MITO permette di rilevare sensibile delle interazioni transienti e stabili tra proteine che sono espresse nel modello organismo Saccharomyces cerevisiae. E 'stato applicato con successo allo studio esogeni e lievito proteine integrali di membrana allo scopo di individuare i propri partner che interagiscono in modo elevato throughput.
L'importanza fondamentale biologici e clinici di proteine di membrana integrali portato allo sviluppo di un lievito-based per la high-throughput identificazione di interazioni proteina-proteina (PPI) per la full-length proteine transmembrana. A tal fine, il nostro laboratorio ha sviluppato il split-ubiquitina lievito base a membrana a due ibridi (MITO) del sistema. Questa tecnologia consente per la rilevazione delle interazioni proteina sensibile transitoria e stabile con<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Come un organismo ospite. MITO sfrutta l'osservazione che ubiquitina può essere separata in due frazioni stabili: il C-terminale di lievito ubiquitina (C<sub> Ub</sub>) E la N-terminale della frazione ubiquitina (N<sub> Ub</sub>). Nel mito, questo principio è adattati per essere utilizzati come un 'sensore' di interazioni proteina-proteina. In breve, l'integrale delle proteine di membrana esca è fuso C<sub> Ub</sub> Che è legata ad un fattore di trascrizione artificiale. Proteine prede, sia in formato singolo o una raccolta, si fondono alla N<sub> Ub</sub> Porzione. Interazione tra proteine l'esca e preda porta alla ricostituzione della combinazione di sostanze ubiquitina, formando un full-length 'pseudo-ubiquitina' molecola. Questa molecola è a sua volta riconosciuto da enzimi citosolici deubiquitinating, con conseguente scissione del fattore di trascrizione, ed alla susseguente induzione dell'espressione del gene giornalista. Il sistema è altamente adattabile, ed è particolarmente adatto a high-throughput screening. E 'stato impiegato con successo per studiare le interazioni con proteine integrali di membrana da entrambi i lieviti ed altri organismi.
MITO è il primo sistema ad alto rendimento che permette l'identificazione delle interazioni tra full-length proteine di membrana e citosoliche o legata alla membrana partner. E 'stato utilizzato per lo studio delle proteine di membrana di una serie di organismi [3-7]. Vi sono, tuttavia, i dettagli specifici che potrebbero dover essere esaminato per assicurare la proteina d'interesse è riconducibile a studiare con MITO.
Molte proteine di membrana sono diretti a…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Edmonds Alba per una lettura critica di questo manoscritto. Il laboratorio Stagljar è sostenuto da fondi della Fondazione canadese per l'innovazione (CFI), il Canadian Institute for Health Research (CIHR), la Fondazione cardiache e ictus, la Canadian Cancer Society, e Novartis.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
Agar | Bioshop | AGR001 | ||
Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |