Overview
כאשר מכתימים דיסקים דמיון Drosophila, לעתים קרובות ניתוח גס מבוצע שבו הדיסקים נחשפים אבל להישאר מחובר לגוף. לאחר מוכתם, הדיסקים של עניין מבודדים רכוב. פרוטוקול הדוגמה מדגים הליך עבור ניתוח דיסק דמיון כנף והרכבה.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך מורימוטו וטמורי, אינדוקציה ואבחון של גידולים באפיתליה דיסק דמיון Drosophila, J. Vis. Exp. (2017).
1. ניתוח הזחלים
- לאסוף זחלים instar השלישי נודד עם מקל עץ או מלקחיים קהים, גנוטיפ אותם על ידי סמנים פלואורסצנטיים מתאימים(למשל,EGFP) תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי ומניחים אותם בצלחת דיסקציה עם PBS (מלוחים חוצצים פוספט).
- לשטוף את הזחלים PBS על ידי pipetting עם 2 מ"ל פלסטיק העברת פיפטות.
- צבוט את מרכז הזחל במלקחיים אחד וקרע את הגופה לשניים עם המלקחיים האחרים.
- צבוט את וו הפה של החצי השני עם מלקחיים אחד ולדחוף את הפה לכיוון הגוף עם מלקחיים אחרים כדי להפוך את הגוף מבפנים החוצה.
- הסר חומרים מיותרים כגון בלוטות הרוק או גופי שומן עם מלקחיים.
2. קיבוע וכתמימת נוגדנים
- מעבירים את החצי הקדמוני המנותח של גוף הזחל (כולל דיסקי כנף דמיוניים) לצינור פלסטיק 1.5 מ"ל ולתקן 1 מ"ל של פתרון תיקון (4% פורמלדהיד ב PBS) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך עם סיבוב עדין.
אזהרה: פורמלדהיד רעיל ויש לו פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע בעור.
שים לב: בחלק זה, כל הצעדים מתרחשים על מאגף בטמפרטורת החדר בחושך, אלא אם כן צוין אחרת. - הסר את פתרון התיקון ובטל. לשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT (0.3% טריטון X-100 ב PBS) שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
- הסר את PBT ולהוסיף 1 מ"ל של PBTG (0.2% אלבומין סרום שור ו 5% סרום עזים נורמלי ב PBT) לחסימת nutate 1 שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (69 °F).
- הסר PBTG ולהוסיף פתרון נוגדנים ראשוני מדולל כראוי עם PBTG (ראה טבלה של חומרים)ואגוז לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את פתרון הנוגדנים העיקרי ולשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל PBT שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
- הסר PBT ולהוסיף פתרון נוגדנים משני מדולל כראוי עם PBTG (1:400). אגוזים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר פתרון נוגדנים משני ולשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
- כדי להכתים F-actin, להסיר PBT ולהוסיף פתרון פאלודין מדולל כראוי PBS (1:40). ואז אגוזים במשך 20 דקות. הסר את הפתרון Phalloidin ולשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
- כדי להתמודד עם DNA גרעיני, להסיר PBT ולהוסיף DAPI (4 ', 6-diamidino-2-פנילינדול) פתרון (0.5 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI ב- PBS). ואז אגוז 10 דקות.
אזהרה: ל-DAPI יש פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע בעור. - הסר פתרון DAPI ולשטוף את הרקמות עם 1 מ"ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד.
- יש לשטוף פעם ב-1 מ"ל של PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר PBS ולהוסיף 500 μL של 100 % גליצרול כאמצעי הרכבה מראש.
3. הרכבה על שקופיות מיקרוסקופ
- מניחים את הרקמות המוכתמות על שקופית מיקרוסקופ באמצעות פיפטה העברת פלסטיק 2 מ"ל.
- להעביר את הרקמות טיפות של מדיום הרכבה על שקופית מיקרוסקופ אחרת עם מלקחיים.
- החזק את הקצה של רקמה מנותחת עם מלקחיים אחד ולהרחיק דיסקים אנטנות המוח והעין עם מלקחיים אחרים.
שים לב: שמור את המוחות המנותחים כדי למקם אותם ליד דיסקי דמיון הכנף. המוחות פועלים כפלטפורמה המונעת מהכיסוי לרסק את הדיסקים הדמיוניים של הכנף. - כדי לבודד את הדיסקים דמיון הכנף להחזיק את הקצה של רקמה מנותחת עם מלקחיים אחד בעדינות לגרד את דופן הגוף לקרוע את הדיסקים עם מלקחיים אחרים.
שים לב: אם קשה למצוא דיסקים דמיוניים כנף, לקלף את קנה הנשימה מהקצה האחורי לצד הצדדי. דיסקי אגף דמיוניים נדבקים לקנה הנשימה. - מכסים בעדינות את הדיסקים הדמיוניים עם כיסוי וחותמים בלק ציפורניים; חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
