분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구
Summary
신화는 모델 유기체 Saccharomyces cerevisiae의 표현 단백질 사이의 과도 안정적인 상호 작용의 민감한 감지 수 있습니다. 그것은 성공적으로 높은 처리량 방법으로 상호 작용하는 파트너를 식별하기 위해 외인성 및 효모 필수 막 단백질 연구에 적용되었습니다.
Abstract
통합 멤브레인 단백질의 기본적인 생물 학적 및 임상 중요성은 전체 길이 transmembrane 단백질에 대한 단백질 – 단백질 상호 작용 (PPI)의 높은 처리량을 확인을위한 효모 기반 시스템의 개발을하라는 메시지가 나타납니다. 이를 위해 우리 실험실 분할 – ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템을 개발했습니다. 이 기술을 사용 일시적 안정 단백질 상호 작용의 민감한 검출을 허용<em> Saccharomyces cerevisiae</em> 호스트 유기체로. 신화는 ubiquitin 두 안정 moieties로 분리될 수있는 관찰의 활용 (효모의 C – 터미널의 절반은 ubiquitin C<sub> UB</sub>)과 ubiquitin 잔기의 N – 터미널 절반 (N<sub> UB</sub>). 신화에서는,이 원리는 단백질 – 단백질 상호 작용의 '센서'로 사용하기 위해 적응합니다. 간단히, 통합 멤브레인 미끼 단백질은 C로 융합이다<sub> UB</sub> 어떤은 인공 전사 인자로 연결되어 있습니다. 먹이의 단백질은 개인 또는 라이브러리 형식 중, N으로 놓았을 거예요<sub> UB</sub> 잔기. 미끼와 먹이 사이의 단백질 상호 작용은 전체 길이 '의사 ubiquitin'분자를 형성, ubiquitin moieties의 reconstitution로 연결됩니다. 이 분자는 전사 인자와 리포터 유전자 표현의 후속 유도의 절단의 결과로, cytosolic deubiquitinating 효소에 의해 인식 차례입니다. 이 시스템은 매우 적응력이 있으며, 특히 높은 처리량 검사에 적합합니다. 이것은 성공적으로 효모 및 기타 미생물 모두에서 필수적인 멤브레인 단백질을 사용하여 상호 작용을 조사하기 위해 고용되었다.
Protocol
Discussion
신화는 전체 길이 막 단백질과 cytosolic 또는 멤브레인 – 바운드 파트너 간의 상호 작용의 신분을 허용 최초의 높은 처리량 시스템입니다. 그것은 생물 [3-7]의 범위에서 막 단백질을 연구하는 데 사용되었습니다. 단백질의 – 관심이 신화에서 공부 의무가되도록하기 위해 시시콜콜 따지는해야 할 수 있습니다 구체적인 내용은, 그러나,있다.
대부분의 멤브레인 – 바운드 단백질은…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 원고의 중요한 읽기위한 돈 에드먼즈 감사하고 싶습니다. Stagljar 연구소는 혁신 (CFI), 보건 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소, 심장 및 뇌졸중 재단, 캐나다 암 협회와 노바티스에 대한 캐나다 재단의 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
References
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