Сплит-Убиквитин основе дрожжей Мембрана два-Hybrid (МИФ) Система: Мощный инструмент для выявления белок-белковых взаимодействий
Summary
Миф позволяет чувствительны обнаружения переходных и стабильного взаимодействия между белками, которые выражаются в модели CEREVISIAE организме Saccharomyces. Она была успешно применена для изучения экзогенных и дрожжи интегральные мембранные белки с целью выявления их взаимодействия партнеров в высоком образом пропускную способность.
Abstract
Фундаментальные биологические и клинические важность интегральные мембранные белки стимулировали развитие дрожжей-системы для высокой пропускной способности идентификации белок-белковых взаимодействий (PPI) за полнометражный белками трансмембранного. С этой целью в нашей лаборатории разработаны сплит-убиквитин основан дрожжей Мембрана два-Hybrid (МИФ) системы. Эта технология позволяет чувствительны обнаружения переходных и стабильных белковых взаимодействий использованием<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em> Как организма-хозяина. Миф использует наблюдение, что убиквитин могут быть разделены на два устойчивых фрагментов: С-концевой половине дрожжей убиквитин (C<sub> Иь</sub>) И N-концевую часть убиквитин фрагмент (N<sub> Иь</sub>). В МИФ, этот принцип адаптирован для использования в качестве "датчика" белок-белковых взаимодействий. Короче говоря, интегральный белок мембраны приманка сливается с C<sub> Иь</sub>, Которая связана с искусственным фактором транскрипции. Prey белки, либо в формате индивидуальных или библиотеку, слиты в N<sub> Иь</sub> Части. Белки взаимодействия между приманкой и добычу приводит к изменению состава убиквитин фрагменты, образуя полнометражных "псевдо-убиквитин" молекулы. Эта молекула в свою очередь, признаются цитозольного deubiquitinating ферментов, в результате расщепления фактора транскрипции и последующей индукции репортер экспрессии генов. Система легко адаптируется, и особенно хорошо подходит для высокопроизводительного скрининга. Он был успешно применен для исследования взаимодействий с помощью интегральных мембранных белков с обеих дрожжей и других организмов.
Protocol
Discussion
Миф первый высокой пропускной способности системы, что позволяет идентифицировать взаимодействие между полнометражный мембранных белков и цитозольного или мембраной партнеров. Он был использован для изучения мембранных белков из различных организмов [3-7]. Есть, однако, конкретные де…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Рассвет Эдмондс для критического прочтения этой статьи. Лаборатория Stagljar поддерживается за счет средств Канадского фонда для инноваций (CFI), Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR), сердца и инсульта фонда Канадского общества рака, и Novartis.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
References
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
