Summary
본 프로토콜은 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성, 면역 반응 및 생체 내 보호 효과를 준비하고 평가합니다.
Abstract
나노 에멀젼 보조 백신은 작은 입자 크기, 높은 열 안정성 및 유효한 면역 반응을 유도하는 능력으로 인해 광범위한 관심을 끌었습니다. 그러나 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응을 평가하기 위한 일련의 포괄적인 프로토콜을 수립하는 것이 중요합니다. 따라서 이 기사에서는 백신의 물리화학적 특성(투과전자현미경[TEM], 원자력현미경[AFM] 및 동적 광산란[DLS]), 백신 항원 및 시스템의 안정성(고속 원심분리기 테스트, 열역학적 안정성 테스트, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯) 및 특정 면역 반응(IgG1, IgG2a 및 IgG2b). 이 접근법을 사용하여 연구자들은 치명적인 MRSA252 마우스 모델에서 새로운 나노 에멀젼 보조 백신의 보호 효과를 정확하게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 효과적인 보조제 잠재력 측면에서 가장 유망한 나노에멀젼 백신 보조제를 확인할 수 있습니다. 또한 이 방법은 향후 개발을 위해 새로운 백신을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
메티실린 내성 황색포도 상구균 (MRSA)은 전 세계 중환자실(ICU) 병동1, 심장내과 및 화상 부서에서 감염률이 가장 높은 기회 병원체 중 하나입니다. MRSA는 높은 감염률, 사망률 및 광범위한 약물 내성을 나타내어 임상 치료에 큰 어려움을 나타냅니다2. 2017년 세계보건기구(WHO)가 발표한 항생제 내성 박테리아의 글로벌 우선순위 목록에서 MRSA는 가장 중요한 범주3에 포함되었습니다. 따라서 MRSA 감염에 대한 백신이 시급히 필요합니다.
알루미늄 보조제는 오랫동안 사용되어 왔으며 보조제 보조 메커니즘은 비교적 명확하고 안전하며 효과적이며 내약성이 우수합니다4. 알루미늄 보조제는 현재 널리 사용되는 보조제 유형입니다. 일반적으로 알루미늄염 입자에 흡착된 항원은 안정성을 향상시키고 주사 부위의 항원 흡수 능력을 향상시켜 우수한 흡수와 느린 방출을 제공할 수 있다고 믿어진다5. 현재, 알루미늄 보조제의 주요 단점은 일부 백신 후보 항원에 대해 보조제 효과가 없거나 약한 보조제 효과만을 나타낸다는 것이다6. 또한, 알루미늄 보조제는 IgE 매개 과민 반응을 유도한다5. 따라서 더 강한 면역 반응을 자극하기 위해 새로운 보조제를 개발할 필요가 있습니다.
나노에멀젼 보조제는 오일, 물, 계면활성제 및 공계면활성제로 구성된 콜로이드 분산 시스템이다7. 또한, 보조제는 열역학적으로 안정하고 등방성이며, 고속 원심분리에 의해 오토클레이브 또는 안정화될 수 있고, 온화한 제조 조건 하에서 자발적으로 형성될 수 있다. 여러 에멀젼 보조제(예: MF59, NB001-002 시리즈, AS01-04 시리즈 등)가 현재 시판 중이거나 임상 연구 단계에 있지만 입자 크기는 160nm8보다 큽니다. 따라서 나노 스케일 (1-100 nm) 의약품의 장점 (즉, 큰 비 표면적, 작은 입자 크기, 표면 효과, 높은 표면 에너지, 작은 크기 효과 및 매크로 양자 터널링 효과)을 완전히 활용할 수 없습니다. 본 프로토콜에서, 직경 크기가 1-100 nm인 나노에멀젼 기술에 기초한 신규한 보조제는 양호한 보조제 활성을 나타내는 것으로 보고되었다9. 재조합 서브유닛 백신 항원 단백질 HI (α-hemolysin 돌연변이체[Hla] 및 Fe 이온 표면 결정 인자 B[IsdB] 서브유닛 N2 활성 단편 융합 단백질)를 시험하였다. 마우스 전신 감염 모델을 사용하여 물리적 특성과 안정성을 검사하고, 근육 투여 후 특정 항체 반응을 평가하고, 백신의 보호 효과를 테스트하기 위한 일련의 절차가 수립되었습니다.
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Protocol
동물실험은 실험동물의 사용과 관리에 관한 매뉴얼에 의거하여 실시하였으며, 제3군의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았다. 6-8주령의 암컷 Balb/c 마우스를 본 연구에 사용했습니다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료 표 참조).
1. MRSA HI 항원 단백질의 제조
- 상업적 소스에서 IsdB 및 Hla 클론을 얻고(재료 표 참조), 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭을 수행하여 IsdB 및 Hla 유전자를 증폭하고, 해당 제품을 PGEX-6P-2 플라스미드에 결찰합니다(상업적으로 얻음, 재료 표 참조). 대장균10의 벡터 Xl/blue 균주로 스크리닝합니다.
- 양성 클론을 대장균 BL21 적격 세포로 형질전환하고( 재료 표 참조) 상어 배양으로 증폭한다10.
- 이소프로필-β-D-1-메르캅토갈락토피라노사이드 및 다중 모드 크로마토그래피(MMC) 분리 키트11로 유도 후 항원을 발현하고 분리합니다( 재료 표 참조).
- 항원 단백질을 특성화하고 완전 자동화 정제기11로 정제합니다.
- 상업적으로 이용 가능한 친화성 크로마토그래피 수지를 사용하여 제거된 용해물에서 gutathione S-transferase(GST) 태그 단백질을 친화성 정제합니다( 재료 표 참조).
- 재조합 단백질을 MMC11로 정제한다.
- Triton X-114 상분리법11에 의해 내독소를 제거한다. 간략하게, 1% 트리톤 X-114를 0°C에서 5분 동안 재조합 단백질 용출액과 혼합하여 균질한 용액을 확보하고, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션하여 2개의 상이 형성되도록 합니다.
- 거북이 키트와 함께 박테리아 내 독소 테스트 방법11을 사용하여 내 독소 농도를 검출하십시오. 단백질 항원에 대한 내독소는 0.06 EU/μg으로 국제 표준(1.5 EU/μg)보다 낮습니다10.
- 간섭 테스트를 수행하여 테스트 제품이 내독소 검출에 미칠 수 있는 영향을 제거합니다11.
참고: 중국 약전 2020의 부록12에 따르면 내독소 함량은 5EU/용량 미만이어야 합니다. 리물루스 용해물의 민감도(λ0.25 EU/mL)와 최대 유효 희석 비율 33.3은 MVD = cL/λ를 기준으로12 로 계산되었으며, 여기서 L은 시험체에 대한 박테리아 내독소의 한계값, c는 시험체 용액의 농도, L이 EU/m으로 표시될 때 c는 1.0mg/mL와 같습니다. λ는 겔 방법에서 투구게 시약의 표지 민감도(EU/mL)입니다.
- 간섭 테스트를 수행하여 테스트 제품이 내독소 검출에 미칠 수 있는 영향을 제거합니다11.
- 항원(48kDa, 12% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동[SDS-PAGE]로 측정)을 내독소 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 없는 멸균수에서 1.5mg/mL로 재결합합니다(디클로린산나트륨 방법)11.
참고: 단백질 피크 시간은 13.843분, 순도는 99.4%(고성능 액체 크로마토그래피법), 단백질은 -70°C에서10분 보관하였다. S. 아우레우스 균주 MRSA252로부터 추출한 게놈 DNA ( 재료 표 참조)를 PCR 주형으로 사용하였다. IsdB 유전자는 정방향 프라이머 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG를 사용하여 증폭되었습니다
C-39 및 역방향 프라이머 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39입니다. 정 방향 프라이머 PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) 및 역방향 프라이머 PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC)입니다.
2. 나노에멀젼 백신의 제조
- 1:6:3(w/w)의 질량비에 따라 HI 항원 단백질 용액(10mg/mL)에 3가지 부형제(이소프로필 미리스테이트, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 프로필렌 글리콜, 재료 표 참조)를 순서대로 넣고 잘 저어줍니다. 그런 다음 점차적으로 멸균된 순수를 10mL의 최종 부피에 도달하도록 추가하고 500rpm 및 25°C에서 약 20분 동안 교반합니다.
참고: 이 프로토콜에서 제조된 나노에멀젼의 부피는 10mL이고 세 가지 부형제의 질량은 각각 0.34g, 2g 및 1g입니다. 여기서 단백질 용액은 최종 용액 농도의 10 배인 작업 용액입니다. - 나노 에멀젼 보조제 백신 (1 mg / mL 단백질)을 저에너지 유화 방법13 에 의해 준비하여 투명하고 투명한 액체 용액을 얻는다.
참고 : 블랭크 나노 에멀젼 (BNE)은 물이 HI로 대체 된 것을 제외하고는 유사한 방법으로 제조되었습니다. 일반적인 유화 방법은 유화를 위해 외부 및 내부 상을 약 80°C로 가열한 다음 서서히 교반 및 냉각하는 것입니다. 이 과정에서 많은 양의 에너지가 소비되고 최종적으로 에멀젼이 얻어집니다.
3. 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성 및 안정성
- 입자 크기, 제타 전위 및 폴리머 분산 지수 특성화(PDI).
- 나노에멀젼 보조제 백신 100μL를 준비하고 주사용수로 50배 희석한다. 검출을 위해 2mL의 샘플을 추가합니다.
- Nano Zetasizer(ZS, 재료 표 참조)를 사용하여 25°C에서 입자 크기, 제타 전위 및 PDI를 관찰합니다.
- 투과 전자 현미경 (TEM)
- 나노 에멀젼 백신 10 μL를 물로 50 배 희석하고, 탄소 코팅 된 100 메쉬 구리 그리드에 놓고, 실온에서 5 분 동안 1 % 포스 포 텅스텐 산 ( 재료 표 참조)으로 염색한다.
- 여과지로 과도한 인산 텅스텐 산 용액을 제거하십시오.
- 투과 전자 현미경으로 형태를 관찰하십시오 ( 재료 표 참조). 완제품이 전자 현미경의 시야 내에서 거의 안정적이고 원형인지, 그리고 분산이 양호한지 여부를 검사합니다.
- 주사전자현미경(SEM)
- 나노 에멀젼 보조제 백신 10 μL를 물로 50 배 희석하고, 희석 된 샘플 10 μL을 실리콘 웨이퍼에 떨어 뜨린 후, 37 °C 온도 조절기 제어 인큐베이터에 24 시간 동안 둔다.
- 준비된 백금을 실리콘에 40 초 동안 분무하고 실온으로 식힌다.
- 준비된 샘플의 형태학적 특성을 고해상도 주사전자현미경으로 관찰합니다( 재료 표 참조). 샘플이 거의 안정적이고 구형이며 전자 현미경으로 시야 내에 잘 분산되어 있는지 확인합니다.
- 형태학적 안정성
- 나노에멀젼 백신 시료 1mL를 미세원심분리관에 넣고, 실온(25°)에서 13,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 신선한 시료의 안정성을 평가하였다.
- 이 신선한 샘플의 외관을 관찰한 다음 6개의 온도 사이클(1주기: 4°C에서 48시간, 25°C에서 48시간, 37°C에서 48시간 동안 보관)의 열역학적 안정성 테스트를 수행합니다.
- 원심분리 후 샘플을 15분 동안 방치하여 Tyndall 효과가 있는지 여부(샘플이 빛 아래에서 투명하고 투명한지 여부) 및 탈유화가 발생했는지 여부(탈유화 후 명확한 층화로 표시)를 결정합니다.
- SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯
- 샘플을 흔들고, 0.6 mL의 무수 에탄올 용액과 0.3 mL의 백신을 섞고, 원심분리(13,000 x g, 실온, 25°C에서 30분)한다.
- 용액의 상청액을 깨끗한 튜브로 옮기고 침전물을 0.3mL의 물로 용해시킵니다. 무수 에탄올 및 증류수 용액으로 처리한 후 상청액 및 침전 용액(빈 나노에멀젼 및 백신 모두)을 얻고 동일한 50배 희석을 수행합니다.
- 분리 겔 A 2.5mL와 분리 겔 B 2.5mL를 혼합하고( 재료 표 참조), 10% 과황산암모늄 50μL를 첨가한 후 피펫으로 유리판에 용액을 빠르게 넣습니다. 농축 겔 A 1mL와 농축 겔 B 1mL를 혼합하고 10% 과황산암모늄 20μL를 유리판에 넣고 적절한 크기의 빗을 넣고 응고를 기다립니다.
- 3.5.2단계에서 얻은 희석된 샘플에 총 5μL의 5x 단백질 로딩 완충액을 추가하고 샘플을 5분 동안 끓입니다.
- 가열된 단백질 10μL를 해당 웰에 추가하고 단백질 마커 5μL를 마커 웰에 추가합니다.
- 전극을 연결하고 전기영동계를 켜고( 재료 표 참조) 전압을 300V로 조정합니다. 전기영동이 PAGE 고무 바닥에서 1cm 떨어진 곳에 도달하면 전원을 끕니다.
- 겔을 제거하고, ddH2O로 헹구고, 쿠마시 브라이트 블루 G-250 염색 용액( 재료 표 참조)을 10분 동안 첨가한다. 염색 용액을 붓고 ddH2O로 겔을 두 번 헹굽니다.
- 시중에서 판매되는 탈색 용액을 넣고 젤을 전자레인지에 1분 동안 돌립니다. 젤을 10분 동안 흔들고 젤 배경이 선명해질 때까지 탈색 용액을 반복적으로 교체합니다. 그런 다음 겔 이미징을 수행합니다( 재료 표 참조).
참고: 웨스턴 블롯은 3.5.1-3.5.6 단계에 설명된 대로 전처리되었습니다. - 3개의 여과지 블록을 전기영동 전달 완충액에 담급니다. 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인을 메탄올에 30초 동안 담그고 반건조 겔 전사 기기(여과지 2층, PVDF 멤브레인, 전기영동 젤 및 여과지 1층)로 옮깁니다. 23V의 전압을 사용하여 23분 동안 멤브레인을 이송합니다.
- PVDF 멤브레인을 제거하고 이송 후 트리스 완충 식염수-트윈 20(TBST)으로 한 번 세척합니다.
- PVDF 멤브레인을 밀봉 용액(5% 탈지 분유 용액)에 넣고 4°C에서 밤새 밀봉합니다.
- PVDF 멤브레인을 제거하고 TBST로 세 번 또는 각각 10분 동안 세척합니다.
- 1 차 항체 (양성 혈청으로 면역화 된 마우스에서)와 함께 배양하십시오. 시험될 1차 항체 11 ( 재료 표 참조)을 TBST로 500배(100배) 희석한다. 차단된 PVDF 멤브레인을 1차 항체에 넣고 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다.
- PVDF 멤브레인을 제거하고 TBST로 각각 10분 동안 세 번 세척합니다.
- 2차 항체와 함께 배양합니다( 재료 표 참조). 알칼리성 포스파타제(AP) 표지 염소 항마우스 2차 항체를 TBST로 5,000배 희석합니다. PVDF 멤브레인을 2차 항체에 넣고 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
- PVDF 멤브레인을 제거하고 TBST로 각각 10분 동안 4회 세척합니다.
- 염색을 위해 AP 기질 니트로 블루 테트라졸(NBT)과 BCIP(5-브로모-4-클로로-3'-인돌리포스페이트 파라톨루이딘 염)의 혼합물(멤브레인을 담글 수 있을 만큼만)에 PVDF 멤브레인을 담그십시오( 재료 표 참조). 긍정적 인 결과는 보라색입니다.
참고: 결과는 투명한 보라색 띠여야 하며 샘플 스트립과 항원의 분자량은 동일한 라벨이 붙은 위치에 있어야 합니다.
4. 근육내 투여 후 이 백신에 대한 항체 면역 반응 평가
참고: 마우스는 발표된 보고서11에 따라 나노에멀젼 백신의 근육내 주사에 의해 면역화되었다. 마우스에 음성 대조군으로 PBS를 투여하였다. 3회 면역화가 완료된 후 1주일째에, 마우스로부터 혈청을 채취하였다11. IgG의 혈청 수준 및 IgG1, IgG2a 및 IgG2b의 서브클래스는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 정량적으로 결정되었습니다.
- 항원 코팅: 코팅 용액으로 HI 단백질 항원을 10μg/mL로 희석하고 100μL/웰로 ELISA 플레이트에 추가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
참고: 코팅 용액은 무수 탄산나트륨 1.6g과 탄산수소나트륨 2.9g을 탈이온수 1L에 용해시켜 제조합니다. - 밀봉: 플레이트를 세척합니다(3 사이클, 각 사이클 300 μL). 밀봉 용액 300 μL를 각 웰에 첨가하고, 웰을 37°C에서 2시간 동안 밀봉한다.
참고: 밀봉 용액은 PBS에 Tween-20과 소 혈청 알부민(BSA)을 첨가하여 준비합니다. PBST 용액의 BSA 함량은 1%입니다. - 혈청 희석: 시료를 PBST로 100배 희석하고(혈청 3μL를 취하여 PBST 및 볼텍스 297μL에 첨가) 각 혈청 시료에 100μL를 사용합니다. PBST 396μL에 4μL를 첨가하여 양성 혈청과 음성 대조군 혈청을 PBST로 100배 희석한 후 vortexing하여 혼합한다.
- 이중 비율 희석: 코팅된 ELISA 플레이트의 첫 번째 행에 위의 희석된 실험 혈청 200μL를 추가하고 첫 번째 및 12번째 행을 제외한 모든 웰에 PBST 100μL를 추가합니다. 첫 번째 줄부터 연속적으로 1:2 희석 수행: 피펫을 100μL로 조정하고 첫 번째 줄에서 두 번째 줄로 100μL를 옮기고 피펫과 10회 혼합합니다.
- 혈청을 여러 비율로 11행에 희석하고 100μL의 액체를 버립니다.
- 희석된 음성 및 양성 혈청을 s에 따라 행 12의 해당 웰에 추가합니다.ample 템플릿( 표 1 참조)-100μL/well.
- ELISA 플레이트를 플라스틱 랩으로 밀봉하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 2차 항체 항-마우스 IgG-HRP( 재료 표 참조)를 PBST로 1:10,000으로 희석합니다.
- 플레이트를 세척한다 (3 사이클, 각 사이클 300 μL). 그런 다음 희석된 2차 항체 100μL를 각 웰에 추가하고 플레이트를 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
- 염색 및 종결: 플레이트를 세척한다 (5 사이클, 각 사이클 300 μL). 3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘(TMB) 염색 용액(100μL, 재료 표 참조)을 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 빛으로부터 10분 동안 37°C에 두고, 50 μL의 2MH2SO4로 즉시 반응을 종결시킨다.
- 효소 마커로 광학 밀도(OD450) 값을 감지합니다(종료 후 15분 이내에OD450 값 판독).
5. 신규 면역보조백신의 생체내 효과 평가
참고: 이 나노에멀젼 백신의 보호 효과는 상업적으로 입수한 치명적인 MRSA252 마우스 모델에서 평가되었습니다( 재료 표 참조). 우리 연구 그룹 14의 이전 결과에 따르면, 1 x10 8 집락 형성 단위(CFU)/마우스는 MRSA252 박테리아 감염의 치명적인 모델의 보호 효과를 평가하는 데 가장 적합한 용량입니다.
- 균주 회수: 냉동 MRSA252의 튜브를 얻고, 박테리아를 Mueller Hinton (MH) (A) 플레이트 (표 참조)에 " 3-라인 방법"에 의해 접종하고, 37°C에서 밤새 배양한다. 아래에 언급 된대로 "3 줄 방법"의 단계를 수행하십시오.
- 접종 링을 오른손에 들고 소작하고 식혀 박테리아 액체 링을 얻습니다.
- 알코올 램프의 불꽃 왼쪽 앞 영역 위에 왼손으로 한천 플레이트를 잡고(테이블 뚜껑을 유지) 플레이트가 불꽃을 향하도록 하여 박테리아가 공기 중으로 들어가는 것을 방지합니다. 오른손으로 감염된 박테리아의 접종 링을 한천 표면에서 조밀하지만 겹치지 않는 방식으로 앞뒤로 움직여 첫 번째 영역인 전체 플레이트의 약 1/5-1/6 영역을 덮습니다.
알림: 접종 링과 한천은 30°-40° 각도로 부드럽게 접촉해야 합니다. 한천 손상은 손목 힘으로 미끄러지면 피할 수 있습니다. - 접종 링의 초과 박테리아를 소작합니다(각 부위를 소작하거나 살균할지 여부는 표본의 박테리아 양에 따라 다름). 냉각 후 끝에서 두 번째 행 2-3을 반복하고 두 번째 영역(플레이트 영역의 약 1/4)을 그립니다.
- 두 번째 영역이 끝나면 링을 소작하고 세 번째 영역을 같은 방법으로 그려 전체 플레이트를 채 웁니다.
- 선을 그린 후 접시를 접시 뚜껑에 놓고 접시에 표시하고 37°C 인큐베이터에서 18-24시간 동안 배양하여 한천 표면의 콜로니 분포를 관찰합니다. 단일 군체가 분리되어 있는지 여부에 주의를 집중하고 군체 특성(예: 크기, 모양, 투명도 및 색소 침착)을 관찰합니다.
- 박테리아 활성화: 다음날 50mL 셰이커 플라스크 2개를 가져다가 각각에 20mL의 MH(B) 배지( 재료 표 참조)를 추가합니다. 10 μL 피펫 팁이 있는 두 개의 단일 콜로니를 선택하여 셰이커에 추가합니다. 콜로니를 37°C에서 220rpm으로 밤새 배양합니다.
- 2차 활성화: 다음날 각각 20mL의 MH(B) 배지가 들어 있는 2개의 50mL 셰이커 플라스크를 취합니다. 첫 번째 활성화 박테리아가 들어 있는 셰이커에서 박테리아 용액 200μL를 제거하고, 20mL의 MH(B) 배지가 들어 있는 두 개의 새 플라스크에 넣고, 37°C 및 220rpm에서 5시간 동안 배양합니다.
- 두 번째 활성화된 박테리아 용액을 50mL 원심분리기 튜브에 모으고 3,000 x g 에서 20분 동안 분리한 다음 상층액을 버립니다.
- 침전된 박테리아를 식염수 40mL에 재현탁합니다.
- 박테리아 용액의 OD600 값을 측정하고 식염수로 1로 조정합니다. 이때 실험에서 MRSA252의 박테리아 양은 2 x 109 CFU/mL였습니다.
- 박테리아 용액을 1의 OD600 으로 1 x 109 CFU/mL의 농도로 희석합니다.
- 48마리의 Balb/c 마우스를 무작위로 4개의 그룹(n=12)으로 나눕니다.
참고: 그룹 I: PBS 그룹; 그룹 II: BNE 대조군; 그룹 III: 나이브 항원[단백질] 그룹; 그룹 IV: 나노에멀젼 보조제 백신 그룹. - 1% 펜토바르비탈 나트륨 100mg/kg을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다.
- 마우스에 적외선 물리 치료 램프( 재료 표 참조)를 약 1분 동안 조사하여 꼬리 정맥의 혈관 확장을 유발합니다.
- 희석된 박테리아 용액(단계 5.7)을 마우스 당 100 μL씩 꼬리 정맥에 주입하여 마우스에 챌린지합니다.
- 마우스를 적외선 물리 치료 램프 아래에 놓고 정상적인 활동으로 돌아갈 수 있습니다.
- 10 일 동안 12 시간마다 마우스의 생존을 관찰하고 기록합니다.
- 공격에서 살아남은 마우스를 1% 펜토바르비탈 나트륨 100mg/kg을 복강내 주사하여 안락사시킵니다.
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Representative Results
나노에멀젼 아쥬반트 백신을 제조하기 위한 프로토콜과 이 백신의 시험관내 및 생체내 시험이 평가되었다. TEM, AFM 및 DLS를 사용하여 이 샘플 표면의 제타 전위 및 입자 크기의 중요한 특성을 확인했습니다(그림 1). SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅은 침전물 및 상청액 내의 항원의 양이 원심분리 후에도 유의하게 분해되지 않았음을 보여주었으며, 이는 백신이 구조적으로 손상되지 않고 특이적이며 면역원성임을 나타냅니다(그림 2). 나노에멀젼 보조제 백신은 총 IgG, IgG1 및 IgG 2a 항체 역가를 유의하게 증가시켰다. 백신의 면역원성은 상당히 개선되었다(도 3A-C). 항원 그룹의 450 nm에서 혈청 IgG2b OD 값이 가장 높았다 (1:500 PBS에서 희석) (도 3D). 치명적인 MRSA252 마우스 모델은 나노 에멀젼 보조 백신이 우수한 보호 효과를 보였고 MRSA252에 의한 박테리아 감염을 효과적으로 억제하여 감염된 마우스의 생존율을 향상 시켰음을 가장 직접적으로 반영했습니다 (그림 4).
그림 1: 새로운 나노에멀젼 아쥬반트 백신의 물리적 특성 . (A) 투과 전자 현미경 사진. (B) 원자력 현미경 현미경 사진. (C) 크기, 직경 및 분포. (D) 제타 전위 및 분포. 이 그림은 Sun, HW et al. International Journal of Nanomedicine에서 재현 한 것입니다. 10, 7275-7290 (2015)11. 원래 출판되었으며 Dove Medical Press Ltd.의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 안정성 . (A) 항원 단백질의 구조적 완전성. (B) 항원 단백질의 구조적 특이성. 레인 3: 빈 나노에멀젼 처리된 상층액; 레인 4: 빈 나노에멀젼 처리 침전물; 레인 5: 미리 염색된 마커; 레인 6: 백신 상청액; 레인 7: 백신 침전물; 레인 8: 백신 치료 상청액; 레인 9: 백신 치료 침전물; 레인 10: 천연 단백질 제제; (A) 및 (B) 혼합 용어. 명확하게 정의된 단백질 채널은 검은색 사각형으로 표시됩니다. 검은색 화살표는 항원 단백질을 나타냅니다. 이 그림은 Sun, HW et al. International Journal of Nanomedicine에서 재현 한 것입니다. 10, 7275-7290 (2015)11. 원래 출판되었으며 Dove Medical Press Ltd.Sun et al.의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 나노 에멀젼 보조제 백신으로 근육 주사 후 IgG 및 그 하위 그룹 항체 수준. (A) IgG 역가의2 값을 기록합니다. (B) 혈청 IgG1의 450nm 광학 밀도. (C) 혈청 IgG2a의 450nm 광학 밀도. (D) 혈청 IgG2b의 450nm 광학 밀도. 이 그림은 Sun, HW et al. International Journal of Nanomedicine에서 재현 한 것입니다. 10, 7275-7290 (2015)11. 원래 출판되었으며 Dove Medical Press Ltd.의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MRSA252 박테리아 감염의 치명적인 모델에서의 보호 효과. 전신 MRSA 감염에 대한 마우스의 생존율. 이 그림은 Sun, HW et al. International Journal of Nanomedicine에서 재현 한 것입니다. 10, 7275-7290 (2015)11. 원래 출판되었으며 Dove Medical Press Ltd.의 허가를 받아 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: ELISA 스파이크 시퀀스 및 희석 템플릿. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
박테리아 세포벽 고정 및 철 조절 표면 단백질인 IsdB는 헴철15를 얻는 과정에서 중요한 역할을 합니다. 알파 독소인 HLA는 MRSA에서 알려진 가장 효과적인 박테리아 독소 중 하나이며, 진핵 세포에 기공을 형성하고 부착 및 상피 세포를 방해할 수 있다16. 본 연구에서는 IsdB와 Hla의 항원 유전자를 기반으로 한 유전자 공학 기술로 새로운 재조합 MRSA 항원 단백질(HI)을 구성하고 발현했습니다. 이어서, 저에너지 유화법에 의해 나노에멀젼 백신을 개발하고, 이 백신의 안정성 및 유효성을 평가하였다. 예를 들어, 생체 내에서의 장기 안정성, 구조, 형상, 흡수 및 효과와 같은 일부 특성은 에멀젼 액적(7)의 크기에 의해 크게 영향을 받는다. 결과는 입자 크기가 생체 내에서 나노에멀젼의 수송과 항원 제시 세포에 의한 식균 작용에 영향을 미치는 중요한 요소임을 보여주었다17. 세포탐식작용과 관련하여, 1μm보다 작은 나노입자는 수지상 세포(DC)와 대식세포에 의해 더 쉽게 식균되며, 전신 면역을 자극할 가능성이 가장 높다18.
입자 수송과 관련하여 100nm보다 작은 나노 입자는 면역 효과를 향상시키기 위해 림프관을 통해 투과될 가능성이 더 큽니다. 그러나, 작은 나노입자는 혈관 내로 침투하는 반면, 큰 나노입자는 림프관에서 수송 속도를 늦춘다19. 따라서, 최적의 입자 크기는 20-50 nm의 범위이다. 따라서 모양, 크기 및 제타 전위를 포함한 나노 입자의 물리적 특성을 연구하는 것이 중요합니다. TEM은 높은 정밀도로 나노 에멀젼 보조 백신의 특성을 이해하는 데 중요하고 기본적인 도구가되었습니다. 또한 이 기술은 수년 동안 많은 분야에서 널리 적용되었습니다. 3D 및 나노 스케일 고해상도 정보를 가진 또 다른 나노 기계적 특성화 도구 인 AFM도 나노 에멀젼 백신13을 평가하는 데 사용되었습니다. 중요한 것은 크기와 전하(20)를 동시에 나타내는 DLS가 용액 내 나노에멀젼 백신 입자의 응집 상태와 같은 주요 정보를 제공할 수 있다는 것입니다. 문헌에 따르면, 큰 반발력은 종종 인접한 나노 입자와의 간헐적 충돌로 인한 응집을 방지하기 때문에 콜로이드 현탁액의 물리적 및 화학적 안정성에 높은 제타 전위 값이 필수적입니다. 따라서 본 연구에서는 이러한 계획을 수립하고 TEM, AFM 및 DLS로 물리적, 화학적 특성을 평가했습니다.
단백질 백신은 주요 감염병의 예방과 치료에 중요한 역할을 한다21. 단백질 백신은 최근 몇 년 동안 빠르게 발전했지만 면역 효능과 지속성에 심각한 문제가 남아 있습니다. 이에 대한 근본적인 이유는 단백질 안정성이 낮고, 분포 계수가 작으며, 항원의 생물학적 반감기가 짧고, 생체 내 제거율이 높기 때문입니다 22. 이 프로토콜에서는 신규한 나노에멀젼 백신의 안정성을 평가하였고, SDS-PAGE 또는 웨스턴 블롯에 의해 항원 분해가 관찰되지 않았다.
안전하고 효과적이며 시장성이 있는 단백질 백신은 단백질 항원의 면역원성과 보호 면역 반응의 유형을 현저하게 향상시키기 위해 적절한 면역 보조제로 보충되어야 하며, 최적의 백신 면역 보호를 얻기 위해20 . 단백질 백신에 의해 자극되는 항체 수준은 감염의 효과적인 예방 및 치료를 위한 중요한 지표 중 하나이며, 항체 역가는 새로운 나노에멀젼 보조제가 네이키드 항원의 면역원성을 향상시킬 수 있는지 여부를 평가하는 중요한 지표입니다. 신규한 면역보조제는 체액성 및 세포성 면역반응 수준을 향상시키기 위해 신체를 크게 자극할 수 있으며, 백신의 면역반응과 면역보호효능의 유형을 풍부하게 하는 것은 중요한 개발 방향이며 향후 연구 및 신규한 백신 개발의 구성 요소이다23. 따라서, 이 프로토콜에서, 새로운 나노에멀젼 보조제 백신을 사용한 마우스 혈청 특이적 IgG, IgG1, IgG2a 및 IgG2b의 항체 역가가 검출되었다. 치명적인 마우스 모델24 는 백신을 평가하기 위한 황금 표준이며, 우리의 프로토콜에서는 보호 효과를 평가하기 위해 치명적인 MRSA252 마우스 모델을 사용했습니다. 그 결과 새로운 나노 에멀젼 보조 백신이 MRSA에 감염된 Balb / c 마우스의 생존율을 효과적으로 향상 시켰습니다.
이 프로토콜은 나노 에멀젼 백신의 안정성 평가에서 충분하지 않습니다. 순환 이색성은 백신 단백질의 공간 구조를 간단하고 빠른 방법으로 검출하는 데 적용할 수 있는 경우에 적합한 방법입니다. 공격에 의해 테스트 된 마우스의 생존율은 생체 내 테스트 및 백신의 효과를 평가하기위한 황금 표준이지만, 공격 후 마우스의 장기의 박테리아 식민지화의 양을 측정 할 수 있다면 더 설득력이 있습니다. 따라서, 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응을 평가하기 위한 본 프로토콜에는 여전히 몇 가지 단점이 있으며, 위의 실험은 평가를 위한 후속 관련 실험에서 보완될 필요가 있다.
결론적으로, 물리적 특성, 안정성, 특정 면역 반응 및 챌린지 보호에 대한 일련의 평가를 수립 할 필요가있다. 이러한 계획을 완료하면 새로운 나노 에멀젼 보조 백신의 적용 및 개발을위한 중요한 실험 기초가 제공 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 이 작업에 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 No. 2021YFC2302603, NSFC No. 32070924 및 32000651, 충칭 자연 과학 재단 프로젝트 프로그램의 No. 2019jcyjA-msxmx0159의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
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