Overview
Bij het kleuren van Drosophila imaginal schijven, vaak een ruwe dissectie wordt uitgevoerd waar de schijven worden blootgesteld, maar blijven bevestigd aan het lichaam. Eenmaal bevlekt, worden de schijven van belang geïsoleerd en gemonteerd. Het voorbeeldprotocol demonstreert een procedure voor vleugel imaginaire schijfdissectie en montage.
Protocol
Dit protocol is een fragment uit Morimoto and Tamori, Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).
1. Dissectie van larven
- Verzamel zwervende derde instarlarven met een houten stok of stompe tang, genotypeer ze door geschikte fluorescerende markers(bijv.EGFP) onder een fluorescentie stereoscopische microscoop en plaats ze in een dissectieschaal met PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing).
- Was de larven in PBS door ze te pipetten met 2 ml plastic transferpipetten.
- Knijp het midden van de larve met één tang en scheur het lichaam doormidden met de andere tang.
- Knijp de mondhaak van de voorste helft met één tang en duw de mond naar het lichaam met de andere tang om het lichaam binnenstebuiten te keren.
- Verwijder onnodige materialen zoals speekselklieren of vetlichamen met een tang.
2. Fixatie en antilichaamkleuring
- Breng de ontleedde voorste helft van het larvale lichaam (inclusief fantasievleugelschijven) over in een plastic buis van 1,5 ml en bevestig deze gedurende 10 minuten in 1 ml Fix-oplossing (4% Formaldehyde in PBS) bij kamertemperatuur in het donker met zachte rotatie.
LET OP: Formaldehyde is giftig en heeft een kankerverwekkend potentieel. Draag beschermende handschoenen en kleding om huidcontact te voorkomen.
OPMERKING: In dit deel vinden alle stappen plaats op een nutator bij kamertemperatuur in het donker, tenzij anders vermeld. - Verwijder de Fix-oplossing en gooi deze weg. Was de weefsels met 1 ml PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) driemaal gedurende elk 15 minuten.
- Verwijder de PBT en voeg 1 ml PBTG (0,2% runderserumalbumine en 5% normaal geitenserum in PBT) toe voor het blokkeren en noteren van 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
- Verwijder PBTG en voeg primaire antilichaamoplossing toe die op de juiste manier is verdund met PBTG (zie tabel met materialen)en noteer 's nachts bij 4 °C.
- Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de weefsels met 1 ml PBT driemaal gedurende elk 15 minuten.
- Verwijder PBT en voeg secundaire antilichaamoplossing toe die op de juiste manier is verdund met PBTG (1:400). Nutate gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
- Verwijder secundaire antilichaamoplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende elk 15 minuten.
- Om F-actine te bevlekken, verwijdert u PBT en voegt u Phalloidine-oplossing toe die op de juiste manier is verdund in PBS (1:40). Dan nutate gedurende 20 min. Verwijder de Phalloidin-oplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende elk 15 minuten.
- Om nucleair DNA tegen te gaan, verwijdert u PBT en voegt u DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindole) oplossing (0,5 μg/ml DAPI in PBS) toe. Dan nutate 10 min.
LET OP: DAPI heeft een kankerverwekkend potentieel. Draag beschermende handschoenen en kleding om huidcontact te voorkomen. - Verwijder de DAPI-oplossing en was de weefsels met 1 ml PBT twee keer gedurende elk 15 minuten.
- Spoel eenmaal in 1 ml PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
- Verwijder PBS en voeg 500 μL 100 % glycerol toe als voormontagemedium.
3. Montage op microscoopdia's
- Plaats de bevlekte weefsels op een microscoopschuif met behulp van een plastic transferpipet van 2 ml.
- Breng de weefsels over op druppels montagemedium op een andere microscoopschuif met een tang.
- Houd het uiteinde van ontleed weefsel vast met één tang en trek hersen- en oogantenneschijven weg met de andere tang.
OPMERKING: Houd de ontleedde hersenen om ze in de buurt van de vleugel fantasieschijven te plaatsen. De hersenen fungeren als een platform dat voorkomt dat de coverslip de fantasieschijven van de vleugel verplettert. - Om de vleugel fantasieschijven te isoleren, houdt u het uiteinde van ontleed weefsel vast met één tang en krabt u voorzichtig aan de lichaamswand en scheurt u de schijven af met de andere tang.
OPMERKING: Als het moeilijk is om vleugel imaginele schijven te vinden, pelt u de luchtpijp van de achterste naar de voorste kant. Vleugel fantasieschijven plakken aan de luchtpijp. - Bedek de fantasieschijven voorzichtig met een coverslip en sluit af met nagellak; bewaren bij 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
normal goat serum | Sigma | G6767 | |
mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
Fly strains | |||
sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |