드로소필라 애벌레 상상 디스크 해부 : 개발 상피를 관찰하는 방법

Overview

Drosophila 상상 디스크를 염색 할 때, 종종 디스크가 노출되지만 신체에 부착 된 거친 해부가 수행됩니다. 일단 염색되면 관심 디스크가 분리되고 장착됩니다. 예제 프로토콜은 날개 가상 디스크 해부 및 장착 에 대한 절차를 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 모리모토와 타모리, 드로소필라 상상 디스크 Epithelia, J. Vis. Exp. (2017)에서 종양의 유도 및 진단에서 발췌한 것입니다.

1. 애벌레의 해부

1. 나무 막대기 또는 무딘 집게와 방황 세 번째 인스타 애벌레를 수집, 적절한 형광 마커에 의해 유전자형(예를 들어,EGFP) 형광 입체 현미경에서 그들을 배치하고 PBS (인산완충식 염분)와 해부 접시에 배치합니다.
2. 2mL 플라스틱 이송 파이펫으로 파이펫을 하여 PBS에서 유충을 씻으시면 됩니다.
3. 애벌레의 중심을 한 개의 포셉으로 꼬집어 다른 집게로 몸을 반으로 찢습니다.
4. 앞쪽 의 입 후크를 한 개의 포셉으로 꼬집어 다른 집게로 입을 몸쪽으로 밀어 내몸을 안쪽으로 돌립니다.
5. 침샘이나 지방 체와 같은 불필요한 물질을 집게로 제거하십시오.

2. 고정 및 항체 염색

1. 애벌레 몸체의 해부 된 전방 절반 (상상날개 디스크 포함)을 1.5 mL 플라스틱 튜브로 옮기고 1 mL의 수정 용액 (PBS의 4 % 포름알데히드)에서 부드러운 회전으로 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 수정하십시오.
   주의: 포름알데히드는 독성이 있으며 발암 성 잠재력을 가지고 있습니다. 피부 접촉을 방지하기 위해 보호 장갑과 의류를 착용하십시오.
   참고: 이 부분에서, 모든 단계는 달리 명시하지 않는 한 어둠 속에서 실온에서 누에이터에서 일어난다.
2. 수정 솔루션을 제거하고 폐기합니다. PBT 1mL(PBS에서 0.3% 트리톤 X-100)로 티슈를 각각 15분 동안 3회 세척합니다.
3. PBT를 제거하고 실온에서 또는 4°C에서 1h를 차단하고 누테이트하기 위해 PBTG(0.2% 소 세럼 알부민 및 PBT에 5% 일반 염소 세럼)의 1mL를 추가한다.
4. PBTG를 제거하고 PBTG로 적절하게 희석된 1차 항체 용액을 추가하고(재료표참조) 4°C에서 하룻밤 사이에 누테이트한다.
5. 1차 항체 용액을 제거하고 각각 15분 동안 1mL PBT로 조직을 세 번 세척한다.
6. PBT를 제거하고 PBTG (1:400)로 적절하게 희석 된 이차 항체 용액을 추가하십시오. 실온에서 2 시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 누테이트하십시오.
7. 이차 항체 용액을 제거하고 각각 15 분 동안 PBT의 1 mL로 조직을 두 번 세척하십시오.
8. F-액틴을 더럽히려면 PBT를 제거하고 PBS(1:40)에서 적절하게 희석된 Phalloidin 용액을 추가합니다. 그런 다음 20 분 동안 누테. Phalloidin 용액을 제거하고 각각 15 분 동안 PBT의 1 mL로 조직을 두 번 세척하십시오.
9. 핵 DNA에 대응하기 위해 PBT를 제거하고 DAPI(4', 6-디아미드노-2-페닐린돌) 용액(PBS에서 DAPI의 0.5 μg/mL)을 추가합니다. 그런 다음 10 분 nutate.
   주의: DAPI는 발암 성 잠재력을 가지고 있습니다. 피부 접촉을 방지하기 위해 보호 장갑과 의류를 착용하십시오.
10. DAPI 용액을 제거하고 15 분 동안 두 번 PBT의 1 mL로 조직을 세척하십시오.
11. 실온에서 10 분 동안 PBS의 1 mL에 한 번 헹구는다.
12. PBS를 제거하고 사전 장착 매체로 100 % 글리세롤의 500 μL을 추가합니다.

3. 현미경 슬라이드에 장착

1. 2mL 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 염색된 조직을 현미경 슬라이드에 놓습니다.
2. 집게를 사용하여 다른 현미경 슬라이드에 장착 매체를 떨어뜨리도록 조직을 전송합니다.
3. 한 개의 포셉으로 해부된 조직의 끝을 누르고 다른 집게로 뇌와 눈 안테나 디스크를 당깁니다.
   참고: 해부된 뇌를 유지하여 날개 상상 디스크 근처에 놓습니다. 뇌는 커버슬립이 날개 상상 디스크를 분쇄하는 것을 막는 플랫폼 역할을 합니다.
4. 날개 상상 디스크를 분리하려면 한 개의 포셉으로 해부 된 조직의 끝을 잡고 몸 벽을 부드럽게 긁고 다른 집게로 디스크를 찢어 냅니다.
   참고: 날개 상상 디스크를 찾기 가 어렵으면 기관서를 뒤쪽에서 전방쪽으로 떼어냅니다. 날개 상상 디스크는 기관에 충실합니다.
5. 가상의 디스크를 커버 슬립으로 부드럽게 덮고 매니큐어로 밀봉하십시오. 4 °C에 보관하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap