या पायसीकरण हुआ है (डीपायसिफिकेशन के बाद स्पष्ट स्तरीकरण द्वारा दिखाया गया है)।
  5. एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा
    1. नमूनों को हिलाएं, पूर्ण इथेनॉल के 0.6 एमएल और वैक्सीन के 0.3 एमएल का घोल मिलाएं, और सेंट्रीफ्यूज (13,000 x g, कमरे के तापमान पर 30 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस)।
    2. घोल के सतह पर तैरनेवाला को एक साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें और अवक्षेप को 0.3 मिलीलीटर पानी के साथ घोलें। पूर्ण इथेनॉल और आसुत जल समाधान के साथ उपचार के बाद सतह पर तैरनेवाला और अवक्षेपित समाधान (रिक्त नैनोइमल्शन और वैक्सीन दोनों) प्राप्त करें, और उसी 50 गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
    3. 2.5 मिलीलीटर पृथक्करण जेल ए और 2.5 मिलीलीटर पृथक्करण जेल बी ( सामग्री की तालिका देखें) मिलाएं, 10% अमोनियम परसल्फेट के 50 μL जोड़ें, और जल्दी से घोल को पिपेट के साथ ग्लास प्लेट में रखें। 1 एमएल केंद्रित जेल ए और 1 एमएल केंद्रित जेल बी मिलाएं, ग्लास प्लेट में 10% अमोनियम परसल्फेट के 20 μL जोड़ें, एक उचित आकार की कंघी डालें, और जमने की प्रतीक्षा करें।
    4. चरण 3.5.2 में प्राप्त पतला नमूने में 5x प्रोटीन लोडिंग बफर समाधान के कुल 5 μL जोड़ें, और नमूने को 5 मिनट के लिए उबालें।
    5. इसी अच्छी तरह से गर्म प्रोटीन के 10 μL जोड़ें, और मार्कर में अच्छी तरह से प्रोटीन मार्कर के 5 μL जोड़ें।
    6. इलेक्ट्रोड को कनेक्ट करें, वैद्युतकणसंचलन मीटर चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें), और वोल्टेज को 300 वी तक समायोजित करें। जब वैद्युतकणसंचलन पेज रबर के नीचे से 1 सेमी दूर पहुंच जाता है तो बिजली बंद कर दें।
    7. जेल निकालें और डीडीएच2ओ से कुल्ला करें। 10 मिनट के लिए कूमासी चमकीले नीले जी -250 धुंधला समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। धुंधला घोल डालें, और जेल को डीडीएच2ओ के साथ दो बार धो लें।
    8. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीकलराइजेशन समाधान जोड़ें और जेल को 1 मिनट के लिए माइक्रोवेव करें। 10 मिनट के लिए जेल को हिलाएं, और जेल पृष्ठभूमि स्पष्ट होने तक बार-बार डिकलराइजेशन समाधान बदलें। फिर, जेल इमेजिंग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: पश्चिमी धब्बा पूर्वसंसाधित किया गया था, जैसा कि चरण 3.5.1-3.5.6 में वर्णित है।
    9. वैद्युतकणसंचलन स्थानांतरण बफर के साथ तीन फिल्टर पेपर ब्लॉक भिगोएं। मेथनॉल में पॉलीविनाइलडिडेन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली को 30 सेकंड के लिए भिगोएं और एक अर्धशुष्क जेल हस्तांतरण उपकरण (फिल्टर पेपर की दो परतें, पीवीडीएफ झिल्ली, वैद्युतकणसंचलन जेल, और फिल्टर पेपर की एक परत) के साथ स्थानांतरित करें। 23 मिनट के लिए झिल्ली को स्थानांतरित करने के लिए 23 वी के वोल्टेज का उपयोग करें।
    10. पीवीडीएफ झिल्ली को हटा दें और स्थानांतरण के बाद ट्राइस-बफर्ड सेलाइन-ट्वीन 20 (टीबीएसटी) से एक बार धो लें।
    11. पीवीडीएफ झिल्ली को सीलिंग समाधान (5% स्किम्ड मिल्क पाउडर समाधान) में रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सील करें।
    12. पीवीडीएफ झिल्ली को हटा दें और टीबीएसटी या प्रत्येक 10 मिनट के साथ तीन बार धो लें।
    13. प्राथमिक एंटीबॉडी (सकारात्मक सीरम के साथ प्रतिरक्षित चूहों से) के साथ इनक्यूबेट करें। टीबीएसटी के साथ 500 गुना (100 गुना) परीक्षण किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी11 ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें। अवरुद्ध पीवीडीएफ झिल्ली को प्राथमिक एंटीबॉडी में रखें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    14. पीवीडीएफ झिल्ली को हटा दें और 10 मिनट के लिए टीबीएसटी के साथ तीन बार धो लें।
    15. द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)। क्षारीय फॉस्फेट (एपी) -लेबल बकरी एंटी-माउस द्वितीयक एंटीबॉडी को टीबीएसटी के साथ 5,000 गुना पतला करें। द्वितीयक एंटीबॉडी में पीवीडीएफ झिल्ली रखें और 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    16. पीवीडीएफ झिल्ली को हटा दें और प्रत्येक 10 मिनट के लिए टीबीएसटी के साथ चार बार धोएं।
    17. पीवीडीएफ झिल्ली को एपी सब्सट्रेट नाइट्रो ब्लू टेट्राज़ोल (एनबीटी) और बीसीआईपी (5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3'-इंडोलीफॉस्फेट पी-टोलुइडीन नमक) के मिश्रण (झिल्ली को भिगोने के लिए पर्याप्त) में डुबोएं। एक सकारात्मक परिणाम बैंगनी है।
      नोट: परिणाम एक स्पष्ट बैंगनी बैंड होना चाहिए, और नमूना पट्टी और एंटीजन का आणविक भार एक ही लेबल स्थिति में होना चाहिए।

4. इंट्रामस्क्युलर प्रशासन के बाद इस वैक्सीन के लिए एंटीबॉडी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन।

नोट: एक प्रकाशित रिपोर्ट11 के बाद चूहों को नैनोइमल्शन वैक्सीन के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा प्रतिरक्षित किया गया था। चूहों को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पीबीएस प्रशासित किया गया था। तीन टीकाकरण पूरा होने के 1 सप्ताह बाद, चूहों से सीरम एकत्र किया गया था। आईजीजी के सीरम स्तर और आईजीजी 1, आईजीजी 2 ए और आईजीजी 2 बी के उपवर्गों को मात्रात्मक रूप से एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा निर्धारित किया गया था।

  1. एंटीजन कोटिंग: कोटिंग समाधान के साथ 10 μg / mL में HI प्रोटीन एंटीजन पतला करें और 100 μL / अच्छी तरह से एलिसा प्लेट में जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: कोटिंग समाधान 1 लीटर विआयनीकृत पानी में 1.6 ग्राम निर्जल सोडियम कार्बोनेट और 2.9 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट को घोलकर तैयार किया जाता है।
  2. सीलिंग: प्लेट को धो लें (तीन चक्र, प्रत्येक चक्र 300 μL)। प्रत्येक कुएं में सीलिंग समाधान के 300 μL जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए कुओं को सील करें।
    नोट: पीबीएस में ट्वीन -20 और गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) जोड़कर सीलिंग समाधान तैयार किया जाता है। पीबीएसटी समाधान में बीएसए की सामग्री 1% है।
  3. सीरम कमजोर पड़ना: चूहों के नमूना सीरम को पीबीएसटी के साथ 100 बार पतला करें (सीरम के 3 μL लें और इसे PBST और भंवर के 297 μL में जोड़ें), और प्रत्येक सीरम नमूने के लिए 100 μL का उपयोग करें। सकारात्मक सीरम और नकारात्मक नियंत्रण सीरम को पीबीएसटी के साथ 100 बार पतला करें, 4 μL से 396 μL PBST जोड़ें, फिर भंवर द्वारा मिश्रण करें।
  4. डबल अनुपात कमजोर पड़ना: लेपित एलिसा प्लेट की पहली पंक्ति में उपरोक्त पतला प्रयोगात्मक सीरम के 200 μL जोड़ें, और पहली और 12वीं पंक्तियों को छोड़कर सभी कुओं में PBST के 100 μL जोड़ें। पहली पंक्ति से क्रमिक रूप से 1: 2 कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें: पिपेट को 100 μL में समायोजित करें, पहली पंक्ति से दूसरी पंक्ति में 100 μL स्थानांतरित करें, और पिपेट के साथ 10 बार मिलाएं।
  5. सीरम को कई अनुपातों में पंक्ति 11 में पतला करें और 100 μL तरल को छोड़ दें।
  6. नमूना टेम्पलेट के अनुसार पंक्ति 12 में संबंधित कुओं में पतला नकारात्मक और सकारात्मक सीरम जोड़ें (तालिका 1)-100 μL/well देखें।
  7. एलिसा प्लेटों को प्लास्टिक की चादर के साथ सील करें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. 1: 10,000 पर पीबीएसटी के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी एंटी-माउस आईजीजी-एचआरपी ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें।
  9. प्लेट धो लें (तीन चक्र, प्रत्येक चक्र 300 μL)। फिर, प्रत्येक कुएं में पतला द्वितीयक एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें, और प्लेट को 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. धुंधला और समाप्ति: प्लेट को धो लें (पांच चक्र, प्रत्येक चक्र 300 μL)। प्रत्येक कुएं में 3,3',5,5'-टेट्रामिथाइलबेंज़िडीन (टीएमबी) धुंधला समाधान (100 μL; सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। प्लेटों को प्रकाश से 10 मिनट दूर 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और फिर 2 एम एच2एसओ4 के 50 μL के साथ प्रतिक्रिया को तुरंत समाप्त करें।
  11. एंजाइम मार्कर द्वारा ऑप्टिकल घनत्व (ओडी 450) मान का पता लगाएं (समाप्ति के बाद 15 मिनट के भीतर ओडी450 मान पढ़ें)।

5. नोवेल एडजुवेंट वैक्सीन के इनविवो प्रभावों का मूल्यांकन।

नोट: इस नैनोइमल्शन वैक्सीन के सुरक्षात्मक प्रभाव का मूल्यांकन व्यावसायिक रूप से प्राप्त घातक MRSA252 माउस मॉडल में किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। हमारे शोध समूह 14 के पिछले परिणामों के अनुसार, 1 x10 8 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (सीएफयू)/माउस MRSA252 जीवाणु संक्रमण के घातक मॉडल के सुरक्षात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए सबसे अच्छी खुराक है।

  1. तनाव वसूली: जमे हुए MRSA252 की एक ट्यूब प्राप्त करें, म्यूलर हिंटन (एमएच) (ए) प्लेटों ( सामग्री की तालिका देखें) पर बैक्टीरिया को "तीन-लाइन विधि" द्वारा टीका लगाएं, और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर करें। नीचे उल्लिखित "तीन-पंक्ति विधि" के चरणों का पालन करें:
    1. दाहिने हाथ में टीकाकरण की अंगूठी पकड़कर, बैक्टीरिया तरल की अंगूठी प्राप्त करने के लिए इसे ठंडा और ठंडा करें।
    2. अल्कोहल लैंप की लौ के सामने बाएं क्षेत्र के ऊपर बाएं हाथ में (मेज पर ढक्कन रखते हुए) अगर प्लेट को पकड़ें ताकि प्लेट लौ का सामना करे, जिससे बैक्टीरिया हवा में प्रवेश न कर सकें। दाहिने हाथ से, संक्रमित बैक्टीरिया के टीकाकरण रिंग को एक घने लेकिन गैर-अतिव्यापी तरीके से आगर की सतह पर आगे और पीछे ले जाएं, जो पूरी प्लेट के लगभग 1/5-1/6 के क्षेत्र को कवर करता है, जो पहला क्षेत्र है।
      नोट: टीकाकरण रिंग और आगर 30 ° -40 ° कोण पर कोमल संपर्क में होना चाहिए; कलाई बल के साथ फिसलकर आगर को नुकसान पहुंचाने से बचा जा सकता है।
    3. टीकाकरण रिंग पर अतिरिक्त बैक्टीरिया को काटें (प्रत्येक क्षेत्र को काटना या निष्फल करना नमूना में बैक्टीरिया की मात्रा पर निर्भर करता है)। ठंडा होने के बाद, अंत में अंतिम पंक्तियों 2-3 को दोहराएं और एक दूसरा क्षेत्र (प्लेट क्षेत्र का लगभग 1/4) खींचें।
    4. दूसरा ज़ोन समाप्त होने के बाद, रिंग को ठंडा करें, और पूरी प्लेट को भरने के लिए तीसरे ज़ोन को उसी तरह खींचें।
    5. रेखाएं खींचने के बाद, प्लेट को पकवान के ढक्कन पर रखें, प्लेट को चिह्नित करें, और अगर सतह पर कॉलोनियों के वितरण का निरीक्षण करने के लिए 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। इस बात पर ध्यान दें कि क्या एक एकल कॉलोनी अलग-थलग है, और कॉलोनी विशेषताओं (जैसे आकार, आकार, पारदर्शिता और रंजकता) का निरीक्षण करें।
  2. बैक्टीरियल सक्रियण: अगले दिन, दो 50 एमएल शेकर फ्लास्क लें और प्रत्येक में 20 एमएल एमएच (बी) माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। 10 μL पिपेट टिप के साथ दो एकल कॉलोनियों को चुनें और उन्हें शेकर्स में जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम पर रात भर कॉलोनियों को इनक्यूबेट करें।
  3. द्वितीयक सक्रियण: अगले दिन, दो 50 एमएल शेकर फ्लास्क लें, जिनमें से प्रत्येक में एमएच (बी) माध्यम के 20 एमएल हों। पहले सक्रिय बैक्टीरिया वाले शेकर से 200 μL जीवाणु समाधान निकालें, 20 mL MH (B) माध्यम वाले दो नए फ्लास्क में जोड़ें, और 5 घंटे के लिए 37 °C और 220 rpm पर इनक्यूबेट करें।
  4. दूसरे सक्रिय जीवाणु समाधान को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें, 20 मिनट के लिए 3,000 एक्स जी पर अलग करें, और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  5. 40 मिलीलीटर खारा में अवक्षेपित बैक्टीरिया को पुन: निलंबित करें।
  6. जीवाणु समाधान के ओडी600 मान को मापें और खारा के साथ 1 पर समायोजित करें। इस समय, हमारे प्रयोग में MRSA252 की जीवाणु मात्रा 2 x 109 सीएफयू / एमएल थी।
  7. बैक्टीरियल घोल को 1 के ओडी600 के साथ 1 x 109 सीएफयू / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।
  8. यादृच्छिक रूप से 48 बाल्ब / सी चूहों को चार समूहों (एन = 12) में विभाजित करें।
    नोट: समूह I: पीबीएस समूह; समूह II: बीएनई नियंत्रण समूह; समूह III: भोले एंटीजन [प्रोटीन] समूह; समूह IV: नैनोइमल्शन सहायक टीका समूह।
  9. 1% पेंटोबार्बिटल सोडियम के 100 मिलीग्राम / किग्रा के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
  10. पूंछ की नस के वासोडिलेशन का कारण बनने के लिए लगभग 1 मिनट के लिए एक अवरक्त फिजियोथेरेपी लैंप ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ चूहों को विकिरणित करें।
  11. पूंछ की नस में पतला जीवाणु समाधान (चरण 5.7) के इंजेक्शन के साथ चूहों को चुनौती दें, प्रति माउस 100 μL।
  12. चूहों को अवरक्त फिजियोथेरेपी लैंप के नीचे रखें जब तक कि वे सामान्य गतिविधि में वापस नहीं आ सकते।
  13. 10 दिनों के लिए हर 12 घंटे में चूहों के अस्तित्व का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें।
  14. 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल के 100 मिलीग्राम / किलोग्राम के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा हमले से बचने वाले चूहों को इच्छामृत्यु दें।

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Representative Results

नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन तैयार करने के प्रोटोकॉल और इस वैक्सीन के इन विट्रो और विवो परीक्षणों का मूल्यांकन किया गया था। इस नमूने की सतह पर जेटा क्षमता और कण आकार की महत्वपूर्ण विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए टीईएम, एएफएम और डीएलएस का उपयोग किया गया था (चित्रा 1)। एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉटिंग से पता चला कि सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद अवक्षेप और सतह पर तैरनेवाले में एंटीजन की मात्रा में काफी गिरावट नहीं आई, जिससे संकेत मिलता है कि टीका संरचनात्मक रूप से बरकरार, विशिष्ट और इम्युनोजेनिक था (चित्रा 2)। नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन ने कुल आईजीजी, आईजीजी 1 और आईजीजी 2 ए एंटीबॉडी टिटर्स में काफी वृद्धि की। वैक्सीन की इम्युनोजेनेसिटी में काफी सुधार हुआ (चित्रा 3 ए-सी)। एंटीजन समूह के 450 एनएम पर सीरम आईजीजी 2 बी ओडी मान उच्चतम थे (1: 500 पीबीएस पर पतला) (चित्रा 3 डी)। घातक MRSA252 माउस मॉडल ने सबसे सीधे प्रतिबिंबित किया कि नैनोइमल्शन सहायक वैक्सीन ने एक अच्छा सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाया और MRSA252 के साथ जीवाणु संक्रमण को प्रभावी ढंग से रोक दिया, जिससे संक्रमित चूहों की जीवित रहने की दर में सुधार हुआ (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्र 1: नोवेल नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन की भौतिक विशेषताएं । (ए) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। (बी) परमाणु बल माइक्रोस्कोपी माइक्रोग्राफ। (सी) आकार, व्यास और वितरण। (डी) जेटा क्षमता और वितरण। यह आंकड़ा सन, एच डब्ल्यू एट अल इंटरनेशनल जर्नल ऑफ नैनोमेडिसिन से पुन: प्रस्तुत किया गया है। 10, 7275-7290 (2015)11. मूल रूप से डोव मेडिकल प्रेस लिमिटेड से अनुमति के साथ प्रकाशित और उपयोग किया जाता है, कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: नोवेल नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन की भौतिक स्थिरता । (ए) एंटीजेनिक प्रोटीन की संरचनात्मक अखंडता। (बी) एंटीजन प्रोटीन की संरचनात्मक विशिष्टता। लेन 3: रिक्त नैनोइमल्शन-उपचारित सुपरनैटेंट; लेन 4: रिक्त नैनोइमल्शन उपचार अवक्षेप; लेन 5: पूर्वनिर्मित मार्कर; लेन 6: वैक्सीन सुपरनैटेंट; लेन 7: वैक्सीन अवक्षेप; लेन 8: वैक्सीन उपचार सुपरनैटेंट; लेन 9: वैक्सीन उपचार अवक्षेप; लेन 10: देशी प्रोटीन एजेंट; (ए) और (बी) मिश्रित शब्द। स्पष्ट रूप से परिभाषित प्रोटीन चैनल काले वर्गों द्वारा चिह्नित हैं। काले तीर एंटीजेनिक प्रोटीन का संकेत देते हैं। यह आंकड़ा सन, एच डब्ल्यू एट अल इंटरनेशनल जर्नल ऑफ नैनोमेडिसिन से पुन: प्रस्तुत किया गया है। 10, 7275-7290 (2015)11. मूल रूप से डोव मेडिकल प्रेस लिमिटेड से अनुमति के साथ प्रकाशित और उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन के साथ इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बाद आईजीजी और इसके उपसमूह एंटीबॉडी स्तर । (ए) आईजीजी टिटर्स का लॉग2 मान। (बी) सीरम आईजीजी 1 का 450 एनएम ऑप्टिकल घनत्व। (सी) सीरम आईजीजी 2 ए का 450 एनएम ऑप्टिकल घनत्व। (डी) सीरम आईजीजी 2 बी का 450 एनएम ऑप्टिकल घनत्व। यह आंकड़ा सन, एच डब्ल्यू एट अल इंटरनेशनल जर्नल ऑफ नैनोमेडिसिन से पुन: प्रस्तुत किया गया है। 10, 7275-7290 (2015)11. मूल रूप से डोव मेडिकल प्रेस लिमिटेड से अनुमति के साथ प्रकाशित और उपयोग किया जाता है, कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: MRSA252 जीवाणु संक्रमण के घातक मॉडल में सुरक्षात्मक प्रभाव। प्रणालीगत एमआरएसए संक्रमण के जवाब में चूहों का उत्तरजीविता अनुपात। यह आंकड़ा सन, एच डब्ल्यू एट अल इंटरनेशनल जर्नल ऑफ नैनोमेडिसिन से पुन: प्रस्तुत किया गया है। 10, 7275-7290 (2015)11. मूल रूप से डोव मेडिकल प्रेस लिमिटेड से अनुमति के साथ प्रकाशित और उपयोग किया जाता है, कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आईएसडीबी, एक जीवाणु कोशिका भित्ति-लंगर और लौह-विनियमित सतह प्रोटीन, हीम आयरन15 प्राप्त करने की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एचएलए, अल्फा विष, एमआरएसए में ज्ञात सबसे प्रभावी जीवाणु विषाक्त पदार्थों में से एक है, और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में छिद्र बना सकता है और आसंजन और उपकला कोशिकाओंमें हस्तक्षेप कर सकता है। हमारे अध्ययन में, एक नया पुनर्संयोजन एमआरएसए एंटीजन प्रोटीन (एचआई) का निर्माण किया गया था और आईएसडीबी और एचएलए के एंटीजन जीन के आधार पर जीन इंजीनियरिंग तकनीक के साथ व्यक्त किया गया था। फिर, कम ऊर्जा पायसीकरण विधि द्वारा एक नैनोइमल्शन वैक्सीन विकसित किया गया था, और इस वैक्सीन की स्थिरता और प्रभावशीलता का मूल्यांकन किया गया था। उदाहरण के लिए, कुछ विशेषताएं, जैसे कि विवो में दीर्घकालिक स्थिरता, संरचना, आकार, अवशोषण और प्रभाव, इमल्शन ड्रॉपलेट7 के आकार से बहुत प्रभावित होते हैं। परिणामों से पता चला कि कण आकार विवो में नैनोइमल्शन के परिवहन और एंटीजन-प्रेजेंटिंगकोशिकाओं द्वारा उनके फागोसाइटोसिस को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण कारक था। साइटोफागोसाइटोसिस के बारे में, 1 μm से छोटे नैनोकणों को डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) और मैक्रोफेज द्वारा अधिक आसानी से फागोसाइटोसिस किया जाता है और प्रणालीगत प्रतिरक्षाको उत्तेजित करने की सबसे अधिक संभावना होती है।

कण परिवहन के संबंध में, 100 एनएम से छोटे नैनोकणों को प्रतिरक्षा प्रभाव को बढ़ाने के लिए लसीका वाहिकाओं के माध्यम से प्रेषित होने की अधिक संभावना है; हालांकि, छोटे नैनोकण रक्त वाहिकाओं में घुसपैठ करते हैं, जबकि बड़े नैनोकण लसीका वाहिकाओं में अपनी परिवहन गति को धीमा कर देतेहैं। इस प्रकार, इष्टतम कण आकार 20-50 एनएम की सीमा में है। इसलिए, आकार, आकार और ज़ेटा क्षमता सहित नैनोकणों की भौतिक विशेषताओं का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। टीईएम, अपनी उच्च परिशुद्धता के साथ, नैनोइमल्शन सहायक टीकों के गुणों को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण और बुनियादी उपकरण बन गया है। इसके अतिरिक्त, प्रौद्योगिकी कई वर्षों से कई क्षेत्रों में व्यापक रूप से लागू की गई है। नैनोइमल्शन वैक्सीन13 का मूल्यांकन करने के लिए 3 डी और नैनोस्केल उच्च-रिज़ॉल्यूशन जानकारी के साथ एक और नैनोमैकेनिकल लक्षण वर्णन उपकरण, एएफएम का भी उपयोग किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, डीएलएस, जो एक साथ आकार और चार्ज20 दोनों का खुलासा करता है, प्रमुख जानकारी प्रदान कर सकता है, जैसे कि समाधान में नैनोइमल्शन वैक्सीन कणों की एकत्रीकरण स्थिति। साहित्य के अनुसार, कोलाइडल निलंबन की भौतिक और रासायनिक स्थिरता के लिए एक उच्च जीटा संभावित मूल्य अपरिहार्य है, क्योंकि एक बड़ा प्रतिकारक बल अक्सर आसन्न नैनोकणों के साथ कभी-कभी टकराव के कारण एकत्रीकरण को रोकता है। इसलिए, हमारे शोध में, हमने इन योजनाओं को स्थापित किया और टीईएम, एएफएम और डीएलएस के साथ उनके भौतिक और रासायनिक गुणों का मूल्यांकन किया।

प्रोटीन टीके प्रमुखसंक्रामक रोगों की रोकथाम और उपचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हाल के वर्षों में प्रोटीन टीके तेजी से विकसित हुए हैं, लेकिन प्रतिरक्षा प्रभावकारिता और दृढ़ता में गंभीर चुनौतियां बनी हुई हैं। इसके मूलभूत कारण खराब प्रोटीन स्थिरता, छोटे वितरण गुणांक, एंटीजन के छोटे जैविक अर्ध-जीवन और विवो22 में उच्च निकासी दर हैं। इस प्रोटोकॉल में, नोवेल नैनोइमल्शन वैक्सीन की स्थिरता का मूल्यांकन किया गया था, और एसडीएस-पेज या वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा कोई एंटीजन गिरावट नहीं देखी गई थी।

एक सुरक्षित, प्रभावी और विपणन योग्य प्रोटीन वैक्सीन को एक उपयुक्त प्रतिरक्षा सहायक के साथ पूरक किया जाना चाहिए ताकि प्रोटीन एंटीजन की इम्युनोजेनेसिटी और इष्टतम वैक्सीन प्रतिरक्षा सुरक्षा प्राप्त करने के लिए सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाके प्रकार को बढ़ाया जा सके। प्रोटीन वैक्सीन द्वारा उत्तेजित एंटीबॉडी स्तर संक्रमण की प्रभावी रोकथाम और उपचार के लिए महत्वपूर्ण संकेतकों में से एक है, और एंटीबॉडी टिटर यह मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण सूचकांक है कि क्या नोवेल नैनोइमल्शन सहायक नग्न एंटीजन की इम्युनोजेनेसिटी में सुधार कर सकता है। नोवेल इम्यून एडजुवेंट शरीर को ह्यूमोरल और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के स्तर को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रूप से उत्तेजित कर सकते हैं, और टीकों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा सुरक्षात्मक प्रभावकारिता के प्रकार को समृद्ध करना एक महत्वपूर्ण विकास दिशा और भविष्य के अनुसंधान औरनए टीकों के विकास का घटक है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, नोवेल नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन के साथ माउस सीरम-विशिष्ट आईजीजी, आईजीजी 1, आईजीजी 2 ए और आईजीजी 2 बी के एंटीबॉडी टिटर्स का पता लगाया गया था। घातक माउस मॉडल24 टीकों के मूल्यांकन के लिए स्वर्ण मानक है, और हमारे प्रोटोकॉल में, सुरक्षात्मक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक घातक MRSA252 माउस मॉडल का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला है कि नोवेल नैनोइमल्शन एडजुवेंट वैक्सीन ने एमआरएसए से संक्रमित बाल्ब/सी चूहों की जीवित रहने की दर में प्रभावी ढंग से सुधार किया है।

यह प्रोटोकॉल नैनोइमल्शन टीकों के स्थिरता मूल्यांकन में पर्याप्त नहीं है। सर्कुलर डाइक्रोइजम एक उपयुक्त विधि है यदि इसे एक सरल और तेज विधि में वैक्सीन प्रोटीन की स्थानिक संरचना का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है। यद्यपि हमले द्वारा परीक्षण किए गए चूहों की जीवित रहने की दर विवो परीक्षण और वैक्सीन की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए स्वर्ण मानक है, लेकिन यह अधिक विश्वसनीय होगा यदि हमले के बाद चूहों के अंगों के जीवाणु उपनिवेशीकरण की मात्रा को मापा जा सकता है। इसलिए, नैनोइमल्शन सहायक वैक्सीन की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल में अभी भी कुछ कमियां हैं, और उपरोक्त प्रयोग को मूल्यांकन के लिए बाद के प्रासंगिक प्रयोगों में पूरक करने की आवश्यकता है।

अंत में, भौतिक गुणों, स्थिरता, विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और चुनौती संरक्षण के मूल्यांकन की एक श्रृंखला स्थापित करना आवश्यक है। इन योजनाओं को पूरा करने से नोवेल नैनोइमल्शन एडजुवेंट टीकों के अनुप्रयोग और विकास के लिए महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक बुनियादी बातें उपलब्ध होंगी।

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Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास इस काम में हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम के नंबर 2021 वाईएफसी 2302603, एनएसएफसी के नंबर 32070924 और 32000651 और चोंगकिंग के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन प्रोजेक्ट प्रोग्राम के नंबर 2019 jcyja-msxmx0159 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 Eppendorf, Germany  5424000495
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
AFM Dimension FastScan BRUKER, Germany  null
Alcohol lamp Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China YBS-AA-11408
Balb/c mice  Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP/NBT Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA null
BL21 Competent Cell Merck millipore,Germany 70232-3CN
BSA-100G Sigma-Aldrich, USA B2064-100G
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solution MIKX,China DB236
Decolorization solution BOSTER,China AR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China null
Electrophoresis apparatus Beijing Liuyi Instrument Factory, China DYCZ-25D
Gel image Tanon, USA null
Glutathione-Sepharose Resin GST Mei5bio,China affinity chromatography resin
H2SO4 Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China 7664-93-9
HI recombinant protein Third Military Medical University,China 110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgG Biodragon, China BF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1 Biodragon, China BF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2a Biodragon, China BF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2b Biodragon, China BF03004R
Inoculation loop Haimen Feiyue Co.,LTD,China YR-JZH-1UL
IsdB and Hla clones Shanghai Jereh Biotechnology Co,China null
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) SEPPIC, France null
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside fdbio,China FD3278-1
LB bouillon culture-medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-136
Lnfrared physiotherapy lamp Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China 7600
Low temperature refrigerated centrifuge Eppendorf, Germany  null
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK null
MH(A) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-051
MH(B) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-052
Micro plate washing machine 405 LSRS Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USA null
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China 1658030
MMC packing TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD 0022818
MRSA252 USA, ATCC null
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo Scientific, USA null
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit DAKEWE, China 8012011
PBS biosharp, China null
PCR, Amplifier Thermal Cycler, USA null
pGEX-target gene recombinant plasmid Shanghai Jereh Biotechnology Co,China B3528G
Phosphotungstic acid G-CLONE, China CS1231-25g
pipette Eppendorf, Germany  3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) Aladdin, China K400327-1kg
Primary antibody Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera null See Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) Sigma-Aldrich, USA P4347-500ML
Protein Marker Thermo Scientufuc, USA 26616
PVDF TRANSFER MEMBRANE Invitrogen,USA 88518
Scanning Electron Microscope JEOL,Japan JSM-IT800
Sodium pentobarbital Merck,Germany Tc-P8411
Talos L120C TEM Thermo Fisher, USA null
TMB color solution TIAN GEN, China PA107-01
Turtle kits Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD ES80545
Tween-20 Macklin, China 9005-64-5

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इस महीने JoVE में अंक 199
मेथिसिलिन प्रतिरोधी <em>स्टेफिलोकोकस ऑरियस</em> (एमआरएसए) संक्रमण के खिलाफ एक नैनोइमल्शन सहायक वैक्सीन की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन
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Zeng, X., Sun, H., Ye, Y., Luo, X.,… More

Zeng, X., Sun, H., Ye, Y., Luo, X., Cai, D., Yang, Y., Chen, T., Sun, C., Zhang, S., Zeng, H. Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection. J. Vis. Exp. (199), e65152, doi:10.3791/65152 (2023).

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