Drosophila Larva Imaginal Disc Disseksjon: En metode for å observere utvikling av Epithelia

Abstract

Kilde: Morimoto, K. og Tamori, Y. Induksjon og diagnose av svulster i Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Utt. (2017).

Ved farging av Drosophila imaginale plater utføres ofte en grov disseksjon der platene er utsatt, men forblir festet til kroppen. Når de er farget, er platene av interesse isolert og montert. Eksempelprotokollen demonstrerer en prosedyre for ving imaginal plate disseksjon og montering.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Morimoto og Tamori, induksjon og diagnose av svulster i Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017). 1. Disseksjon av larver Samle vandrende tredje instar larver med en trepinne eller stump tang, genotype dem ved passende fluorescerende markører(f.eks., EGFP) under et fluorescens stereoskopisk mikroskop og legg dem i en disseksjonsfat med PBS (fosfatbufret saltvann). Vask larvene i P…

Materials

Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap